EXAMINAREA SCHELETULUI AXIAL LA FETUSII DE ROZATOARE

INTRODUCERE
Mecanismele caracteristice tiparului de formare a scheletului axial la rozatoare sunt insuficient intelese. Alterarile genetice care rezulta fie din mutatie spontana,fie din expunere xenobiotica, pot cauza disfunctionalitati acestui tipar si pot duce la o varietate de alterari scheletice. Compusii chimici incluzand acidul valproic, acidul retinoic, acidul salicilic si acetazol-amida cauzeaza aparitia unui numar mai mare de coaste la rozatoare; pe de alta parte, exista putini agenti care sa cauzeze reducerea numarului de coaste sau vertebre, printre acestia numarandu-se acidul boric, acidul arsenic, metanolul si hipertermia.

 Efectele asupra dezvoltarii axiale au fost de asemenea asociate atat cu schimbari in expresia genelor homeotice, cat si cu disparitia protooncogenei bmi-l. Caracterizarea minutioasa a morfologiei scheletului axial este dificila in identificarea transformarilor homeotice si a altor schimbari produse de expresia genelor alterate. In cele ce urmeaza vor fi prezentate metodele necesare prapararii si examinarii scheletelor rozatoarelor.

MATERIALE
In scopul examinarii scheletice a fetusilor de soarece si sobolan, se utilizeaza tavi de polistiren alcatuite din 18 compartimente. Prelucram cate un fetus pe compartiment, mentinand astfel identitatea fiecaruia in parte. Este utilizat cate un ecran flexibil pentru stabilizarea fiecarui fetus in parte in momentul drenarii solutiilor din tavi. Aceste tavi sunt incompatibile cu acetona; prin urmare,cand aceasta este necesara pentru deshidratare si eliminarea grasimilor, transferam specimenele in borcane cu 30 de ml polipropilen.

 Ca o alternativa a tavilor de polistiren, unele laboratoare proceseaza fetusii laolalta in borcane de sticla sau polipropilen, si folosesc etichete pentru identificarea fiecarui fetus in parte. Dupa cum am mentionat anterior, acetona poate fi utilizata pentru deshidratare si eliminarea grasimilor. Solutiile pe baza de etanol cu concentratii mai mari de 70% sunt inflamabile, asadar se impun anumite precautii, cum ar fi utilizarea recipientelor din metal daca specimenele se conserva in 95% etanol. Toate solutiile pot fi preparate in avans si pastrate la temperatura camerei.

 Oricum,se recomanda evitarea solutiilor in care albastrul alcian a precipitat. De asemenea, solutia de rosu alizarin este sensibila la lumina-prin urmare, este necesar ca aceasta sa fie protejata de lumina. Solutiile pe baza de etanol si glicerina (cu sau fara alcool benzilic) pot fi reutilizare in cazul in care nu sunt prea inchise la culoare, pentru ca daca au pigmentul prea pronuntat, capacitatea lor de decolorare devine limitata. Totodata, solutia de alcool benzilic poate deveni prea alcalina dupa cateva utilizari.

PREGATIREA SCHELETULUI FETUSILOR

Timpul de gestatie al sobolanilor este de 21 de zile, iar la soareci de 18 zile. In urma operatiei de cezariana, fetusii de rozatoare sunt examinati in vederea depistarii unor eventuale modificari externe majore, iar apoi cantariti si eutanasiati. Evidentierea specimenelor poate fi realizata cu ajutorul uneia sau a doua solutii. In ambele cazuri solutia de rosu alizarin este utilizata pentru vizualizarea osului. In cazul specimenelor la care se utilizeaza doua solutii, cea de albastru alcian este utilizata pentru vizualizarea cartilajului. Acest din urma caz este utilizat mai des, intrucat albastrul alcian faciliteaza vizualizarea unor tipare cartilaginoase importante,care altfel ar fi dificil sau chiar imposibil de examninat.

METODA DE EVIDENTIERE A FETUSILOR DE ROZATOARE CU AJUTORUL UNEI SINGURE SOLUTII DE COLORAT

1. Dupa ce fetusii sunt extrasi din uter,cantariti,examinati si eutanasiati,se face o incizie abdominala in fiecare fetus ales pentru examninarea scheletului; 2. Se introduc fetusii in 70% EtOH,folosindu-se cel putin 10 ml solutie/gram de tesut; 3. Inainte de orice alr procedeu,se inregistreaza sexul fetusului; 4. Se indeparteaza organele intratoracice si intraabdominale,pielea,si grasimile subcutanate dintre scapula si spatele gatului.De asemenea,pot fi inlaturati si ochii; 5. Se transfera specimenele in borcane de sticla sau in alte recipiente rezistente la acetona si se adauga acetona,lasandu+le sa stea cel putin o zi in aceasta solutie;

 6. Specimenele se plaseaza in solutie de rosu aliyarina)25 mg/l si 1% KOH pentru aproximativ 2 zile in cazul sobolanilor,si 1 zi in cazul soarecilor,pana ating gradul nesecar de macerare; 7. Se transfera specimenele intr-o solutie ce contine 70% EtOH si 100% glicerina; 8. Se examineaza specimenele intr-un vas de sticla;de asemenea se recomanda scufundarea acestora in etanol; 9. In final, se transfera specimenele in glicerina.

METODA DE EVIDENTIERE A FETUSILOR DE ROZATOARE CU AJUTORUL A DOUA SOLUTII DE COLORAT

1. In urma extragerii fetusilor din uter,a cantaririi,stabilirii sexului si eutanasierii,se eviscereaza si se indeparteaza complet pielea,dupa care se scufunda specimenul in apa calduta(30C)pentru aproximativ 30 s pentru a facilita indepartarea pielii de pe extremitati.Ulterior se face o incizie abdominala in fiecare fetus ales pentru examninarea scheletului. 2. Se introduc fetusii in 95% EtOH,folosindu-se cel putin 10 ml solutie/gram de tesut; 3. Se coloreaza respectand urmatoarea schema: Ziua 1:dupa amiaza se transfera toate specimenele in solutie de albastru alcian si se lasa peste noapte; Ziua 2:dimineata se transfera specimenele in solutie 95% EtOH pentru decolorare si clatire,iar dupa amiaza se transfera in 1% KOH si se lasa peste noapte;

 Ziua 3:dimineata se transfera in solutie de rosu alizarin(25 mg/l)cu 1%KOH; Ziua 4:dimineata se transfera in solutie 70% etanol si glicerina; 4. Se examineaza specimenele intr-un vas de sticla,si se recomanda scufundarea acestora in etanol; 5. In final,se transfera specimenele in glicerina,cu cateva cristale de timol pentru prevenirea aparitiei mucegaiului.