TABLA DE DATOS Y ANALISIS DE RESULTADOS

TIEMPO (min) 10 20 30 40 50 ABS AMILASA (A) 1,059 1,323 1,187 1,393 1,308 ABS GLUCOAMILASA (B) 2,070 2,467 2,640 2,796

DATOS CURVA DE CALIBRACION DEL MTODO DNS

ABS TEORICA 0,000 0,441 0,818 0,971 1,643 2,03 2,591 PPM DE GLUCOSA 0,000 501,3 1002,6 1503,9 2005,2 2506,5 3007,8

PPM GLUCOSA Vs. ABS

3500 3000 PPM GLUCOSA 2500 2000 1500 1000 500 0 0 1 ABS 2 3 Series1 Linear (Series1) y = 1172.9x + 80.705 R = 0.984

RESULTADOS - AMILASA (A) Para la obtencin de esta grfica, se debe tomar la ecuacin hallada en la de la curva patrn siendo X a la absorbancia experimental y Y la concentracin de biomasa expresada en ppm. Y= 1172,9x +80,705 Para hallar la concentracin de glucosa en ppm que es Y, se reemplaza en X la absorbancia medida durante la prctica.
TIEMPO (min) 0 10 20 30 40 50 ABS AMILASA (A) 0 1,059 1,323 1,187 1,393 1,308 CONCENTRACION DE GLUCOSA (ppm) 0 1322,8511 1632,4967 1472,9823 1714,5997 1614,9032 CONCENTRACIN GLUCOSA (mmol/L) 0 7,34917278 9,06942611 8,183235 9,52555389 8,97168444

Por estequiometria y teniendo en cuenta las unidades de ppm (mg/L) se pasa a g/L, donde el peso molecular de la glucosa es 180 g/mol

Tiempo Vs. Concentracin Glucosa

12 10 8 6 4 2 0 0 10 20 30 Tiempo (min) 40 50 Glucosa (mmol /L) y = -0.0073x2 + 0.5106x + 1.1339 R = 0.8706

Series1 Poly. (Series1) 60

Para hallar la velocidad de reaccin enzimtica (Vrxn) de la amilasa, de la ecuacin obtenida de la regresin polinmica saco la primera derivada y evalo en t=0, la ecuacin es la siguiente: y= -0,0037x2 + 0,5106x + 1,1339 Sacando primera derivada: y=- 0,0074x + 0,5106 Evaluando t=0, se obtiene la Vrxn enzimtica de la amilasa: Vrxn amilasa= 0,5106 mmol /L*min

RESULTADOS DE GLUCOAMILASA De la ecuacin obtenida de la curva patrn del mtodo DNS, se halla la concentracin de glucosa (ppm), siendo X la absorbancia y Y la respectiva concentracin. y= 1172,9x +80,705
TIEMPO (min) 0 10 20 30 40 ABS GLUCOAMILASA (B) 0 2,070 2,467 2,640 2,796 CONCENTRACION DE GLUCOSA (ppm) 0 2508,653 2974,2943 3177,206 3360,1784 CONCENTRACIN GLUCOSA (mmol/L) 0 13,9369611 16,5238572 17,6511444 18,6676578

Por estequiometria y teniendo en cuenta las unidades de ppm (mg/L) se pasa a g/L, donde el peso molecular de la glucosa es 180 g/mol.

Glucosa Vs. Tiempo

4000 3500 Glucosa (ppm) 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 10 20 30 40 50 Tiempo (min) Series1 Poly. (Series1) y = -3.5101x2 + 214.29x + 224.27 R = 0.9419

Para hallar la velocidad de reaccin enzimtica (Vrxn) de la glucoamilasa, de la ecuacin obtenida de la regresin polinmica saco la primera derivada y evalo en t=0, la ecuacin es la siguiente: y= -3,5101x2 + 214,29x + 224,27 Sacando primera derivada: y=- 7,0202x + 214,29 Evaluando t=0, se obtiene la Vrxn enzimtica de la amilasa:

