ELISA

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Y ELISA (aco del ingls Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorcin ligado a enzimas) es una tcnica de inmunoensayo en la cual un antgeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algn otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antgeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparicin de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometra el antgeno en la muestra. Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular est presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran nmero de variables, tales como selecin de reactivo, temperatura, medicin de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba. La interaccin antgeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infeccin o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer: -En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente est enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originara un falso positivo. -En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que stos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sera el caso, por

ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infeccin en el momento de realizar la prueba, o que estn infectadas por una cepa extraa. -En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antgenoanticuerpo. En estos casos de diagnstico de enfermedad es recomendable la eliminacin (mediante centrifugacin) de clulas de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aqul de especificidad. Tambin, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada poblacin, es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha poblacin, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro mtodo de diagnostico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultneamente, frente a la misma infeccin en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes estn presentes en el sujeto frente a esa infeccin. Entonces es cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente. Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es verstil, robusto, simple en su realizacin, mediante el uso de la fase slida, una separacin fcil entre la fraccin retenida y la fraccin libre. Adems se han propuesto y desarrollado diferentes mtodos de amplificacin de la seal (luminiscentes, cascadas enzimticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal. Este mtodo ha tenido una enorme aplicacin en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificacin de productos mediante anticuerpos: diagnstico clnico, deteccin viral, clasificacin de anticuerpos en isotipos, bsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.

1 Dispositivos empleados en ELISA 2 Fases de un ensayo ELISA 3 Tipos de ensayos ELISA 4 Quimioluminiscencia 5 Marcadores enzimticos ms comnmente utilizados 6 Prueba ELISPOT 7 Enlaces externos

Dispositivos empleados en ELISA

Se han ensayado numerosas fases slidas, desde los tubos de cristal de los orgenes a las actuales microplacas de 96 pocillos de plstico tratado para aumentar su capacidad de absorcin (fenmeno de superficie) de molculas y con fondos de pocillo pticamente claros para poder realizar las medidas de densidad ptica en instrumentos especficos, espectrofotmetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA. Actualmente se estn desarrollando dispositivos de mayor capacidad, por ejemplo con 384 y 1536 pocillos, adecuados para los sistemas de 'screening' masivo de los sistemas robotizados (HTS, 'High-throughput system')

Los lectores ELISA son espectrofotmetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotmetro convencional, con capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que slo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda. Son la que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad ptica de los cromgenos ms comnmente utilizados. Fases de un ensayo ELISA

Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes: 1. Conjugacion del anticuerpo o del antgeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antgeno marcado se emplea en ensayos de competicin de antgeno. Dicha unin anticuerpo-enzima o antgeno-enzima ha de producirse durante un determinado periodo de tiempo en aras de producir una solucin coloreada y que pueda ser valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotmetro (normalmente a una longitud de onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se de la reaccin, no se evidenciar ningn color, interpretndose este resultado como un falso negativo, disminuyendo la sensibilidad de la tcnica. 2. Unin del antgeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unin de anticuerpos o antgenos se realiza con facilidad a la superficie de plsticos tratados que tienen gran afinidad por protenas. As, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe realizarse cuidadosamente. Si se usa poco antgeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa demasiado antgeno, el exceso dar lugar a una reaccin falsa negativa. 3. Formacin de una o ms capas de inmunocomplejos. En el caso del antgeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antgeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antgeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo mtodo permite la amplificacin de la seal al poderse unir uno o ms anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antgeno y antgeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antgeno fro frente a una cantidad fija de antgeno marcado. Es el ensayo de competicin del antgeno. En esta etapa es muy importante controlar los

factores tiempo y temperatura de incubacin para evitar la aparicin de falsos negativos. En el caso del tiempo, si es inferior a 15 minutos, no ocurrir la interaccin antgenoanticuerpo y el color no ser evidente al final del ensayo, dando un falso negativo. Por su parte, si la temperatura de incubacin es muy baja, la formacin del complejo antgenoanticuerpo tampoco se completar en el tiempo establecido, mientras que si es muy alta, las protenas (antgeno y anticuerpo) se desnaturalizan y por tanto disminuyen su capacidad para interaccionar, dando igualmente falsos negativos. 4. Revelado de la reaccin enzimtica. Despus de un lavado para eliminar todos las molculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se aade el sustrato enzimtico en solucin. Se deja reaccionar y se lee la densidad ptica (D.O.) mediante espectrofotometra. Tipos de ensayos ELISA

Se han desarrollado mltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificacin de un antgeno en solucin, la deteccin de un anticuerpo en una solucin (por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales) o la determinacin de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuacin se describen los ms comunes.

ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antgeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antgeno en la solucin analizada. Es necesario incluir controles negativos que sern muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antgeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antgeno buscado). ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de deteccin emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antgeno y uno secundario marcado contra el primario. La deteccin tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificacin de seal debida a la unin de dos o ms anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo

ms popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimtico permite cuantificar una gran variedad de antgenos, por eso es un mtodo ms polivalente y barato, aunque se pierda algo de precisin por tener un eslabn ms con respecto al mtodo directo. La dilucin de la solucin que contiene el anticuerpo primario (por ejemplo: suero sanguneo) es un factor muy importante a tener en cuenta para evitar la aparicin de falsos negativos, ya que si la muestra est muy diluida no saldr positiva si la titulacin de anticuerpos es muy baja. Es decir, aunque los anticuerpos estn presentes, la prueba no da positivo porque la concentracin de anticuerpos especficos contra el antgeno que est pegado en el fondo del pocillo no es suficiente como para dar una seal detectable. El ELISA indirecto es el mtodo de eleccin para detectar la presencia de anticuerpos sricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), agente causante del sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Segn esta tcnica, protenas recombinantes de la envoltura y el ncleo del VIH se absorben como antgenos en fase slida a los pocillos. Las personas afectadas de VIH producen anticuerpos sricos contra eptopos en estas protenas vricas. En general, el ELISA indirecto permite detectar anticuepos sricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una infeccin.

ELISA sndwich (Ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antgeno. Despus de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antgeno, que ser retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Despus de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solucin con un segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As pues cada molcula de antgeno estar unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificacin de seal que permite el segundo anticuerpo.

Quimioluminiscencia

Durante determinadas reacciones qumicas, la luz generada por este fenmeno constituye una alternativa conveniente y muy sensible para las mediciones de absorbancia en ELISA. Los tipos de ELISA que recurren a la quimioluminiscencia utilizan un sustrato que genera luz, en lugar del sustrato cromgeno de las reacciones ELISA ordinarias. Tales son los casos de la oxidacin del compuesto luminol por perxido de hidrgeno y la enzima peroxidasa de rbano (HRP), que producen luz. La luz que se genera en dichas reacciones puede detectarse gracias a su capacidad de sensibilizar una pelicula fotogrfica. La medicin cuantitativa de la emisin de luz puede hacerse mediante el uso de un luminmetro. La ventaja de las pruebas de quimioluminiscencia sobre las cromgenas es la mejora de la sensibilidad. En general, el lmite de deteccin puede aumentarse al menos diez veces si se cambia un sustrato cromgeno por uno que emita luz, y ms de doscientas veces cuando se adicionan agentes potenciadores. Marcadores enzimticos ms comnmente utilizados En la tabla siguiente se recogen los marcadores enzimticos ms comnmente empleados en ensayos ELISA, los sustratos que se emplean para su revelado y el modo de prepararlos. Enzima Sustrato Tampn

