TUGAS MATA KULIAH FITOKIMIA

METODE KROMATOGRAFI

Disusun Oleh:

Rina Nur Azizah Prinka Ariessa Septian Anggadibya

260110100104 260110100129 260110100158

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN JATINANGOR 2011

KATA PENGANTAR

Dengan mengucapkan syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa, akhirnya makalah Metode Kromatografi ini selesai kami susun. Makalah ini disusun dengan tujuan untuk memenuhi tugas mata kuliah Fitokimia dan juga untuk membantu mahasiswa-mahasiswa lain dalam mempelajari serta memberi gambaran mengenai metode-metode kromatografi. Dalam penyusunan makalah ini tidak lupa kami mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada semua pihak atas saran, komentar, dan dorongan sehingga makalah ini dapat selesai disusun. Tiada gading yang tak retak, begitu juga dengan makalah ini. Akhirnya, kami mengharapkan saran, kritik, dan masukan yang membangun demi perbaikan makalah ini di masa yang akan datang. Kami berharap semoga makalah ini dapat bermanfaat bagi kita semuanya. Amin.

Jatinangor, April 2012

Penyusun

DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR.1 BAB I BAB II : PENDAHULUAN....3 : ISI...7 Kromatografi Cair-Padat7 Kromatografi Gas-Padat7 Kromatografi Cair-Cair.8 Kromatografi Gas-Cair..8 Kromatografi Gas..16 Kromatografi Cair.17 Kromatografi Partisi.19 Kromatografi Penukar Ion..20 Kromatografi Eksklusi Molekular..25 Kromatografi Permeasi Gel29 Kromatografi Adsorpsi32 Kromatografi Lapis Tipis.32 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif40 Kromatografi Kertas41 Kromatografi Kolom42 Kromatografi Cair-Vakum..43 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)..44 BAB III : PENUTUP.47

DAFTAR PUSTAKA.48

BAB I PENDAHULUAN

Suatu analisis kimia menjadi meragukan jika pengukuran sifat tidak berhubungan dengan sifat spesifik senyawa terukur. Analisis meliputi pengambilan cuplikan, pemisahan senyawa pengganggu, isolasi senyawa yang dimaksudkan, pemekatan terlebih dahulu sebelum identifikasi dan pengukuran. Terdapat banyak teknik pemisahan tetapi kromatografi merupakan teknik yang paling banyak digunakan. Kromatografi pertama kali diberikan oleh Michael Tswett, seorangahli botani Rusia, pada tahun 1906.Kromatografi berasal dari bahasa Yunani Kromatos yang berarti warnadan Graphos yang berarti menulis. Kromatografi adalah metode pemisahan komponen kimia yang didasarkan pada perbedaan antara fase bergerak dan fase diam dari komponen-komponen yang terdapat dalam suatu sampel uji. Komponen yang dipisahkan tersebut dapat dikuantifikasi dengan menggunakan detektor dan/atau dikoleksi untuk analisa lebih lanjut. Instrumen untuk mengkuantifikasi adalah Gas and liquid chromatography dengan mass spechtrometry (GC-MC dan LCMC); Fourier transform infrared spectroscopy (GC-FTIR) dan diode-array UV-VIS absoprtionspectroscopy (HPLCUV-VIS). Kromatografi gas (GC) digunakan untuk memisahkan senyawa organik menguap (volatile). Fase bergerak adalah gas dan fase diam biasanya cairan. High Performance Liquid Chromatografi (HPLC) adalah variasi dari khromatografi cairan yang menggunakan pompa bertekanan tinggi untuk meningkatkan efisiensi pemisahan senyawa kimia. Kromatografi cair (LC) digunakan untuk menganalisis pemisahan campuran, yang mengandung ion-ion logam dan senyawa organik. Fase

bergerak adalah pelarut dan fase diam adalah cairan yang mendukung padatan, padatan, dan ion pengganti resin. Kromatografi dalam berbagai bentuknya telah digunakan secara luas sebagai teknik pemisahan dan analisis. Pada tahun 1941, Martin dan Synge, yang kemudian mendapat hadiah Nobel, dalam makalahnya mengemukakan pengertian-pengertian dasar tentang kromatografi gas (GC) dan HPLC. Tidak kurang dari 10 tahun kemudian, yaitu pada tahun 1952, James dan Martin untuk pertama kali mengintrodusir penggunaan GC. Sejak saat itu GC telah menjadi bentuk kromatografi yang paling baik dan berkembang dengan sangat cepat. Bentuk- bentuk kromatografi yang lain seperti kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis (TLC), kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi (semuanya termasuk kromatografi cairan), belum memperoleh sukses yang sama seperti yang telah dicapai oleh GC. Hal ini disebabkan karena efisiensinya yang rendah serta waktu analisisnya yang panjang: Pada awal tahun 1960-an, Giddings menunjukkan bahwa kerangka kerja teoritis yang dikembangkan untuk GC berlaku sama baiknya untuk kromatografi cairan, dan antara tahun 1967 1969 Kirkland, Huber, dan kelompok Horvath, Preiss dan Lipsky mengemukakan penggunaan HPLC yang pertama kali. Dengan menggunakan tekanan yang tinggi (sampai dengan 5000 psi), HPLC dapat mengatasi kelemahankelemahan dari kromatografi cairan pada umumnya, misalnya viskositas cairan yang relatif lebih besar dibanding dengan viskositas gas, sehingga HPLC mampu memberikan waktu analisis (5 - 30 menit) yang kurang lebih sama dengan waktu analisisnya GC. Berdasarakan jenis fasa gerak dan fasa diamnya, kromatografi dapat dibedakan atas berbagi tipe sebagai berikut: Fase Gerak Cairan Gas Fase Diam Padatan Padatan Tipe Kromatografi Kromatografi Cair-Padat Kromatografi Gas-Padat

Cairan Gas

Cairan Cairan

Kromatografi Cair-Cair Kromatografi Gas-Cair

Selain itu, penggolongan kromatografi juga dapat dilakukan berdasarkaan fase geraknya saja, berdasarkan mekanisme pemisahannya, berdasarkan jenis

pendukungnya, dan juga berdasarkan arah pengembangnya. Penggolongan berdasarkan fase gerak memberikan dua tipe kromatografi sebagai berikut: Fase Gerak Gas Cairan Dasar Pemisahan Kestabilan termal senyawa Proses adsorpsi atau partisi Tipe Kromatografi Kromatografi Gas Kromatografi Cair

Penggolongan kromatografi berdasarkan mekanisme pemisahan adalah sebagai berikut: Mekanisme Pemisahan Adsorpsi Partisi Pertukaran ion Perbedaan ukuran partikel Tipe Kromatografi Kromatografi Adsorpsi Kromatografi Partisi Kromatografi Pertukaran Ion Kromatografi Saringan Gel Kromatografi Eksklusi Molekular

Pembagian kromatografi berdasarkan jenis pendukungnya adalah sebagai berikut:

Jenis Pendukung Kertas Tipe Kromatografi

Kromatografi Kertas

Kaca/ lempeng logam tipis Kolom

Kromatografi Lapis Tipis Kromatografi Kolom Kromatografi Cair Vakum

Berdasarkan arah pengembangannya, kromatografi dapat dibedakan atas beberapa tipe, yaitu:
Arah Pengembangan Horizontal Vertikal menurun Vertikal menaik Sirkular Dua arah tegak lurus Tipe Kromatografi Kromatografi Horizontal Kromatografi Vertikal Menurun Kromatografi Vertikal Menaik Kromatografi Sirkular Kromatografi Dua arah

BAB II ISI
Kromatografi adalah teknik pemisahan fisik suatu campuran zat-zat kimia yang berdasar pada perbedaan migrasi dari masing-masing komponen campuran yang terpisah pada fase diam di bawah pengaruh pergerakan fase gerak. Berdasarakan jenis fasa gerak dan fasa diamnya, kromatografi dapat dibedakan atas berbagi tipe sebagai berikut: 1. Kromatografi Cair-Padat Metode jenis ini diketemukan oleh Tswett dan diperkenalkan kembali oleh Kuhn dan Ledere pada tahun 1931. Metode ini banyak digunakan untuk analisis biokimia dan organik. Teknik pelaksanaannya dilakukan dengan kolom. Sebagai fasa diam di dalam kolom dapat dipilih salika gel atau alumina. Kekurangan metode kromatografi cair-padat ini antara lain ialah: (a) pilihan fasa diam (adsorben) terbatas (b) koefisien distribusi untuk serapan seringkali tergantung pada kadar total. sehingga pemisahannya kurang sempurna.