Vrxn amilasa= 214,29 mmol /L*min En la prctica se evidencia la actividad enzimtica de cada enzima para la obtencin de glucosa en la hidrlisis del almidn, donde se indica tericamente que para llevar a cabo una hidrlisis enzimtica es necesario el uso de dos enzimas, ya que la -amilasa solo logra una hidrlisis parcial y la glucoamilasa se encarga de lograr la hidrlisis total del almidn, fraccionando satisfactoriamente la glucosa. Con la -amilasa solo se logra el desdoblamiento de los enlaces glucosdicos 1,4 los cuales dan fragmentos ms amplios de glucosa, esta tuvo una velocidad de reaccin 0,5106 mmol /L*min y muestra concentraciones relativamente bajas de glucosa. A su vez, con la glucoamilasa se logra el desdoblamiento de los enlaces glucosdicos restantes que no se lograron hidrolizar con la -amilasa, con esta se obtienen fragmentos ms pequeos razn por la cual aumenta la concentracin de glucosa hidrolizada del almidn, esta tuvo una velocidad de reaccin de 214,29 mmol /L*min. Comparando ambos procesos, se observa que la -amilasa presenta una velocidad de reaccin menor e hidroliza en menor concentracin la glucosa, a diferencia de la glucoamilasa que al tener una mayor velocidad de reaccin hidroliza una concentracin mayor de glucosa. Todo esto se debe a que la amilasa no aumenta los azucares reductores sino que se encarga de degradar el almidn en azcares solubles y como el objetivo de la practica era obtener en mayor cantidad glucosa por esto la velocidad de reaccin de la glucoamilasa o como se conoce comercialmente amiloglucosidasa es mayor, por que esta enzima es la que se encarga de la formacin de los azucares reductores. Esto indica que la velocidad de reaccin es determinante para poder analizar de cierta manera si la concentracin hidrolizada, ya que en la primera etapa al tenerse una menor velocidad de reaccin se obtuvo una menor concentracin requirindose ms tiempo para hidrolizar el resto de enlaces glucosdicos si se utilizar solo la -amilasa. Lo contrario pasa con la glucoamilasa, pero esta requiere la activacin previa por la -amilasa, pero en tiempo esta tiene una mejor actividad ya que hidroliza una mayor concentracin de glucosa en un tiempo menor.

GRAFICO ABS Vs. TIEMPO

TIEMPO (min) 10 20 30 40 50 ABS AMILASA (A) 1,059 1,323 1,187 1,393 1,308 ABS GLUCOAMILASA (B) 2,070 2,467 2,640 2,796

ABS Vs. TIEMPO

3 2.5 2 ABS 1.5 1 0.5 0 0 10 20 30 Tiempo (min) 40 50 60 amilasa Glucoamilasa

La glucoamilasa presenta un mejor comportamiento en el tiempo en la hidrlisis del almidn, sin embargo esta requiere de la previa activacin de la amilasa para lograr este comportamiento y llegar a la hidrlisis total. La absorbancia mayor me indica que hay una mayor concentracin de glucosa, debido a que esta se satura y existe una turbidez superior, por tal razn se corrobora lo de la teora en donde la glucoamilasa hidroliza en fragmentos ms pequeos el almidn obteniendo una mayor concentracin de glucosa en el medio y aumentando como se ya se dijo la turbidez.

PREGUNTAS 1. Explique en qu consisten los siguientes procesos GELATINIZACIN: Los grnulos de almidn son insolubles en agua fra, pero pueden contener agua al aumentar la temperatura, es decir los grnulos de almidn sufren el proceso denominado gelatinizacin o gelificacin. Durante la gelatinizacin se produce la lixiviacin de la amilosa, la gelatinizacin total se produce normalmente dentro de un intervalo ms o menos amplio de temperatura, siendo los grnulos ms grandes los que primero gelatinizan. Los diversos estados de gelatinizacin pueden ser determinados y son: la temperatura de iniciacin (primera observacin de la prdida de birrefrigerancia), la temperatura media, la temperatura final de la prdida de birrefrigerancia (TFPB, es la temperatura a la cual el ltimo grnulo en el campo de observacin pierde su birrefrigerancia), y el intervalo de temperatura de gelatinizacin. Al final de este fenmeno se genera una pasta en la que existen cadenas de amilosa de bajo peso molecular altamente hidratadas que rodean a los agregados, tambin hidratados, de los restos de los grnulos. LICUEFACCION Es la hidrlisis del almidn a maltodextrinas mediante el rompimiento el rompimiento de los enlaces glucosdicos internos de la molcula del almidn, produciendo molculas de diferentes nmero de unidades de glucosa, la amilasa transforma la glucosa que es el producto de la licuefaccin. SACARIFICACIN Proceso por el cual se transforman mediante hidratacin las sustancias sacargenas en azcar. Tambin mediante ataque a los enlaces glucosdicos de los extremos no reductores se libera una molcula de glucosa.