HRPO (peroxidasa de rbano) OPD 10 mg/25 mL de tampn citrato sdico 0.15 M pH 5; aadir microL de 30% perxido de hidrgeno 30% TMB 2.5 mg/250 microL de DMSO; hasta 25 ml con tampn citrato sdico 0.1M pH 6; aadir 5 microL de perxido de hidrgeno 30% ABTS 60 mg/100 mL de tampn citrato sdico 0.1 M pH 6; aadir 35 microL de perxido de hidrgeno 30%; parar con fluoruro sdico 1.25%; leer a 405 nm DAB 10 mg/20 mL de tampn Tris 50 mM pH 7.4; filtrar y aadir 20 microL de perxido de hidrgeno 1% CNP 6 mg en 1 mL de metanol; aadir 10 mL de tampn Tris 50 mM pH 7.4; filtrar y aadir 40 microL de perxido de hidrgeno 30% AEC 80 mg en 1 mL de N,N'-dimetilformamida + 200 microL de tampn acetato 0.1 M pH 4.5; filtrar y aadir 50 microL de perxido de hidrgeno 30% ASA 80 mg/100 mL de agua destilada caliente; ajustar a pH 6.0 con 1 mM NaOH y aadir 10 % por volumen de 0.05% perxido de hidrgeno; parar con 25 microL de NaOH 1 M AP (Fosfatasa alcalina) PNPP 5 mg/5 mL de tampn dietanolamina-HCl 0.1 M pH 9.8 +1 mM cloruro de magnesio

NAPFB (A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un tubo de vidrio, (B) 10 mg de sal Fast Blue BB/ 10 ml de tampn Tris 0.05M pH 9.2 - 2 mM cloruro de magnesio. Mezclar A + B y filtrar. NAPR (A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un tubo de vidrio, (B) 10 mg de sal Red BB/ 10 ml de tampn Tris 0.05M pH 9.2 - 2 mM cloruro de magnesio. Mezclar A + B y filtrar. BCIP 1 mg/mL en solucin AMP (2-amino-2-metil-propanol) beta-G ONPG 2.5 mg/ml en tampn fosfato sdico 0.1 MpH 7.0 + 1 mM cloruro de magnesio + 0.1 M beta-mercaptoetanol ureasa BP 8 mg/1.48 ml de 0.01M NaOH; llevarlo a 100 ml con agua desionizada; aadir 100 mg de urea y EDTA a 0.2 mM; ajustar el pH a 4.8 con 1 mM NaOH o HCl; almacenar a 4 C PG IS Aadir a cada placa de ELISA 25 microL de cada uno de los reactivos siguientes en secuencia : (A) 1% (peso/vol) gelatina en 0.1 M tampn fosfayo pH 7.0, (B) 1% (peso/vol) almidn en agua destilada caliente, (C) 3.04 mg/mL de benzil-penicilina en 0.1 M tampn fosfato pH 7.0 (5000 U/mL), (D) 0.01 N ioduro en 0.1 M KI solucin stock (en una botella oscura).

Prueba ELISPOT Una variante de la prueba ELISA, llamada ELISPOT, es capaz de detectar cuantitativamente el nmero de clulas en una poblacin productora de anticuerpos especficos contra un antgeno determinado o un antgeno contra el que se dispone de un anticuerpo especfico. Aqu, las placas se recubren con el antgeno reconocido por el anticuerpo de inters o con el anticuerpo especfico para el antgeno cuya produccin se valora. Seguidamente, se aade a las placas recubiertas una suspensin de la poblacin celular que se investiga e incuba. Las clulas se disponen en la superficie de la placa, y las molculas secretadas reactivas a las molculas de captura son unidas en la cercana de las clulas secretoras, producindose un anillo de complejos antgeno-anticuerpo alrededor de cada clula que sintetiza la molcula de inters. Despus, la placa se lava y un anticuerpo unido a enzima especfico para el antgeno secretado, o para la especie de anticuerpo secretado, se aade y deja que se unan. El posterior revelado del ensayo mediante adicin de un sustrato cromgeno o emisor de luz adecuado, indica la posicin de cada clula productora de anticuerpo (o de antgeno) como un punto de color o luz. http://es.wikipedia.org/wiki/ELISA http://www.elispot-analyzers.de/english/elisa-animation.html

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Western blot
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Resultado del Western blot: una membrana con las protenas separadas en la electroforesis unidas, de las que slo se disciernen aquellas contra las se ha aadido un anticuerpo.