2. Kromatografi Gas-padat (KGP) Kromatografi jenis ini digunakan sebelum tahun 1800 untuk menurunkan gas. Metode ini pada awalnya kurang berkembang. Penemuan jenis-jenis padatan baru sebagai hasil riset memperluas penggunaan metode ini. Kelemahan metode ini mirip dengan kromatografi cair-padat. Kelebihan menggunakan kromatografi padatan gas adalah : a. Untuk memisahkan gas-gas H , N , O , CO, gas-gas mulia, dan hidrokarbonhidrokarbon rendah

b. Perkembangan KGP saat ini yaitu digunakanya polimer-polimer yang berpori sperti PORAPAK dan POLYPAK, dimana penyerap-penyerap ini cocok untuk memisahkan senyawa-senyawa yang polar sperti H O, NH , R-NH , R-OH dan glikol-glikol, dan asam lemah rendah, juga untuk gas-gas seperti CO , N O, O dan sebagainya. c. Dapat digunakan untuk menyerap pada fasa diam yang berupa alumina atau pada silica gel. Kekurangan menggunakan kromatografi padatan gas (KGP) adalah: a. KGP sangat sukar digunakan secara berulang dengan hasil yang sama. b. Reproducibility KGP yang rendah karena puncak-puncak berekor disebabkan permukaan aktif yang tidak homogen dari penyerap, waktu retensi relative panjang, waktu retensi sangat tergantung pada jumlah pada cuplikan. Selain itu kemungkinan penyerap dapat berkelakuan sebagai katalisator yang aktif, sehingga KGP penggunaanya sangat terbatas sekali untuk senyawa yang mempunyai titik didih yang rendah maupun tinggi.

3. Kromatografi Cair-cair Metode kromatografi ini diperkenalkan oleh Martin den Synge pada tahun 1941. Fasa diam pada kromatografi Jenis ini berupa lapisan tipis cairan yang terserap pada: padatan inert berpori, yang berfungsi sebagai fasa pendukung. Keuntungan metode ini ialah: (a) pelihan kombinasi cairan cukup banyak; (b) koefisien distribusinya tidak tergantung pada konsentrasi, sehingga hasil-hasil pemisahannya lebih tajam.

4. Kromatografi Gas-Cair (KGC)

Pada kimia organik kadang-kadang menyebutnya sebagi kromatografi fasa uap. Pertama kali diperkenalkan oleh James dan Martin pada tahun 1952. Metode ini paling banyak digunakan karena efisien. serba guna, cepat dan peka. Cuplikan dengan ukuran beberapa mikrogram sampai dengan ukuran 10-15 gram masih dapat dideteksi. Sayangnya komponen cuplikan harus mempunyai tekanan beberapa torr pada suhu kolom. Seluruh bentuk kromatografi terdiri dari fase diam dan fase gerak. Dalam seluruh bentuk kromatografi yang lain, anda akan menemui fase gerak adalah cairan. Dalam kromatografi gas-cair, fase gerak adalah gas seperti helium dan fase diam adalah cairan yang mempunyai titik didih yang tinggi diserap pada padatan.

Bagaimana kecepatan suatu senyawa tertentu bergerak melalui mesin, akan tergantung pada seberapa lama waktu yang dihabiskan untuk bergerak dengan gas dan sebaliknya melekat pada cairan dengan jalan yang sama.

Diagram alir kromatografi gas-cair

Injeksi sampel Sejumlah kecil sampel yang akan dianalisis diinjeksikan pada mesin menggunakan semprit kecil. Jarum semprit menembus lempengan karet tebal (Lempengan karet ini disebut septum) yang mana akan mengubah bentuknya kembali secara otomatis ketika semprit ditarik keluar dari lempengan karet tersebut. Injektor berada dalam oven yang mana temperaturnya dapat dikontrol. Oven tersebut cukup panas sehingga sampel dapat mendidih dan diangkut ke kolom oleh gas pembawa misalnya helium atau gas lainnya. Cara kerja kolom Material padatan Ada dua tipe utama kolom dalam kromatografi gas-cair. Tipe pertama, tube panjang dan tipis berisi material padatan; Tipe kedua, lebih tipis dan memiliki fase diam yang berikatan dengan pada bagian terdalam permukaannya. Untuk menyederhanakan, kita akan melihat pada kolom terpadatkan. Kolom biasanya dibuat dari baja tak berkarat dengan panjang antara 1 sampai 4 meter, dengan diameter internal sampai 4 mm. Kolom digulung sehingga dapat disesuakan dengan oven yang terkontrol secara termostatis. Kolom dipadatkan dengan tanah diatomae, yang merupakan batu yang sangat berpori. Tanah ini dilapisis dengan cairan bertitik didih tinggi, biasanya polimer lilin.

Temperatur kolom Temperatur kolom dapat bervariasi antara 50 oC sampai 250 oC. Temperatur kolom lebih rendah daripada gerbang injeksi pada oven, sehingga beberapa komponen campuran dapat berkondensasi pada awal kolom.

10

Dalam beberapa kasus, seperti yang anda akan lihat pada bagian bawah, kolom memulai pada temperatur rendah dan kemudian terus menerus menjadi lebih panas dibawah pengawasan komputer saat analisis berlangsung.

Bagaimana pemisahan berlangsung pada kolom? Ada tiga hal yang dapat berlangsung pada molekul tertentu dalam campuran yang diinjeksikan pada kolom:

Molekul dapat berkondensasi pada fase diam. Molekul dapat larut dalam cairan pada permukaan fase diam Molekul dapat tetap pada fase gas

Dari ketiga kemungkinan itu, tak satupun yang bersifat permanen. Senyawa yang mempunyai titik didih yang lebih tinggi dari temperatur kolom secara jelas cenderung akan berkondensasi pada bagian awal kolom. Namun, beberapa bagian dari senyawa tersebut akan menguap kembali dengan dengan jalan yang sama seperti air yang menguap saat udara panas, meskipun temperatur dibawah 100 oC. Peluangnya akan berkondensasi lebih sedikit selama berada didalam kolom. Sama halnya untuk beberapa molekul dapat larut dalam fase diam cair. Beberapa senyawa akan lebih mudah larut dalam cairan dibanding yang lainnya. Senyawa yang lebih mudah larut akan menghabiskan waktunya untuk diserap pada fase diam: sedangkan senyawa yang suka larut akan menghabiskan waktunya lebih banyak dalam fase gas. Proses dimana zat membagi dirinya menjadi dua pelarut yang tidak bercampurkan karena perbedaan kelarutan, dimana kelarutan dalam satu pelarut satu lebih mudah dibanding dengan pelarut lainnya disebut sebagai partisi. Sekarang, anda bisa beralasan untuk memperdebatkan bahwa gas seperti helium tidak dapat

11

dijelaskan sebagai pelarut. Tetapi, istilah partisi masih dapat digunakan dalam kromatografi gas-cair. Beberapa molekul dalam substansi menghabiskan waktu untuk larut dalam cairan dan beberapa lainnya menghabiskan waktu untuk bergerak bersama-sama dengan gas. Waktu retensi Waktu yang digunakan oleh senyawa tertentu untuk bergerak melalui kolom menuju ke detektor disebut sebagi waktu retensi. Waktu ini diukur berdasarkan waktu dari saat sampel diinjeksikan pada titik dimana tampilan menunujukkan tinggi puncak maksimum untuk senyawa itu. Setiap senyawa memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk senyawa tertentu, waktu retensi sangat bervariasi dan bergantung pada:

Titik didih senyawa. Senyawa yang mendidih pada temperatur yang lebih tinggi daripada temperatur kolom, akan menghabiskan hampir seluruh waktunya untuk berkondensasi sebagai cairan pada awal kolom. Dengan demikian, titik didih yang tinggi akan memiliki waktu retensi yang lama.

