Preparacin de filtros de membrana para Microscopa Electrnica de Transmisin

Inga Caqui, Marvyn William

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA Facultad de Ciencias, Laboratorio de Microscopia

E-mail: marvyn_16@hotmail.com

Resumen
En el presente informe, describimos el mtodo de preparacin de filtros de membranas sobre las cuales depositaremos partculas y/o fibras para su posterior visualizacin con un TEM. La preparacin comprende de la formacin de una membrana de un lquido de secado rpido (parlodion) sobre un portaobjetos de vidrio y su posterior desprendimiento cuando se sumerge en agua. A continuacin, sobre la membrana desprendida, se coloca las rejillas portamuestras, escogiendo las zonas ms ptimas, finalmente se quita la membrana del agua con la ayuda de un pedazo de parafilm y se hace secar. PALABRAS CLAVES: Filtros de membranas, TEM, rejillas portamuestras.

Abstract
In this report, we describe the method of preparation of membrane filters on which particles and/or fibers will deposit for subsequent visualization with a TEM. The preparation comprises the formation of a membrane of a quick drying liquid (parlodion) on a glass slide and subsequent detachment when immersed in water. Then, upon the membrane detached, is placed the specimen grids, choosing the most optimal zones, finally removes the membrane of water with the aid of a piece of parafilm and drying. KEY WORDS: membrane filters, TEM, specimen grids.

I. Introduccin
El mtodo ms convencional de preparacin de muestras TEM, es usando filtros de membranas los cuales permiten depositar partculas y/o fibras para una posterior visualizacin. Es en particular ste mtodo el que nos interesa para este laboratorio, y el que a continuacin pasaremos a detallar.

muy delgada. La unidad de medida de las rejillas es el mesh, lo cual equivale a:

Por lo general se usan rejillas que estn entre 100 a 300mesh. Pipeta Pasteur. Es una pipeta de plstico no calibrada pero si graduada que se utiliza apretando la boquilla de arriba e introduciendo en la probeta, para poder sacar el lquido. Cpsula Petri. La placa de Petri, o cpsula de Petri, es un recipiente redondo, de cristal o plstico, con una cubierta de la misma forma que la placa, pero algo ms grande de dimetro, para que se pueda colocar encima y cerrar el recipiente, aunque no de forma hermtica. Es parte de la coleccin conocida como material de vidrio. Papel filtro para anlisis cualitativo. Este filtro de celulosa se utiliza en las tcnicas de anlisis cualitativo para determinar e identificar los materiales. Un filtro con capacidad de carga muy alta para la filtracin rpida de medio a gruesos precipitados. Ofrece alta absorbencia y resistencia en hmedo incrementada.

II. Desarrollo Experimental

A. Materiales:
Parlodion altamente purificado. El parlodion es un polmero a base de celulosa, insoluble en el agua e inflamable, este ser el componente principal para la elaboracin de la membrana. Parafilm en lmina. Parafilm es una pelcula semitransparente, autosellante, moldeable, flexible, impermeable, inflamable, de un grosor aproximado de 127m. En microscopa electrnica se le utiliza para tomar rejillas flotantes y pelculas a partir de superficies lquidas. Rejilla portamuestra de cobre para microscopa electrnica. El portamuestra, para el TEM, es una pequea rejilla de cobre en forma de disco de aproximadamente 3mm de dimetro y

FIG.N3. Proceso de separacin de la membrana

del portaobjetos.

FIG.N1. Materiales para la preparacin de filtros

de membrana.

Bistur para microscopa electrnica. Pinza fina y pinza mediana para microscopa electrnica. Una fuente de luz blanca y potente. Papel filtro para anlisis cualitativo. Agua destilada.

B. Preparacin de membranas Lo primero que debemos hacer es conseguir un lugar apropiado para preparar nuestras muestras, un lugar que en lo posible est libre de polvo y bien iluminado.

Se enjuaga una cpsula Petri con agua destilada y se le llena de este lquido hasta aproximadamente el 90% de su capacidad. Se coloca la caja bajo la luz blanca y a una distancia tal que se pueda observar el reflejo de la fuente luminosa en la superficie del agua; este procedimiento es de ayuda para distinguir la membrana del portaobjeto. Se diluye parlodion en tiner (podra ser tambin en acetona). Esta ser nuestra base para la membrana. Con ayuda de una pipeta pasteur se coge un poco de parlodio diluido y se coloca tres gotas sobre una de las esquinas de un portaobjeto nuevo, en esta parte trataremos de manipular los portaobjetos con cuidado, tratando de no hacer contacto la parte central del portaobjetos con nuestras manos. Para formar la membrana se coloca el segundo portaobjeto sobre la primera y se presiona de modo que el lquido cubra la mayor cantidad de rea posible (mtodo de squash). Luego se desliza el segundo portaobjeto sobre la primera hasta que el lquido haya baado toda su superficie. El parlodion diluido se encuentra ahora como una fina pelcula sobre una de las caras del primer portaobjeto (FIG. N2).