El Western blot, o inmunoblot, es una tcnica analtica usada para detectar protenas especficas en una muestra determinada (una mezcla compleja de protenas, como un extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las protenas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a una membrana adsorbente (tpicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la protena de inters con anticuerpos especficos contra ella.1 2 Finalmente, se detecta la unin antgenoanticuerpo por actividad enzimtica, fluorescencia entre otros mtodos. De esta forma se puede estudiar la presencia de la protena en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a otras protenas. Esta tcnica es hoy en da imprescindible en varios campos de la biologa, como la biologa molecular, la bioqumica, la biotecnologa o la inmunologa. Existe toda una industria especializada en la venta de anticuerpos (monoclonales y policlonales) contra decenas de miles de protenas diferentes.3 4

El Western blot fue desarrollado en el laboratorio de George Stark, en la Universidad de Stanford.2 El nombre (Western, occidental en ingls) le fue dado por W. Neal Burnette,5 y consiste en un juego de palabras con una tcnica anloga pero que usa DNA, el Southern (sureo) blot, que en este caso debe su nombre a su descubridor, Edwin Southern. Otras tcnicas que fueron nombradas siguiendo este criterio son el Northern blot (en el que se separa e identifica RNA), el Eastern blot, el Southwestern blot.

Contenido
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1 Antecedentes 2 Pasos del Western blot o 2.1 Preparacin de la muestra o 2.2 Electroforesis en gel o 2.3 Transferencia 2.3.1 Difusin simple 2.3.2 Transferencia al vaco 2.3.3 Electrotransferencia o 2.4 Bloqueo o 2.5 Deteccin 2.5.1 Mtodo en dos pasos 2.5.1.1 Anticuerpo primario 2.5.1.2 Anticuerpo secundario 2.5.1.2.1 Radiactividad 2.5.1.2.2 Anticuerpo unido a una enzima 2.5.1.2.3 Marcaje fluorescente 2.5.1.2.4 Sistema avidina/estreptavidina 2.5.1.2.5 Deteccin con oro 2.5.2 Mtodo en un paso o 2.6 Anlisis 2.6.1 Deteccin colorimtrica 2.6.2 Deteccin quimioluminiscente 2.6.3 Deteccin radiactiva 2.6.4 Deteccin fluorescente o 2.7 Exploraciones secundarias 3 Aplicaciones o 3.1 Investigacin o 3.2 Diagnstico 4 Protocolos 5 Vase tambin 6 Enlaces externos 7 Referencias

[editar] Antecedentes

Antes de la aparicin del Western blot, ya existan diversas tcnicas capaces de detectar un antgeno determinado en una muestra, como la inmunoelectroforesis, la inmunodifusin doble de Ouchterlony, la inmunoprecipitacin... La aparicin del Western no fue posible hasta la aparicin de las membranas. En 1975, Edwin Southern demostr que la nitrocelulosa era capaz de capturar cidos nucleicos separados previamente por electroforesis. De esta forma, se permita el anlisis de una mezcla compleja de molculas de ADN, como un genoma tratado con enzimas de restriccin.6 Se desarroll as el Southern blot, usando el nombre del descubridor como epnimo; es por ello que tanto esta tcnica como sus derivadas (Western blot, Northern blot...) se escriben con mayscula. Ms tarde, Towbin (1979) y Burnette (1981) demostraron que tambin era capaz de unirse a protenas. Ya en 1986, Millipore desarroll la primera membrana de PVDF diseada para la transferencia de protenas, la membrana de transferencia ImmobilonTM PVDF. Porteriormente fue llamada membrana de transferencia Immobilon-PTM para diferenciarse de otras membranas.

[editar] Pasos del Western blot

[editar] Preparacin de la muestra
Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo celular:

Una pequea cantidad del tejido se introduce en un buffer de extraccin. Despus se procede a homogeneizarlos, sea con una licuadora (para grandes volmenes de muestra), con un homogenizador (para muestras pequeas) o por sonicacin. Por ltimo se centrifuga para obtener las protenas en el sobrenadante, la fraccin no precipitada.7 Las clulas pueden lisarse por uno de esos mtodos mecnicos. Tambin pueden usarse detergentes, sales o tampones que favorezcan la lisis y solubilicen las protenas. A veces se aaden inhibidores de proteasas y fosfatasas que evitan la digestin por las enzimas celulares de las protenas y de las fosfoprotenas, respectivamente.8

Los materiales deben estar a bajas temperaturas (~4 C) para evitar la desnaturalizacin proteica. Para separar protenas de compartimentos y orgnulos celulares es preciso combinar tcnicas mecnicas - como filtraciones y centrifugaciones - y bioqumicas.