Kelarutan dalam fase cair. Senyawa yang lebih mudah larut dalam fase cair, akan mempunyai waktu lebih singkat untuk dibawa oleh gas pembawa.. Kelarutan yang tinggi dalam fase cair berarti memiiki waktu retensi yang lama.

Temperatur kolom. Temperatur tinggi menyebakan pergerakan molekulmolekul dalam fase gas; baik karena molekul-molekul lebih mudah menguap, atau karena energi atraksi yang tinggi cairan dan oleh karena itu tidak lama tertambatkan. Temperatur kolom yang tinggi mempersingkat waktu retensi untuk segala sesuatunya di dalam kolom.

12

Untuk memberikan sampel dan kolom, tidak ada banyak yang bisa dikerjakan menggunakan titik didih senyawa atau kelarutannya dalam fase cair, tetapi anda dapat mempunyai pengatur temperatur. Semakin rendah temperatur kolom semakin baik pemisahan yang akan anda dapatkan, tetapi akan memakan waktu yang lama untuk mendapatkan senyawa karena kondensasi yang lama pada bagian awal kolom. Dengan kata lain, menggunakan temperatur tinggi, segala sesuatunya akan melalui kolom lebih cepat, tetapi pemisihannya kurang baik. Jika segala sesuatunya melalui kolom dalam waktu yang sangat singkat, tidak akan terdapat jarak antara puncak-puncak dalam kromatogram. Jawabannya dimulai dengan kolom dengan suhu yang rendah kemudian perlahan-lahan secara teratur temperaturnya dinaikkan. Pada awalnya, senyawa yang menghabiskan lebih banyak waktunya dalam fase gas akan melalui kolom secara cepat dan dapat dideteksi. Dengan adanya sedikit pertambahan temperatur akan memperjelas perlekatan senyawa. Peningkatan temperatur masih dapat lebih `melekatan` molekul-molekul fase diam melalui kolom.

Detektor Ada beberapa tipe detektor yang biasa digunakan. Detektor ionisasi nyala dijelaskan pada bagian bawah penjelasan ini, merupakan detektor yang umum dan lebih mudah untuk dijelaskan daripada detektor alternatif lainnya. Detektor ionisasi nyala Dalam mekanisme reaksi, pembakaran senyawa organik merupakan hal yang sangat kompleks. Selama proses, sejumlah ion-ion dan elektron-elektron dihasilkan dalam nyala. Kehadiran ion dan elektron dapat dideteksi.

13

Seluruh detektor ditutup dalam oven yang lebih panas dibanding dengan temperatur kolom. Hal itu menghentikan kondensasi dalam detektor.

Jika tidak terdapat senyawa organik datang dari kolom, anda hanya memiliki nyala hidrogen yang terbakar dalam air. Sekarang, anggaplah bahwa satu senyawa dalam campuran anda analisa mulai masuk ke dalam detektor. Ketika dibakar, itu akan menghasilkan sejumlah ion-ion dan elektron-elektron dalam nyala. Ion positif akan beratraksi pada katoda silinder. Ion-ion negatif dan elektron-elektron akan beratraksi pancarannya masing-masing yang mana merupakan anoda.Hal ini serupa dengan apa yang terjadi selama elektrolisis normal. Pada katoda, ion positif akan mendatangi elektron-elektron dari katoda dan menjadi netral. Pada anoda, beberapa elektron dalam nyala akan dipindahkan pada

14

elektroda positif; ion-ion negatif akan memberikan elektron-elektronnya pada elektroda dan menjadi netral. Kehilangam elektron-elektron dari satu elektroda dan perolehan dari elektroda lain, akan menghasilkan aliran elektron-elektron dalam sirkuit eksternal dari anoda ke katoda. Dengan kata lain, anda akan memperoleh arus listrik. Arus yang diperoleh tidak besar, tetapi dapat diperkuat. Jika senyawasenyawa organik lebih banyak dalam nyala, maka akan banyak juga dihasilkan ionion, dan dengan demikian akan terjadi arus listrik yang lebih kuat. Ini adalah pendekatan yang beralasan, khususnya jka anda berbicara tentang senyawa-senyawa yang serupa, arus yang anda ukur sebanding dengan jumlah senyawa dalam nyala. Kekurangan detektor ionisasi nyala Kekurangan utama dari detektor ini adalah pengrusakan setiap hasil yang keluar dari kolom sebagaimana yang terdeteksi. Jika anda akan mengrimkan hasil ke spektrometer massa, misalnya untuk analisa lanjut, anda tidak dapat menggunakan detektor tipe ini. Penerjemahan hasil dari detektor Hasil akan direkam sebagai urutan puncak-puncak; setiap puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor. Sepanjang anda mengontrol secara hati-hati kondisi dalam kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang tampak-tentu saja anda atau seseorang lain telah menganalisa senyawa murni dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

15

Area dibawah puncak sebanding dengan jumlah setiap senyawa yang telah melewati detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui komputer yang dihubungkan dengan monitor. Area yang akan diukur tampak sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar yang disederhanakan. Perlu dicatat bahwa tinggi puncak tidak merupakan masalah, tetapi total area dibawah puncak. Dalam beberapa contoh tertentu, bagian kiri gambar adalah puncak tertinggi dan memiliki area yang paling luas. Hal ini tidak selalu merupakan hal seharusnya. Mungkin saja sejumlah besar satu senyawa dapat tampak, tetapi dapat terbukti dari kolom dalam jumlah relatif sedikit melalui jumlah yang lama. Pengukuran area selain tinggi puncak dapat dipergunakan dalam hal ini (Clark, 2007).

Penggolongan berdasarkan fase gerak memberikan dua tipe kromatografi sebagai berikut:

1.

Kromatografi Gas Campuran gas dapat dipisahkan dengan kromatografi gas. Fasa stationer dapat

berupa padatan (kromatografi gas-padat) atau cairan (kromatografi gas-cair). Umumnya, untuk kromatografi gas-padat, sejumlah kecil padatan inert misalnya

16

karbon teraktivasi, alumina teraktivasi, silika gel atau saringan molekular diisikan ke dalam tabung logam gulung yang panjang (2-10 m) dan tipis. Fasa mobil adalah gas semacam hidrogen, nitrogen atau argon dan disebut gas pembawa. Pemisahan gas bertitik didih rendah seperti oksigen, karbon monoksida dan karbon dioksida dimungkinkan dengan teknik ini. Dalam kasus kromatografi gas-cair, ester seperti ftalil dodesilsulfat yang diadsorbsi di permukaan alumina teraktivasi, silika gel atau penyaring molekular, digunakan sebagai fasa diam dan diisikan ke dalam kolom. Campuran senyawa yang mudah menguap dicampur dengan gas pembawa disuntikkan ke dalam kolom, dan setiap senyawa akan dipartisi antara fasa gas (mobil) dan fasa cair (diam) mengikuti hukum partisi. Senyawa yang kurang larut dalam fasa diam akan keluar lebih dahulu. Metoda ini khususnya sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah menguap seperti hidrokarbon dan ester. Analisis minyak mentah dan minyak atsiri dalam buah telah dengan sukses dilakukan dengan teknik ini. Efisiensi pemisahan ditentukan dengan besarnya interaksi antara sampel dan cairannya. Disarankan untuk mencoba fasa cair standar yang diketahui efektif untuk berbagai senyawa. Berdasarkan hasil ini, cairan yang lebih khusus kemudian dapat dipilih. Metoda deteksinya, akan mempengaruhi kesensitifan teknik ini. Metoda yang dipilih akan bergantung apakah tujuannya analisik atau preparatif ( Takeuchi, 2009 ).