2. Identifique plenamente cundo se dieron estos tres procesos durante el transcurso de la prctica y analice si se dieron simultneamente o por separado. R/ La gelatinizacin del almidn es una de las etapas que ms se evidenci durante el transcurso de la practica, ya que a medida que aumentaba la temperatura la consistencia de la maicena en el agua iba cambiando hacindose ms viscosa, esto se debe a que los enlaces glucosdicos se rompen mostrando una apariencia semicristalina, esto se ve claramente ya que mientras alcanza la temperatura de 80C se forma un gel de color como blanco corroborando esto el proceso de gelatinizacin que si se da durante esta hidrlisis. As mismo, la licuefaccin se da en el momento que se adiciona la -amilasa, donde se inicia el desdoblamiento de la glucosa ya que esta es considerada la enzima licuante por excelencia debido a que desdobla rpidamente los enlaces glucosdico, disminuyendo a su vez su poder reductor.

Ambos procesos se dieron por separado, ya que primero se dio la gelatinizacin debido a que esta tena que llegar a una temperatura alta en la cual si se adicionaba la enzima en este punto esta se iba a desnaturalizar y no realizara el proceso que se requera que es el desdoblamiento del almidn en glucosa, por ello es conveniente la adicin de esta despus de la gelatinizacin, y as se de una licuefaccin ms eficiente. 3. Interprete los datos de la evaluacin sensorial? R/ En la prctica no se realiz la prueba sensorial, ya que no se vio necesario llevar a cabo este punto. 5. Explique con sus propias palabras el sentido fsico del equivalente de dextrosa (ED) y su importancia prctica? R/ El trmino "equivalente de dextrosa", DE, con el que se expresa la concentracin de estos jarabes no es exactamente el contenido de glucosa, sino el poder reductor considerando que todo el carbohidrato presente fuera glucosa. Es decir, el "equivalente de dextrosa" de un jarabe es el contenido de glucosa, ms 1/2 del contenido de maltosa, mas 1/3 del contenido de maltotriosa, etc. En otras palabras, es el trmino en que se mide el grado de conversin de almidn de D-glucosa (Dextrosa). ED= [glucosa (Azcar reductor)[ / [Peso seco total]

6. Utilizando las diferentes definiciones que se reportan en la literatura sobre el Equivalente Dextrosa (ED), analice si se puede calcular este parmetro para las dos reacciones estudiadas. En caso de no ser posible, explique qu se debe hacer para hallar el ED. R/ La Dextrosa equivalente se define como azcares reductores expresados como Dextrosa. En la practica realizada no es posible determinar el equivalente de dextrosa ya que no se utilizo un blanco en el mtodo de DNS para poder determinar los azucares reductores y tampoco se hayo el factor de Fehling. Pero el clculo de puede realizar de la siguiente manera: CLCULO DEL % DE DEXTROSA EQUIVALENTE Factor de Fehling x 500 x 100 % Azcares Reductores =_________________________________ AxG A = ml gastados en la segunda titulacin G = gramos de muestra problema % de Substancia Seca = 100 % - % humedad.

% Azcares Reductores x 100 %de Dextrosa Equivalente =________________________________ % Substancia Seca