[editar] Electroforesis en gel

Artculo principal: Electroforesis en gel.

Las protenas de la muestra sern separadas mediante una electroforesis en gel en funcin de uno o varios (en las electroforesis bidimensionales) de estos criterios: punto isoelctrico, peso molecular y carga elctrica. La naturaleza de la separacin depende del tratamiento de la muestra y de la naturaleza del gel. La electroforesis en gel ms frecuente, conocida como SDS-PAGE, hace uso de gel de poliacrilamida y de tampn con dodecilsulfato (SDS). En esta tcnica las protenas sufren un tratamiento por agentes reductores que provocan la prdida de las estructuras secundaria y terciaria (por ejemplo, reduciendo los puentes disulfuro (S-S) a grupos tiol (SH + SH)) y mantiene los polipptidos en este estado desnaturalizado. De este modo, la estructura tridimensional de las protenas no influye en la electroforesis, y pueden separarse nicamente en funcin del tamao.

[editar] Transferencia
Para que las protenas sean accesibles a la deteccin por anticuerpos, se las transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de PVDF. Esta transferencia puede realizarse por difusin, por vaco o por accin de un campo elctrico (electrotransferencia). Las membranas que se emplean en el Western blot se caracterizan por su capacidad de unir protenas de forma inespecfica (es decir, se adhieren a todas las protenas con idntica afinidad):

las membranas de nitrocelulosa, aunque no se conoce exactamente la naturaleza de las interacciones membrana - protena, se sabe con cierta seguridad que se trata de interacciones no covalentes de naturaleza hidrfba. en las membranas de PVDF, la unin est basada en interacciones hidrofbicas y de dipolos entre la membrana y las protenas. Como particularidad, deben ser humedecidas con metanol o etanol antes de exponerlas a tampones acuosos, debido a su alta hidrofobicidad y a la ausencia de surfactantes.

Las membranas de nitrocelulosa son ms baratas que las de PVDF, aunque son tambin ms frgiles, tienden a tornarse quebradizas cuando se secan y no pueden ser sometidas a varias pruebas consecutivas.9 Tambin pueden usarse otros soportes, como las membranas de nylon o el papel activado. Sin embargo, no son tan usados como los anteriores. [editar] Difusin simple En la transferencia por difusin simple se ponen en contacto las superficies del gel electrofortico y de la membrana y, sobre sta, se dispone un taco de papeles de filtro. Con el fin de facilitar el proceso, puede ponerse encima una placa de vidrio y un objeto pesado. Este montaje se coloca sobre un tampn, que ascender por capilaridad hacia el papel de filtro arrastrando consigo las protenas. Al llegar a la membrana, quedarn retenidas en ella. Este protocolo no est muy extendido actualmente, puesto que la cantidad de protena transferida a la membrana es muy baja, mucho menor que con la electrotransferencia. Sin embargo, ha ganado cierta popularidad por una modificacin que permite obtener mltiples transferencias de un mismo gel, permitiendo de esta forma realizar varias pruebas sobre geles virtualmente idnticos. Esta modificacin es viable cuando no es necesaria una transferencia cuantitativa de protena.10 11 [editar] Transferencia al vaco En esta tcnica, se aade el poder de succin de una bomba conectada a un sistema de secado de planchas de gel, el cual lleva las protenas desde el gel hasta la superficie de la membrana de nitrocelulosa.12 Este mtodo es vlido tanto para protenas de alto como de bajo peso molecular.11