2. Kromatografi Cair Terdapat dua model operasional yang didasarkan pada polaritas relatif dari fase diam dan fase bergerak.

17

1. Normal phase Chromatograpy : Fase diam bersifat polar kuat dan fase gerak bersifat non-polar Misalnya : Silika = fase diam , n-hexane = fase gerak 2. Reversed phase Chromatography: Fase diam bersifat non-polar dan fase gerak bersifat polar. Misal : Hydrocarbon = fase diam, air = fase gerak Gambar 18.21. menggambarkan kedua teknik tersebut menunjukkann elusi komponen sampel dengan polaritas berbeda.

Gambar 18.21. Ilustrasi kromatografi cair yang normal dan reversed phase. Fase gerak dapat dipompakan ke dalam kolom dengan tiga cara : 1. Isokratik:aliran tetap (konstan) dan ketetapan komposisi dari fase gerak tetap berlaku. 2. Gradient Elution:aliran konstan dan perubahan komposisi dari fase gerak terjadi. 3. Flow Program : aliran bervariasi dan ketetapan komposisi dari fase gerak terjadi. (Wiryawan, 2011).

18

Penggolongan kromatografi berdasarkan mekanisme pemisahannya adalah sebagai berikut:

1. Kromatografi Partisi Prinsip kromatografi partisi dapat dijelaskan dengan hukum partisi yang dapat diterapkan pada sistem multikomponen yang dibahas di bagian sebelumnya. Dalam kromatografi partisi, ekstraksi terjadi berulang dalam satu kali proses. Dalam percobaan, zat terlarut didistribusikan antara fasa stationer dan fasa mobil. Fasa stationer dalam banyak kasus pelarut diadsorbsi pada adsorben dan fasa mobil adalah molekul pelarut yang mengisi ruang antar partikel yang ter adsorbsi. Contoh khas kromatografi partisi adalah kromatografi kolom yang digunakan luas karena merupakan sangat efisien untuk pemisahan senyawa organik (Gambar 12.3). Kolomnya (tabung gela) diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel atau pati yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sammpel diasorbsi oleh adsorben. Kemudian pelarut (fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom. Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa mobil) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fasa stationer). Selama perjalanan turun, zat terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan partisi berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk masing-masing zat terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat terlarut. Akhirnya, zat terlarut akan terpisahkan membentuk beberapa lapisan.

19

Akhirnya, masing-masing lapisan dielusi dengan pelarut yang cocok untuk memberikan spesimen murninya. Nilai R didefinisikan untuk tiap zat etralrut dengan persamaan berikut. R = (jarak yang ditempuh zat terlarut) / (jarak yang ditempuh pelarut/fasa mobil).

Gambar 12.3 Diagram skematik kromatografi 2. Kromatografi Penukar Ion Kromatografi pertukaran ion merupakan metode kromatografi utama yang paling banyak digunakan dalam produksi makromolekul biologis. Dibandingkan dengan resin konvensional, maka tentakel penukar ion Merck Fractogel dan Fractoprep meningkatkan efisiensi proses pemisahan. Media tentakel memberikan sejumlah manfaat seperti kapasitas tinggi pada tingkat laju tinggi, selektivitas tinggi, efisiensi tinggi, dan pemulihan tinggi. Keduanya memertahankan aktivitas biologi selama pemurnian dan mendapatkan hasil yang tinggi. Semua penukar ion Merck menunjukkan kapasitas pengikat protein yang luar biasa pada tingkat laju tinggi dan menawarkan berbagai fitur yang bermanfaat untuk banyak proses produksi (Darmstadt, 2012). Kromatografi Penukar Ion (Ion Exchange Cromatography)

20

Fase diam berupa penukar kation maupun anion yang terdiri atas gel silika atau polimer dengan berat molekul tinggi dimana merupakan gugus ionik berikatan kimia, Bahan terlarut (bersifat ionik) ditambahkan pada sistem pertukaran kation atau anion dengan polar eluan (misal air). Mekanisme pemisahan berdasarkan pada daya tarik elektrostatik.

(Wiryawan, 2011).

Mengoperasikan Alat Penukar Ion Pada proses kolom ganda, air mentah mula-mula masuk ke dalam kolom penulcar kation. Di sini sernua kation yang terkandung dalam air (terutama ion kalsium, magnesium dan natrium) ditukar dengan ion hidrogen. Dalarn kolom berikutnya yang berisi penukar anion, maka anion (terutama ion khlorida, sulfat dan bikarbonat) ditukar dengan ion hidroksil. Ion hidrogen yang berasal dari penukar kation dan ion hidroksil dari penukar anion akan membentuk ikatan dan menghasilkan air. Setelah air terbentuk maka resin penukar ion harus diregenerasi. Pelaksanaan regenerasi pada proses kolorn ganda sangat sederhana. Ke dalam kolom penukar

21

kation dialirkan asarn khlorida encer dan ke dalam kolom penukar anion dialirkan larutan natrium hidroksida encer. Regeneran yang berlebihan selanjutnya dibilas dengan air. Pada proses unggun campuran kolom tunggal, resin penukar kation dan penukar anion dicampur menjadi satu dalam sebuah kolom tunggal. Dengan proses unggun campuran dapat dicapai tingkat kemurnian air yang jauh lebih tinggi daripada dengan proses kolom ganda. Sebaliknya, pada proses unggun campuran regenerasi resin penukar lebih kompleks.

Langkah-langkah kerja pada regenerasi unggun campuran: Pernisahan resin penukar kation dan penukar anion dengan cara klasifikasi menggunakan air (pencucian kembali dari bawah ke atas). Dalam hal ini resin penukar anion yang lebih ringan (kebanyakan berwarna lebih terang) akan berada di atas resin 349 penukar kation yang lebih berat (kebanyakan berwarna lebih gelap). Pencucian kembali harus dilangsungkan terus sampai di antara kedua resin terlihat suatu lapisan pemisah yang tajam.

22

1. Untuk regenerasi, regeneran bersama dengan air dialirkan melewati kedua lapisan resin Asam khlorida encer dialirkan dari bawah ke atas melewati resin penukar kation, dan dikeluarkan dari kolom pada ketinggian lapisan pernisah. Larutan natrium hidroksida encer dialirkan dari atas ke bawah melewati resin penukar anion, juga dikeluarkan pada keting gian lapisan pemisah. 2. Kelebihan kedua regeneran kemudian dicuci dengan air 3. Ketinggian permukaan air dalam kolom diturunkan dan kedua resin penukar dicampur dengan cara memasukkan udara tekan dari ujung bawah kolom. 4. Pencucian ulang unggun campuran dengan air dari atas ke bawah, sampai alat ukur konduktivitas menunjukkan kondisi kemurnian air yang diinginkan. Sekarang instalasi siap untuk dioperasikan lagi. Baik pada instalasi pclunakan maupun pada instalasi demineralisasi air, maka pengalihan dari kondisi operasi ke proses regenerasi, pelaksanaan regenerasinya sendiri, dan pengalilian kembah ke kondisi 350 operasi dapat dilakukan baik secara manual maupun secara otomatik. Untuk mencapai kualitas air atau performansi yang optimal dan untuk mencegah terjadinya kerusakan pada resin penukar, maka petunjuk kerja yang diberikan oleh pabrik pembuat instalasi (misalnya mengenai urutan pelaksanaan operasi, kuantitas dan konsentrasi regeneran, waktu regenerasi dan waktu pencucian) harus diikuti dengan seksama. Pada saat bekerja dengan asam dain basa yang diperlukan untuk regenerasi, perlengkapan keselamatan perorangan yang sesuai harus digunakan. Air buangan yang keluar pada regenerasi dapat bersifat asam, basa atau mengandung garam. dan karena itu dalam hubungannya dengan pelestarian lingkungan harus ditangani seperti air limbah kimia. Ukuran performansi sebuah instalasi penukar ion adalah kuantitas cairan yang diproduksi per jam (atau selang waktu di antara dua regenerasi). Performansi