FIG.N2. Mtodo de squash.

FIG.N4. Membrana flotante luego de dejar el

portaobjetos.

FIG.N8. Lmina de parafilm sobre la membrana

que contiene las rejillas de cobre.

FIG.N5. Rejillas portamuestras de cobre.

Tenemos que buscar que la membrana de parlodion tenga los colores de interferencia, no tiene que ser transparente pues indicara que es muy delgada, ni tampoco blanquecina pues indicara que es muy gruesa, esto lo hicimos con la ayuda de la fuente de luz. Luego de unos 3 minutos, la capa de parlodion ha secado. A fin de facilitar la extraccin de esta membrana del portaobjeto, se corta, con ayuda de un bistur, las posibles adhesiones que existan entre el parlodion y los bordes del portaobjeto.

Teniendo cuidado de no tocar la membrana formada sobre el portaobjeto, se introduce en la cpsula Petri poco a poco. La membrana empieza a desprenderse del portaobjeto y flota sobre la superficie del agua destilada (el parlodion es insoluble en el agua). El procedimiento dura entre 10 a 15 minutos, en todo momento se debe evitar las deformaciones y pliegues en la membrana mientras se est desprendiendo del portaobjeto (FIG. N5). Mediante el empleo de una fina pinza, se colocan algunas rejillas portamuestras de cobre sobre la membrana de parlodion. Se corta un pedazo de parafilm, del tamao de la membrana de parlodio, y se coloca sobre el conjunto rejillas-membrana de parlodio que flota sobre el agua destilada. Se tiene que tener cuidado de cubrir las rejillas y la membrana con la cara correcta del parafilm, que es la que viene protegida por una lmina de papel. El parafilm se adhiere a la membrana, atrapando a las rejillas en medio de las dos capas.

FIG.N6. Rejillas portamuestras colocadas sobre

la capa de parlodion.

FIG.N7. Llenamos la cpsula Petri hasta saturarlo

por completo, hace esto nos facilitar sacar la capa de parlodion.

FIG.N9. Resbalando el parafilm hasta sacarlo

completamente.


FIG.N10. Imagen del conjunto (parafilm, rejillas y
membrana).

Se agrega agua al ras de la superficie de la cpsula Petri y resbalamos todo el conjunto hasta retirarlo completamente (Ver FIG.N9), luego se le coloca sobre papel toalla a fin de que seque (aproximadamente 15 minutos), aqu trataremos de no ponerlo muy cerca a la fuente de iluminacin ya que hay peligro de que se queme. Pegamos dos orejas de papel filtro para evitar que la membrana se desprenda del parafilm, tambin lo usamos para absorber las gotas grandes que yacen sobre la membrana. Con ayuda de un bistur, se hace 6 cortes (hexgono) tales que los cortes sean tangentes a circunferencia de la rejilla de cobre. Luego, mediante el empleo de una pinza muy fina, se retiran cada una de las rejillas (procedimiento del laboratorio N2). La membrana de parlodio es transparente y no se puede saber si se encuentra o no sobre la rejilla. Sin embargo, puede reconocrsele si se ilumina la rejilla con una luz blanca; se notar que se torna iridiscente. sta fue la tcnica usada para reconocer la membrana en la rejilla portamuestra. La membrana de parlodion se puede reemplazar por una membrana de carbn, pero para esto, se tendr que contar con una mquina que deposite, por evaporacin, una capa fina de este material, posteriormente, buena parte del procedimiento anterior es vlido.

constante, esto con la finalidad de obtener una capa de parlodion lo ms uniforme posible, de esta forma tendremos una mayor rea donde colocar las rejillas portamuestras, y por lo tanto una mayor cantidad de estas. Una zona adecuada de la capa de parlodion sobre la cual colocar las rejillas portamuestras se obtiene viendo los colores de interferencia. Una membrana de carbn es mucho mejor que una membrana de parlodion, ya que el de carbn la evaporacin nos permite obtener una capa ms uniforme, ms pareja, tanto as que pudiramos dejar de usar la rejilla porta muestras. Con mucha prctica se puede llegar a preparar la membrana de parlodion sin la necesidad de usar la tcnica de squash, para esto lo nico que tenemos que hacer es aplicar directamente el parlodion en la cpsula Petri. Tener cuidado de colocar el parafilm con la capa de parlodion y las rejillas muy cerca a la fuente de luz, debido a la necesidad de un secado muy rpido, ya que esto puede ocasionar que se quemen. Se debe trabajar a una temperatura de 20C, esto con la finalidad de mantener una temperatura ambiente durante todo el procedimiento, ya que esto afecta la velocidad de evaporacin y de secado.