[editar] Electrotransferencia Este mtodo se basa en una corriente elctrica y un tampn de transferencia para llevar las protenas desde el gel hacia la membrana. Para ello, se apilan en el orden descrito los siguientes elementos (del polo negativo o ctodo al positivo o nodo): esponja, varios papeles de filtro empapados en buffer de transferencia, gel, membrana, ms papeles de filtro empapados y otra esponja. Este montaje, llamado coloquialmente sandwich, se dispone en el sistema de transferencia y se aplica una corriente elctrica, de magnitud acorde a los materiales empleados, al tiempo disponible,... Las protenas del gel se desplazan hacia el polo positivo y quedan atrapadas por la membrana.1

Tras la transferencia, se suele proceder a la tincin del gel con Coomassie Brilliant Blue (un colorante de protenas) para comprobar que en efecto una parte importante del material proteico ha pasado a la membrana. La electrotransferencia es hoy en da la tcnica de transferencia ms usada gracias a la velocidad del proceso y al elevado porcentaje de protena que se transfiere (especialmente en comparacin con las otras tcnicas).

[editar] Bloqueo
Puesto que la membrana escogida necesita poder unirse protenas de forma inespecfica, es preciso bloquear los lugares de unin que han quedado libres tras la transferencia. En caso contrario, el anticuerpo (de naturaleza proteica) empleado en la deteccin puede unirse a ellos, dificultando la distincin del complejo antgeno-antgeno que se forma con la protena que se busca. En el bloqueo se incuba la membrana con una solucin de protenas, tpicamente de albmina de suero bovino o ASB (ms conocida por sus siglas en ingls, BSA), leche en polvo o casena, con una diminuta fraccin de detergente, como Tween 20 o Tritn X-100. Las protenas en solucin se unirn a todos aquellos lugares de unin de la membrana que

no estn ya ocupados por las transferidas desde el gel. De este modo, el anticuerpo slo podr unirse a su antgeno especfico, reduciendo as el ruido de fondo y los falsos positivos.

[editar] Deteccin
En la deteccin se comprueba la presencia en la membrana de una determinada protena. Para ello se emplea un anticuerpo especfico contra ella unido a enzima que, en presencia de su sustrato, catalice una reaccin colorimtrica (produce color). De esta forma, se hace patente la unin con el antgeno, la protena, as como su localizacin. El proceso tradicionalmente se ha realizado en dos pasos, aunque ahora es posible la deteccin en un nico paso, lo cual es til en ciertos campos. [editar] Mtodo en dos pasos Los dos pasos de los que consta este mtodo de deteccin son la unin del anticuerpo primario y la del anticuerpo secundario.

[editar] Anticuerpo primario

El primer paso es permitir la unin de un anticuerpo primario contra la protena buscada. ste se consigue inoculando dicha protena o uno de sus eptopos (regiones capaces de desencadenar la respuesta inmune) a un animal (como un conejo o una cabra) o a un cultivo celular. Adems, como la protena se ha desnaturalizado durante la electroforesis en gel, es preciso que el anticuerpo reconozca especficamente la protena desnaturalizada. La presencia del elemento extrao debera desencadenar una respuesta inmune cuyo resultado incluya la produccin del anticuerpo, primario en este caso, ya que reconoce la protena. As pues, tras el bloqueo se incuba en agitacin moderada la membrana con una disolucin de anticuerpo primario (0,5 - 5 g/ml). La disolucin consiste en un tampn salino, con

cloruro de sodio por lo general, con un pH cercano a la neutralidad, una pequea fraccin de detergente y, en ocasiones, protenas disueltas, como ASB o leche en polvo. La membrana junto con la disolucin pueden ser introducidas en una pequea bolsa de plstico. Esta incubacin puede durar desde 30 minutos a una noche entera. La temperatura a la que puede tener lugar es igualmente variada; en general, las elevadas temperaturas favorecen las uniones ms especficas.
[editar] Anticuerpo secundario