23

tergantung pada besarnya alat atau kuantitas penukar, pada kuantitas ion yang akan dipisahkan (dengan syarat kemurnian air yang diinginkan telah tertentu) dan pada tingkat kemurnian yang diminta. Untuk operasi yang semi kontinu (bila pengolahan air tidak bolch berhenti di tengah-tengah) diperlukan dua buah unit yang dihubungkan secara paralel. Karena proses pertukaran dan proses regenerasi tidak dapat berlangsung pada saat yang bersamaan, kedua unit tersebut bekerja secara bergantian, yang satu sebagai penukar ketika yang lain sedang regenerasi.

Beberapa jenis proses pertukaran sering juga digabungkan bersama. Misalnya untuk meringankan beban kolorn utama dari instalasi unggun campuran (untuk meningkatkan perforinansinya) dapat dipasang sebuah kolom pelunak air di depannya.

24

(Rahayu, 2009). 3. Kromatografi Eksklusi Molekular Pemisahan berbagai konstituen dengan meninjau perbedaann ukuran dan geometri molekul adalah dasar Kromatografi eksklusi. Peredaan ukuran

menyebabkan beberapa partikel bergerak lebih cepat dari yang lainya sehingga menimbulkaan perbedan permukaan migrasi. Kromatografi eksklusi dapat

dikelompokkan menjadi tiga kategori yaitu : a) Teknik permeasi gel atau filtrasi gel, b) Eksklus dan reterdasi ion c) Inorganic molecular sieves A. Teknik Permeasi atau Filtrasi Gel Teknik permeasi atau Filtrasi adalah suatu teknik yang menguraikan campuran zat-zat sesuai dengan ukuran molekulnya. Teknik ini didasari atas inklusi dan eksklusi suatu zat terlarut melalui suatu fase diam yang terbuat dari gel polimer yang terikat silang ddan berpori heterogen. Dalam kromatografi eksklusi cair-padat pemisahan teradi
25

antara vase cair di dalam partike gel dan cairan di luar mengelilingi partikel gel. Sebagai penunjang fase diam dalam pemisahan ini biasanya digunakan xerogelxerogel. Xerogel adalah suatu gel organik yang dapat bersifat hidrofilik (yaitu : agar dan dekstran yang terikat silang pada poliakrilamida) ataupun hidrofobik (poistirena). Xerogel-xerogel ini tersedia di pasaran dengan nama dagang biogel p-2 (poliakrilamida),sepadex G-10-200 (dekstran) juga styrogel (gel polistirena yang dimodifikasi) dan agarose. Kolom yang digunakan adalah kolom biaya pengelusi (luent) dibiarkan mengalir karena grafitasinya. Laju aliran akan bertambah dengan bertambahnya ukuran partikel seperti kromatografi pertukaran ion, laju aliran juga dapat dipengaruhi oleh variasi porositas gel. Untuk suatu gel yang tidak padat, volume interstisi dapat diturukan dengan pemberian tekanan, volume eluent berkisar antara 25 100 ml. sepertii juga metode kromatografi lainnya, konsekwensi efluaennya diukur melalui sifat-sifat fisik yang sesuai, seperti indeks refraksi, absorbansi, intensitaas pendar flour atau sifat-sifat listriknya. Pemisahann suatu tipe gel bergantung pada ukurran molekul dan sifat kimia dari zat yang akan dipisahkan. Misalkan biogel 0 10 digunakan untuk zat-zat dengan berat molekul berkisar antara 500-17000 satuan. Molekul dengan besar molekul diatas batas ini yaitu limit eksklusif, akan lewat saja tanpa rintangan dari gel. Di bawah limit eksklusi, zat tersebut akan terelusi pada volume elusi yang sesuai dengan volume bed total. Untuk bekerja dalam medium tidak berai, gel yang tepat digunakan adalah sephadex LH-20. Pemakain Kromatografi permeasi gel digunakan untuk analisis campran molekul dengan berat molkul yang berbeda seperti pemisahaan rafinosa, maltose, dengan menggunakan sephadex pada pH 7,0, laju aliran 5 ml/jam ddan H2O sebagai eluent. Pemisahan molekul- molekul dengan berat molekul sama dapat juga dilakukan dengan pemilihan yang tepat tipe gel dan tinggi kolomnya. Pengeluaran

26

garam (desalting) adalah salah satu pemisahan yang meliputi pembebasan garam dan senyawa berberat dengan molekul makro. B. Eksklusi dan reterdarsi ion Eksklusi ion adalah suatu proses untuk memisahkan materi ionic dari materi nonionic didasari pada perbedaan distribusi pada ke dua tipe zat pelarut ini di antara vase resin penukar ion dan larutan air. Jika suatu resin penukar ion diletakkan dalam larutan elektrolit encer atau dalam air, konsentrasi elektrolit pada kesetimbangan dalam fase resin akan lebih kecil dari pada larutan sekelilingnya yaitu fase luarnya, tetapi bila resin diletakkan dalam suatu larutan nondielektrolit (dalam air), maka nonelektrolit ini akan berubah untuk terdistribbusi secara merata pada kedua fase. Jadi sebenarnya tidak terjadi penukaran ion dalam peristiwa absobsi elektrolit dan elektrolit tersebut. Karena ke dua tipe zat terlarut ini dapat diekstraksi dari resin dengan hanya mengencerkan larutan laurnya (sekelilingnya). Dengan air. Jiak suatu latutan yang mengandung baik materi-materi ionic dan nonionic diletakkan pada bagian atas kolom berisi resin dan dicuci dengan air, materi ionic akan mengalir mengelilingi partikel resin sedang materi nonionic berdifusi kedalam pertikel-partikel resin dan masuk kedalam rongga-rongga kosong antara partikel resin. Laju perpindahan materi nonionic akiabatnya akan lebih rendah dari pada komponen ionicnya dan akan teramati komponen ionic muncul terlebih dahulu sebagai efluen. Jelasbahwa resin penukaran ion digunakan sebagai fase diam, dank arena tidak terjadi penukaran ion, resindapat dipakai terus-menerustanpa regenerasi. B.1. Mekanisme Eksklusi Ion Suatu resin penukaran ion tidaklah sama dengan absobsi biasa. Dengan mengatur jaringan muatan suatu resin, dapat diperoleh keadaan dimana hanya satu macam ion elektrolit yang dieksklusikan. Jumlah total elektrolit yang berdifusi kedalam resin dibatasi eloh prinsip elektronetralitas. Makin kuat terionisasi suatu resin penukaran makin efesien untuk eksklusi ion. Banyaknya garam yang erdifusi
27