Sacar la membrana de la cpsula Petri es un proceso que se debe realizar con paciencia ya que puede tardar varios minutos, se debe tener mucho cuidado de no daar la membrana con la desesperacin, se recomienda ser muy pacientes.
Trabajar con una fuente de luz blanca, ya que esto nos ayuda a saber cul es la ubicacin exacta de nuestra membrana, adems de permitirnos visualizar los colores debido a la interferencia.

III. Observaciones y discusiones:

Reiteremos, antes de comenzar a preparar nuestros filtros de membranas tenemos que limpiar muy bien el ambiente de trabajo, pues la saliva que se emite al hablar, el polvo, la grasa de los dedos, etc. son capaces de modificar nuestros resultados. Es recomendable usar mascarilla y guantes de latex. Cuando apliquemos la tcnica de squash, tratemos de deslizar los portamuestras muy lentamente, a su vez aplicamos en todo momento una presin aproximadamente

IV. Conclusin.
La preparacin de filtros de membrana de parlodion es un proceso sencillo que requiere de mucho cuidado y paciencia durante todo el proceso, requiere tambin de tener un lugar apropiado libre de polvo y suciedad para la experimentacin. La preparacin de los filtros es uno de los pasos en la preparacin de muestras para el TEM, de mucha importancia, ya que nos permitir colocar sobre ella parculas y/o fibras para su posterior visualizacin. En conclusin la experiencia de preparacin de filtros de membrana fue muy provechosa pues nos permiti aprender la tcnica en s.

V. Anexos.
A. Iridiscencia La iridiscencia es un fenmeno ptico caracterizado como la propiedad de ciertas superficies en las cuales el tono de la luz vara de acuerdo al ngulo desde el que se observa la superficie, como en las manchas de aceite, las burbujas de jabn, las alas de una mariposa y el lado reproducible del disco lser, ya sea CD o DVD. La iridiscencia es causada por mltiples reflexiones de la luz en mltiples superficies semitransparentes, donde los subsecuentes cambios de fase e interferencia de las reflexiones modulan la luz por la amplificacin o atenuacin de las diferentes frecuencias. B. Franjas de una pelcula en forma de cua. Existen una clase de franjas de interferencia para las cuales su espesor ptico, es el parmetro dominante ms que . Estas se llaman franjas de igual grosor. De la FIG. N , tenemos:

FIG.N12. Franjas en una pelcula en forma de cua.

La diferencia de fase correspondiente en el punto P es:

Tomando en cuenta el cambio de fase de en reflexin en una de las superficies de la pelcula, existen mximos de intensidad en el punto P cuando:

Donde es el promedio para los puntos de la fuente los cuales contribuyen a la luz en el punto P. Si ste valor es efectivamente constante, las franjas estn localizadas en los puntos de la pelcula en el cual el espesor ptico es constante, por lo que se les conoce a stas franjas de igual grosor. A incidencia normal, la condicin para una franja oscura llega a ser, con y la longitud en aire. de onda Las franjas de interferencia en la placa representan contornos de la pelcula a intervalos de , lo que nos indica que este principio es muy til para medir diferencias de espesores, cuando stos son del mismo orden de magnitud que la longitud de onda.

VI. Bibliografa.
[1]. ptica Fsica. Centro de Investigaciones en ptica (CIO). Mxico. [2]. ptica. Eugene, Hecht and Alfred, Zajac. Addison-Wesley Iberoamericana, 1986. [3]. Principles of Optics: Electromagnetic Theory of Propagation Interference and Diffraction of Light. Max Born and Emil Wolf. Pergamon Press, 6th edition, 1980. [4]. La parte de preparacin de membranas fue tomada de la pgina web: http://webdelfisico.blogspot.com/2008/11/preparac in-de-membranas-para-microscopa.html [5]. Para las tcnicas de preparacin de muestras:

FIG.N11. Interferencia en una pelcula en forma de

cua.

http://webdelfisico.blogspot.com/2008/11/resu men-en-este-laboratorio-se-observ-y.html