Tras lavar la membrana para eliminar el anticuerpo primario que no se ha unido, se expone al anticuerpo secundario. ste reconoce de forma especfica una regin concreta del anticuerpo primario. Suelen estar marcados para ser detectables (unin a biotina, a una enzima reporter como laa fosfatasa alcalina o la peroxidasa del rbano (HRP), etc.). Varios de estos anticuerpos se unirn a cada anticuerpo primario, amplificando la seal. Los anticuerpos secundarios proceden de animales o de cultivos de hibridomas de origen animal. Por ejemplo, un anticuerpo secundario "anti-ratn" es aquel capaz de reconoces casi todos los anticuerpos primarios obtenidos de ratones. Igualmente hay anticuerpos "anti-cabra", "anti-conejo"... Su uso presenta ciertas ventajas: econmicas, por permitir a un laboratorio compartir una nica fuente de anticuerpos secundarios; y dan resultados mucho ms consistentes. Tambin pueden emplearse protenas no anticuerpos, como las protenas A y G.
[editar] Radiactividad

Unin del anticuerpo primario a la protena de inters. A este se une la protena A o la protena G para ser detectada.

Es una alternativa al uso de anticuerpos secundarios que consiste en protenas de unin a anticuerpos marcadas radiactivamente. Esta protena puede ser, por ejemplo, la protena A de Staphylococcus aureus13 o la protena G14 marcadas con 125I (un istopo radiactivo de yodo). Las protenas mencionadas tienen la capacidad de unirse a anticuerpos de forma inespecfica, por lo que se unirn al primario.

Este mtodo apenas se usa actualmente, por ser significativamente ms caro, peligroso y lento que los otros. Sin embargo, presenta ventajas: es muy sensible, da bandas que permiten una precisa cuantificacin; y la imagen autoradiogrfica puede ser reproducida fcilmente y con gran precisin para su publicacin.11
[editar] Anticuerpo unido a una enzima

Anticuerpo secundario unido a la peroxidasa de rbano, de modo que puede catalizar la reaccin quimioluminiscente.

Un mecanismo de deteccin simple y rpido consiste en unir al anticuerpo secundario enzimas que catalicen la transformacin de un sustrato soluble en un producto insoluble. De esta forma, en el posterior anlisis quedar una mancha all donde est la protena de inters. Enzimas como la peroxidasa de rbano (HRP) o una fosfatasa alcalina son vlidas para este mecanismo.11 Por ejemplo, la peroxidasa puede catalizar la oxidacin del 4cloronaftol en presencia de un 1% de perxido de hidrgeno. El resultado es que el primero forma una mancha de precipitado oscura.15 Otras tcnicas, como ELISA o ELISPOT, tambin emplean este mtodo de deteccin. Otro mtodo ms sofisticado consiste en la unin de una enzima que catalice una reaccin quimioluminiscente. Las anteriormente citadas enzimas tambin son vlidas en este caso, aunque cada una usa un agente quimioluminiscente diferente. En el caso de la peroxidasa, cataliza la oxidacin del luminol en presencia de perxido de hidrgeno. La fosfatasa alcalina cataliza la defosforilacin del adamantil-1-2-dioxetano fosfato, reaccin que genera luz. Si se coloca una pelcula fotogrfica sobre la membrana, la exposicin a la luz que se desprende en la reaccin permite detectar la actividad enzimtica.
[editar] Marcaje fluorescente

Otro mtodo basado en el mismo principio emplea anticuerpos unidos a fluorocromos del infrarrojo cercano, como el 2 - metoxi - 2,4 - difenil - 3 (2H) - furanona (MDPF) o el rojo Nilo. Estos compuestos emiten una cantidad de luz constante (estado esttico) cuando se excitan de manera constante, permitiendo una deteccin muy precisa y una cuantificacin

del antgeno ms exacta que la de la quimioluminiscencia, que se realiza durante un estado dinmico. El rojo Nilo no es puede usarse para teir bandas en membranas de PVDF; sin embargo es posible realizar la tincin en el gel SDS - PAGE y luego transferirlo a la membrana de PVDF. Esto ltimo presenta una ventaja, y es que no es necesario realizar una tincin del gel para comprobar la transferencia proteica.16
[editar] Sistema avidina/estreptavidina

Otra opcin es emplear un anticuerpo primario unido covelentemente a molculas de biotina. Despus la deteccin se llevar a cabo con una protena de unin a la misma, como la estreptavidina o la avidina.
[editar] Deteccin con oro