kedalam resin berkurang dengan bertamnbahnya kapasitas penukar ion suatu resin. Sebagian besar ion elektrolit berberat elektrolit rendah yang mudah larut dalam air, bebas berdifusi kedalam dan keluar resin tidak peduli besarnya kapasitas resin, sehingga cenderung berkonsentrasi sama dengan ke dua fase saat kesetimbangan tercapai. B.2. Aplikasi Metode Ion Eksklusi Gula dan garam tidak dapat dipisahkan dengan metode ini karena ukuran dan ketidakmampuanya relative dari molekul sukrosa dan glukosa untuk berdifusi secara cepat kedalam fase resin. Pemisahan elektrolit kuat dan molekul netral paling baik dicapai dengan metode eksklusi ion, misalnya pemisahan NaCl dan etilen glikol, HCl dan HC3COOH, CH3COOH; NaCl dan etano. Riechenberg telah menggunakan teknik ini untuk pemisahan anggota deret Homolog, misalkan pemisahan asam asetat dan asam n- butirat. Gugusan sulfanat yang bersiafat asam pada resin penukaran ion, dapat menghasilkan efek garam pada materi organic dan cenderung untuk menehan efek absorbsi matriks resin. Oleh karena itu rieman menggunakan larutan garam sebagai pengganti larutan H2O untuk eluen dalam memisahkan methanol, etanol dan propanol. Efek yang menguntungkan adanya garam dalam eluen adalah efek garam selektif terhadap komponen nonionic dari fase larutannya. C. Molekular sieve anorganic Zeolit Zeolit alam dan sintesis membentuk suatu saringan molekul untuk pemisahan gas-gas dan molekul organic berukuran organic berukuran kecil. Volume suatu zeolit terbentuk dari suatu rongga-romgga yang saling dihungbungkan dengan saluransaluran (channels). Penyaringan dan aksi penghambatan dari saluran dikombinasikan dengan aktifitas adsobsi permukaan matriks Kristal sehingga memungkinkan digunakannya zeolit untuk memisahkan molekulmolekul yang lebih kecil dari ukuran saluran ini dari molekul yang lebih besar ukurannya dari ukuran saluran. Aktifitas permukaan dan geometris molecular berperanan dalam pemisahan ini.
28

Secara structural zeolit adalah rangka tetrahedral yang bersatu membetuk struktur sarang tawon dengan rongga-rongga besar yang saling berhubungan melalui saluransaluran kecil. Penampang lintang dari saluran inilah yang menentukan ukuran molekul yang dapat masuk ke dalam rongga-rongga. Ukuran dari posisi ion logam (misal Na, Ca) dalam Kristal zeolit,dan tipe struktur jaringan rangka tetra hedral alumina silica zeolit menentukan diameter efektif dari saluran-saluran tersebut. Beberapa macam tipe zeolit, misalkan tipe molecular sieve 4A adalah [Na12 (AlO2)12 (SiO2)12]. Molekul berdiameter lebih kecil dari 4A akan terabsorbsi, misalkan H2O, CO2, H2S, SO2dan hidrokarbon borongga 1-2 atom karbon. Etana dapat masuk kedalam molecular sieve 5A, yang dibuat dari molecular sieve 4A dengan menggantikan Na oleh Ca dan K. paraffin lantai lurus dapat masuk kedalamnya, demikian juga alcohol sampai dengan C 4, tetapi siklopropana tidak dapat masuk. Demikian juga asam naftanik dan olekul aromatic lainya. Tipe 10 x dan 13 x adalah Na8 (AlO2)80 (SiO2)106. Mereka mengabsobsi molekul berdiameter sampai 10 A. Molecular sieve mempunyai afinitas lebih besar terhadap molekul polar dan senyawa yang berpolarisasi karena induksi pada molekul nonpolar yang berukuran sama. Molekul-molekul polar tertahan dengan kuat dalam rongga Kristal. Pada pemurnian dan industry gas, molekul sieve digunakan untuk menghilangkan molekulmolekul tidak jenuh (polar). Zeolit digunakan juga sebagai medium berlangsungnya reaksi. Bahan kimia didalamnya sebagai hasil reaksi dapat dikeluarkan dengan menggunakan teknik vakum atau dengan pergeseran menggunakan materi yang berabsorbsi kuat, misalkan air. Molecular sieve ini dapat diaktifkan kemali dengan peanasan 200-3500 C. mereka juga digunakan dalam kromatografi gas padat sebagai fase diamnya dalam kolom.

4. Kromatografi Permeasi Gel (KPG)

29

Kromatografi gel merupakan metode kromatografi baru, meliputikromatografi eksklusi, kromatogeafi penyaring gel, dan kromatografi permeasigel. Kromatografi ini paling mudah dimengerti dan paling mudah dikerjakan.Selain kesederhanaannya, teknik ini sangat berguna. Metode ini dapat digunakan terhadap suatu cuplikan yang larut dan pengguna utama kromatografi gel biasanya dalam salah satu dari tiga hal ini. Pertama, kromatografi gel sangat berguna untuk untk pemisahan spesies

dengan berat molekul tinggi (BM >2000), terutama yang tak terionkan. Selain dari resolusidari setiap makromolekuler seperti protein dan asam nukleat, kromatografi gel dapat digunakan untuk mendapatkan distribusi berat molekul dari polimer sintetis. Kedua, campuran sederhana dapat dipisahkan secara mudah dengan kromatografi gel, terutama jika penyusun campuran itu memiliki berat molekul yang sangat berbeda. Untuk hal ini dapat dilakukan dalam jumlah besar. Ketiga, kromatografi gel sangat cocok untuk kerja awal, yaitu untuk mengeksplorasi cuplikan yang tidak diketahui. Pemisahan ini memberikan gambaran isi cuplikan, sehingga dapat diketahui dengan cepat apakah cuplikan itu memiliki berat molekul rendah atau tinggi.

Kromatografi gel memiliki beberapa keuntungan dalam penggunaannya: 1. Pita-pita sempit. 2. Waktu pemisahan pendek. 3. Waktu pemisahan mudah diramalkan. 4. Harga Tr sesuai dengan ukuran cuplikan. 5. Tidak terjadi kehilangan cuplikan atau reaksi selama pemisahan. 6. Hanya terjadi sedikit masalah dalam deaktivasi kolom.
30

Kromatografi gel juga memiliki kelemahan: 1. Kapasitas terbatas. 2. Tidak dapat digunakan untuk cuplikan yang mempunyai ukuran hampir sama. 3. Kapasitas puncak yang terbatas. Ini berarti hanya ada sedikit pita yang dapat dihubungkan dengan kromatogramtotal, karena kromatogram cukup pendek semua senyawa terelusi sebelum. Pada kromatografi gel jarang terlihat lebih dari enam pita pada satu kromatogram. Ini berarti bahwa kromatografi gel biasanya tidak dapat memisahkan secara sempurnasuatu cuplikan kompleks, tanpa pemisahan lebih lanjut dengan metode lain. Kekurangan kedua adalah tidak dapat memisahkan senyawa-senyawa yangmempunyai ukuran hampir sama. Hal ini menyingkorkan kromatografi gel dalam banyak masalah pemisahan senyawa yang penting, termasuk pemisahan isomer. Perbedaan pada kromatografi gel adalah prinsip pemisahan yang berbeda denganyang digunakan metode kromatografi lain. Konsep factor pemisahan , dan factor kapasitas k tidak bisa digunakan. Susunan fasa gerak juga relative tidak penting pada kromatografi gel.Pengelompokkan berbagai penggunaan kromatografi gel biasanya dibagidalam dua teknik yaitu teknik filtrasi gel (pelarut air) dan kromatografi permeasigel (pelarut oragnik).1.Fasa DiamPemisahan dalam kromatografi gel sebagian besar ditentukan oleh jenisfasa diam yang digunakan. Oleh karena itu, pemilihan gel atau fasa diam untuk suatu pemisahan merupakan suatu langkah penting. Fasa diam yang digunakan untuk kromatografi gel merupakan bahan dalam ukuran pori berbeda-beda dimana setiap ukuran cocok untuk pemisahan

senyawa yang tertentu berat molekulnya. Kebanyakan kromatografi permeasi gel digunakan fasa diam polistirena berpori yang mempunyai ikatansilang divinil benzena. Poragel dan Bio-Bead dapat untuk memisahkan senyawayang relative kecil sampai dengan berat molekul sekitar 20.000. Styragel untuk memisahkan

31

senyawa besar dengan berat molekul 20 juta. Gel vinil asetat berporiserupa dengan gel polistirena, tetapi untuk senyawa dengan berat molekul rendah.