7. Compare los resultados obtenidos de las velocidades de reaccin enzimtica utilizando el mtodo analtico. R/ Con la -amilasa solo se logra el desdoblamiento de los enlaces glucosdicos 1,4 los cuales dan fragmentos ms amplios de glucosa, esta tuvo una velocidad de reaccin 0,5106 mmol /L*min y muestra concentraciones relativamente bajas de glucosa. A su vez, con la glucoamilasa se logra el desdoblamiento de los enlaces glucosdicos restantes que no se lograron hidrolizar con la -amilasa, con esta se obtienen fragmentos ms pequeos razn por la cual aumenta la concentracin de glucosa hidrolizada del almidn, esta tuvo una velocidad de reaccin de 214,29 mmol /L*min. Comparando ambos procesos, se observa que la -amilasa presenta una velocidad de reaccin menor e hidroliza en menor concentracin la glucosa, a diferencia de la glucoamilasa que al tener una mayor velocidad de reaccin hidroliza una concentracin mayor de glucosa. Todo esto se debe a que la amilasa no aumenta los azucares reductores sino que se encarga de degradar el almidn en azcares solubles y como el objetivo de la practica era obtener en mayor cantidad glucosa por esto la velocidad de reaccin de la glucoamilasa o como se conoce comercialmente amiloglucosidasa es mayor, por que esta enzima es la que se encarga de la formacin de los azucares reductores. 9. Proponga un procedimiento para realizar la hidrlisis cida del almidn y poder comparar as las ventajas de la hidrlisis enzimtica. R/ Se prepara el almidn, ya sea lavndolo o adicionndole agua dependiendo del estado inicial de este. El pH es llevado a 0,8 con una solucin de cido sulfrico al 20%V/V, la hidrlisis se realiza en un reactor de vidrio de 2 litros, a 84C, presin atmosfrica, agitacin de 395 rpm y condensacin para mantener el volumen de efectivo de trabajo constante, el reactor es sumergido en un bao mara por 6 horas tomando muestras de 10 ml cada hora para realizar seguimiento de la hidrlisis. Se determinan azucares reductores por el mtodo de DNS, y el grado de hidrlisis con el mtodo del lugol. La hidrlisis cida logra una hidrlisis total del almidn, sin embargo por el uso del HCl puede dejar trazas y ser ligeramente txico, por otro lado, la hidrlisis enzimtica requiere dos etapas y el uso de dos enzimas para la hidrlisis total. La ventaja de la hidrlisis enzimtica es el tiempo que esta requiere para lograrse, ya que la cida necesita alrededor de 6 horas para lograr el objetivo, y a pesar que la enzimtica requiere dos etapas esta se reduce casi que a la mitad del tiempo para hidrolizar.

CONCLUSIONES La hidrlisis enzimtica se da en dos etapas para que se pueda hidrolizar totalmente, teniendo la primera una velocidad de reaccin menor que la segunda razn por la cual, la segunda enzima utilizada produce una mayor concentracin de glucosa. La alfa amilasa tiene una mayor duracin en la hidrlisis del almidn si esta se utilizar para llevar a trmino este proceso, esto se da porque la alfa amilasa no degrada azcares reductores. Si se deseara hidrolizar el almidn en azcares solubles, la alfa amilasa tendra una mayor efectividad debido a que esta es encargada de cortar los enlaces glucosdicos de tal manera que se formen estos azcares. La glucoamilasa es especfica para la obtencin de azcares reductores y esto se evidenci durante la prctica donde con esta se obtuvo una mayor concentracin de glucosa en poco tiempo. Las velocidades de reaccin pueden ser un indicador de la posible concentracin de producto que se espera, ya que si esta disminuye por lo tanto la actividad enzimtica baja y la concentracin de producto tambin disminuye. Hubo diferencia significativa entre las velocidades de reaccin enzimtica entre ambas enzimas utilizadas, al igual que en la produccin de concentracin de glucosa, ya que la glucoamilasa presenta los valores ms altos en ambas variables. La ventaja ms significativa de la hidrlisis enzimtica en comparacin con la hidrlisis cida del almidn, es el tiempo que cada una tarda, ya que la hidrlisis enzimtica se puede realizar en la mitad del tiempo que la otra y se obtienen resultados satisfactorios. La absorbancia muestra el mismo comportamiento que cuando se toma en cuenta las concentraciones de glucosa en funcin del tiempo, esto se debe a que durante la prctica la turbidez me mide la cantidad de concentracin del medio y esta turbidez aumenta si hay mayor concentracin del producto de inters.

HIDRLISIS DEL ALMIDON

Asignatura: Laboratorio de Biotecnologa

Presentado a: Ing. Henry Hernn Castao

UNIVERSIDAD DE CALDAS FACULTAD INGENIERIA INGENIERIA DE ALIMENTOS Manizales, 2009

BIBLIOGRAFIA http://es.wikipedia.org/wiki/Almid%C3%B3n#Gelatinizaci.C3.B3n http://74.125.95.132/search?q=cache:j_rnQfk9Mr4J:www.scielo.org.co/sciel o.php%3Fpid%3DS012140042008000200007%26script%3Dsci_pdf%26tlng%3Des+licuefacci%C3% B3n+del+almidon&cd=8&hl=es&ct=clnk&gl=co http://culturillacervecera.blogspot.com/2009/09/sacarificacion.html http://www.unalmed.edu.co/bioetanol/FERMENTACION_CON_Zymomonas _mobilis_A_PARTIR_DE_ALMIDON_DE_YU.pdf http://sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtualdata/Tesis/Salud/vargas_as/Disc.pdf