Kromatografi permeasi gel ( KPG ) dengan pelarut organic juga dapat

dikerjakan

dengan fasa diam kaku dari silica atau gelas berpori. Bahan ini lebihstabil daripada gel organic dan pengisian kolompun lebih mudah. Tetapi kerapkali memberikan retensi yang jelek karena terjadi serapan oleh permukaan silica. 5. Kromatografi Adsorpsi Metode ini banyak digunakan untuk analisis biokimia dan organik. Teknik pelaksanaannya dilakukan dengan kolom. Sebagai fasa diam di dalam kolom dapat dipilih salika gel atau alumina. Kekurangan metode kromatografi cair-padat ini antara lain ialah: (a) pilihan fasa diam (adsorben) terbatas; (b) koefisien distribusi untuk serapan seringkali tergantung pada kadar total. sehingga pemisahannya kurang sempurna.

Pembagian kromatografi berdasarkan jenis pendukungnya adalah sebagai berikut: 1. Kromatografi Lapis Tipis Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat pendarflour. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Kromatogram

32

Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada garis di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan menggunakan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram dibentuk. Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada di bawah garis dimana posisi bercak berada. Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut. Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna.

33

Gambar lempengan setelah pelarut bergerak setengah dari lempengan

Pelarut dapat mencapai sampai pada bagian atas dari lempengan. Ini akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen yang berwarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam. Perhitungan nilai Rf Sering kali pengukuran diperoleh dari lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang tempuh oleh bercak warna masingmasing. Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan. Pengukuran berlangsung sebagai berikut:

34

Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut: Rf= jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut

Jika substansi yang ingin dianalisis tidak berwarna, ada dua cara untuk menyelesaikan analisis sampel tersebut : Menggunakan pendarflour Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi yang ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar ultraviolet (UV). Itu berarti jika diberikan sinar berpendar. Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa jika anda menyinarkan sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap. dengan sinar UV, akan

35

Sementara UV tetap disinarkan pada lempengan, anda harus menandai posisi-posisi dari bercak-bercak dengan menggunakan pinsil dan melingkari daerah bercak-bercak itu. Seketika anda mematikan sinar UV, bercak-bercak tersebut tidak tampak kembali. Penunjukkan bercak secara kimia Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-bercak menjadi tampak dengan jalan mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino. Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat atau ungu.

Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal iodium. Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan.

36

Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal iodium. Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan. Penggunaan kromatografi lapis tipis untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa Anggaplah anda mempunyai campuran asam amino dan ingin menemukan asam amino-asam amino tertentu yang terkandung didalam campuran tersebut. Untuk sederhananya, mari kira berasumsi bahwa anda mengetahui bahwa campuran hanya mungkin mengandung lima asam amino. Setetes campuran ditempatkan pada garis dasar lempengan lapis tipis dan bercak-bercak kecil yang serupa dari asam amino yang telah diketahui juga ditempatkan pada disamping tetesan yang akan diidentifikasi. Lempengan lalu ditempatkan pada posisi berdiri dalam pelarut yang sesuai dan dibiarkan seperti sebelumnya. Bagian kiri gambar menunjukkan lempengan setelah pelarut hampir mencapai bagian atas dari lempengan. Bercak-bercak masih belum tampak. Gambar kedua menunjukkan apa yang terjadi setelah lempengan disemprotkan ninhidrin.

37

Tidak diperlukan menghitung nilai Rf karena anda dengan mudah dapat membandingkan bercak-bercak pada campuran dengan bercak dari asam amino yang telah diketahui melalui posisi dan warnanya. Dalam mengandung asam amino 1, 4 dan 5. Bagaimana jika campuran mengandung lebih banyak asam amino daripada asam amino yang digunakan sebagai perbandingan? Ini memungkinkan adanya bercak-bercak dari campuran yang tidak sesuai dengan asam amino yang dijadikan perbandingan itu. Anda sebaiknya mengulangi eksperimen menggunakan asam amino lain sebagai perbandingan. Bagaimana kromatografi lapis tipis berkerja? Fase diam-jel silika Jel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan jel silika, atom silikon berlekatan pada gugus -OH. Jadi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. Gambar ini menunjukkan bagian kecil dari permukaan silika. contoh ini, campuran

38

Permukaan jel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Apa yang kita sebutkan tentang jel silika kemudian digunakan serupa untuk alumina. Apa yang memisahkan senyawa-senyawa dalam kromatogram? Ketika pelarut mulai membasahi lempengan, pelarut pertama akan melarutkan senyawa-senyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis dasar. Senyawasenyawa akan cenderung bergerak pada lempengan kromatografi sebagaimana halnya pergerakan pelarut. Bagaimana cepatnya senyawa-senyawa dibawa bergerak ke atas pada lempengan, tergantung pada:

Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut. Hal ini bergantung pada bagaimana besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.

Bagaimana senyawa melekat pada fase diam, misalnya jel silika. Hal ini tergantung pada bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan jel silika. Anggaplah bercak awal mengandung dua senyawa, yang satu dapat

membentuk ikatan hidrogen, dan yang lainnya hanya dapat mengambilbagian interaksi van der Waals yang lemah. Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan melekat pada jel silika lebih kuat dibanding senyawa lainnya. Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap lebih kuat dari senyawa yang lainnya. Penjerapan merupakan pembentukan suatu

39

ikatan dari satu substansi pada permukaan. Penjerapan bersifat tidak permanen, terdapat pergerakan yang tetap dari molekul antara yang terjerap pada permukaan jel silika dan yang kembali pada larutan dalam pelarut. Dengan jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama waktu terlarut dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada jel silika-untuk sementara waktu proses penjerapan berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa senyawa. Itu berarti bahwa semakin kuat senyawa dijerap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke atas lempengan. Dalam contoh yang sudah kita bahas, senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan menjerap lebih kuat daripada yang tergantung hanya pada interaksi van der Waals, dan karenanya bergerak lebih jauh pada lempengan. Bagaimana jika komponen-komponen dalam campuran dapat membentuk ikatan-ikatan hidrogen? Terdapat perbedaan bahwa ikatan hidrogen pada tingkatan yang sama dan dapat larut dalam pelarut pada tingkatan yang sama pula. Ini tidak hanya merupakan atraksi antara senyawa dengan jel silika. Atraksi antara senyawa dan pelarut juga merupakan hal yang penting-hal ini akan mempengaruhi bagaimana mudahnya senyawa ditarik pada larutan keluar dari permukaan silika. Bagaimanapun, hal ini memungkinkan senyawa-senyawa tidak terpisahkan dengan baik ketika anda membuat kromatogram. Dalam kasus itu, perubahan pelarut dapat membantu dengan baik termasuk memungkinkan perubahan pH pelarut.

2. KLT Preparatif KLT preparatif pada dasarnya, prinsip kerjanya sama dengan KLT. Tetapi, tujuan dilakukannya berbeda, yaitu untuk memisahkan senyawa dari fraksinya

(pemisahan isolat). Perbedaan lainnya terletak pada ketebalan pelat atau lapisan

40

absorbannya, di mana pada KLT biasa untuk analisis ukurannya berkisar antara 0,10,25 mm, sedangkan untuk KLT preparatif berkisar antara 0,5-2,0 mm.

Prinsip dari KLT preparatif ini yaitu berdasarkan perbedaan kemampuan masing-masing senyawa dalam berinteraksi dengan fase diam dan kelarutan dalam pengembann yang digunakan. Pengembang yang digunakan biasanya merupakan campuran dari berbagai jenis pelarut dengan tujuan melakukan pemisahan

berdasarkan kepolaran dan kelarutan terhadap pengembang tersebut.

3. Kromatografi Kertas Mekanisme pemisahan dengan kromatografi kertas prinsipnya sama dengan mekanisme pada kromatografi kolom. Adsorben dalam kromatografi kertas adalah kertas saring, yakni selulosa. Sampel yang akan dianalisis ditotolkan ke ujung kertas yang kemudian digantung dalam wadah. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan kedalam pelarut yang mengisi dasar wadah. Fasa mobil (pelarut) dapat saja beragam. Air, etanol, asam asetat atau campuran zat-zat ini dapat digunakan.

41

Kromatografi kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino dengan sukses besar. Karena asam amino memiliki sifat yang sangat mirip, dan asam-asam amino larut dalam air dan tidak mudah menguap (tidak mungkin didistilasi), pemisahan asam amino adalah masalah paling sukar yang dihadapi kimiawan di akhir abad 19 dan awal abad 20. Jadi penemuan kromatografi kertas merupakan berita sangat baik bagi mereka. Kimiawan Inggris Richard Laurence Millington Synge (1914-1994) adalah orang pertama yang menggunakan metoda analisis asam amino dengan kromatografi kertas. Saat campuran asam amino menaiki lembaran kertas secara vertikal karena ada fenomena kapiler, partisi asam amino antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada selulosa berlangsung berulang-ulang. Ketiak pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai R, masing-masing asam amino diidentifikasi. Kromatografi kertas dua-dimensi (2D) menggunakan kertas yang luas bukan lembaran kecil, dan sampelnya diproses secara dua dimensi dengan dua pelarut.

Gambar Contoh hasil kromatografi kertas pigmen 4. Kromatografi Kolom Kromatografi kolom adalah teknik pemisahan dimana fase diam berada dalam tabung berupa cairan. Partikel dari fase diam padat atau dilapisi pendukung dengan
42

fase diam cair dapat mengisi semua volum dari tabung (packed volumn) atau terkonsentrasi sepanjang dinding tabung meninggalkan bekas yang terbatas dari fase gerak pada bagian tengah tabung. Teknik ini dilakukan berdasarkan perbedaan kecepatan gerak senyawa melewati medium (fase diam).

Kromatografi ini dilakukan untuk memisahkan atau menganalisa senyawa dari fraksi yang telah dipisahkan dari tumbuhan, dimana senyawa tersebut bersifat nonvolatil dalam jumlah lebih besar.

5. Kromatografi Cair Vakum Kromatografi Cair Vakum (KCV) biasa disebut juga sebagai fast chromatography. KCV adalah Kromatografi kolom yang dipercepat dengan penggunaan vakum/penyedot. Efek dari vakum atau pompa ini akan mengurangi tekanan dan meningkatkan kecepatan alir dari pelarut. Kromatografi ini dilakukan berdasarkan perbedaan kemampuan migrasi diferensial senyawa melewati fase diam. Di dalam kolom karena perbedaan kemampuan partisi dan kelarutan senyawa menyebabkan pemisahan melewati fase diam berupa pita-pita kemudian keluar

43

meninggalkan kolom dan ditampung kemudian dideteksi. KCV biasa digunakan untuk pengisolasian/pemurnian senyawa, analisis kualitatif dan kuantitatif senyawa, dan cocok untuk senyawa nonvolatil.

6. HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY) Liquid chromatography atau LC atau kromatografi cair merupakan teknik pemisahan yang meliputi penempatan (injeksi) volume kecil dari sampel cair (liquid) ke dalam sebuah tabung dengan partikel yang terserap (fase diam) di mana komponen individual dari sampel bergerak sepanjang tabung (kolom) yang terisi oleh cairan dengan gaya gravitasi.

HPLC meliputi injeksi volume kecil dari sampel cairan (liquid) ke dalam tabung atau kolom dengan partikel yang kecil (berdiameter 3-5 mikron (m) disebut juga sebagai fase diam) dimana komponen individual dari sampel bergerak ke bawah pada kolom dengan cairan/liquid (fase gerak) sekuatnya/dipaksa melewati kolom dengan tekanan tinggi dari pump (pompa). Komponen yang terpisahkan sedikit demi

44

sedikit oleh pemenuhan kolom yang meliputi berbagai interaksi kimia dan/atau fisika antara molekul-molekul tersebut dan partikel packing (yang mengisi tabung). Komponen yang dipisahkan dideteksi pada lubang keluar dari tabung tersebut (kolom) oleh detektor yang mengukur jumlahnya. Hasil dari detektor disebut liquid chromatogram. Pada prinsipnya, kerja HPLC hampir sama dengan LC kecuali pada perbedaan kecepatan, efisiensi, sensitifitas, dan kemudahan dalam penggunaan HPLC yang lebih unggul daripada LC.

Kegunaan metode ini : Bagus untuk identifikasi senyawa yang nonvolatil atau senyawa yang tidak tahan panas Analisis kualitatif dan kuantitatif senyawa tunggal dalam sampel Pembuatan komponen murni Trace analysis

Gambar-gambar dari alat HPLC :

Modular HPLC System Basic Configuration

45

Modular HPLC System High-end configuration

Integrated HPLC System all parts in one box

46

BAB III PENUTUP

Simpulan Kromatografi adalah teknik pemisahan fisik suatu campuran zat-zat kimia yang berdasar pada perbedaan migrasi dari masing-masing komponen campuran yang terpisah pada fase diam di bawah pengaruh pergerakan fase gerak. Kromatografi dapat dibagi menjadi beberapa golongan, yaitu sebagai berikut: Berdasarkan fase gerak dan fase diamnya Kromatografi cair-padat, kromatografi gas-padat, kromatografi cair-cair, dan kromatografi gas-cair Berdasarkan fase geraknya Kromatografi gas dan kromatografi cair Berdasrkan mekanisme pemisahan Kromatografi adsorpsi, kromatografi partisi, kromatografi penukar ion, kromatografi saringan gel, kromatografi eksklusi molekular Berdasarkan jenis pendukungnya Kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, KLT preparatif, kromatografi kolom, dan kromatografi cair-vakum Berdasrakna arah pengembangannya Kromatografi horizontal, kromatografi vertikal menaik, kromatografi vertical menurun, kromatografi sirkular, dan kromatografi dua arah.

47

DAFTAR PUSTAKA

Clark, J. 2007. Kromatografi Gas Cair. Available online at http://www.chem-istry.org/materi_kimia/instrumenanalisis/kromatografi1/kromatografi_gas_cair/ Darmstadt. 2012. Kromatografi. Available online at : http://www.merckmillipore.co.id/chemicals/ion-exchange-chromatogrphy chromatography/c-bX2b.s1OgRsAAAEsnHJV6TsS Harwood, Laurance M., Chistoper J. Moody. 1989. Experimental organic chemistry : Principles and Practice. New York : WilleyBlackwell. Rahayu, S.S .2009. Available online at http://www.chem-istry.org/materi_kimia/kimia- industri/utilitas-pabrik/mengoperasikan-alatpenukar-ion/ Synder, L.R., J.J. Kirkland, dan J.L. Glajch. 1997. HPLC Method Development. New York : John Willey & Sons. Takeuchi,Y. 2009. Available online at http://www.chem-is-try.org/materi kimia/kimia dasar/ pemurnian material/kromatografi/

Wiryawan, A. 2011. Kromatografi Cair (Liquid Chromatography). Available online at: http://www.chem-is-try.org/materi kimia/kromatografi cair vakum/ pemurnian material/hldkj28875skilhg2345y.hhjgorg/

48