Otra tcnica, conocida como Golden blot, consiste en la deteccin de los anticuerpos primarios con protena A unida a partculas de oro. El resultado es una membrana con manchas rojas, causadas por el oro, all donde est la protena.17 La sensibilidad del mtodo puede incrementarse con una tincin fotoqumica de plata: el oro cataliza la reduccin de los iones plata a plata metlica en presencia de otro agente reductor, como la hidroquinona; la plata forma de este modo unas manchas visibles bajo microscopio ptico. Se consigue as una sensibilidad comparable a la de las tcnicas radiactivas.11 18 [editar] Mtodo en un paso Histricamente la deteccin se ha realizado en dos pasos por la relativa facilidad que supone producir anticuerpos primarios y secundarios en procesos separados. Esto ofrece a investigadores y empresas enormes ventajas en lo que a flexibilidad se refiere, y aade un efecto amplificador al proceso. Sin embargo, debido a la llegada de los anlisis de protenas de alto rendimiento y los menores lmites de deteccin ha crecido el inters por desarrollar sistemas de deteccin en un solo paso que aumentaran la rapidez del proceso al tiempo que reducen los consumibles. Esto requiere un anticuerpo que reconozca al mismo tiempo la protena de inters y una "etiqueta" detectable. Se incuba de manera similar al anticuerpo primario del proceso en dos pasos, y, tras una serie de lavados, ya se puede detectar directamente.

[editar] Anlisis
Tras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se procede a la deteccin de aquellas que s se han unido a la protena de inters. [editar] Deteccin colorimtrica La deteccin colorimtrica depende de la incubacin del Western blot con un sustrato que reacciona gracias a la enzima reporter (una peroxidasa, por ejemplo) unida al anticuerpo secundario. Pasa as de ser un compuesto soluble a una forma insoluble de otro color que

precipita cerca de la enzima tiendo as la membrana. Se procede despus a un lavado en el que se elimina el tinte soluble. La cuantificacin proteica se evala por densitometra (cuan intensa es la mancha) o por espectrometra. [editar] Deteccin quimioluminiscente La deteccin quimioluminiscente requieren la incubacin de la membrana con un sustrato, que emitir luminiscencia al ser expuesto al reporter que trae unido el anticuerpo secundario. La luz emitida es captada por una pelcula fotogrfica o, ms recientemente, por cmaras CCD, que toman una imagen digital del Western blot. Se analiza la imagen por densitometra para evaluar la cantidad relativa de mancha y cuantifica el resultado en trminos de densidad ptica. Actualmente hay programas que permiten realizar anlisis ms profundos si se aplican ciertos estndares, como la obtencin del peso molecular.

[editar] Deteccin radiactiva Los marcadores radiactivos no requieren sustratos enzimticos; en su lugar se coloca una pelcula fotogrfica contra el Western blot y la actividad radiactiva del marcador provoca la aparicin en ella de regiones oscuras. stas se correspondern con las bandas de las protenas de inters. Su alto precio y su riesgo para la salud y la seguridad han provocado su desuso en los ltimos tiempos. [editar] Deteccin fluorescente En la deteccin con marcadores fluorescentes se procede a la excitacin lumnica de stos que les provoca una excitacin. sta es detectable por un fotosensor, como una cmara CCD equipado con los filtros de emisin apropiados. Se consigue as una imagen digital del Western blot que puede ser analizado para obtener el peso molecular o la cuantificacin proteica. La fluorescencia es considerada uno de los mtodos de anlisis ms sensibles.

[editar] Exploraciones secundarias

Una caracterstica de las membranas de PVDF, de la que carecen las de nitrocelulosa, es su capacidad de quitar los anticuerpos y volver a explorar la membrana con otros anticuerpos. Aunque hay protocolos que permiten hacer lo mismo en membranas de nitrocelulosa, la robustez de las de PVDF facilita la eliminacin de los anticuerpos, permitiendo ms reusos antes de que el ruido de fondo es tan grande que impide continuar con los experimentos. Otra diferencia es que, a diferencia de la nitrocelulosa, el PVDF debe ser empapado en etanol, isopropanol o metanol al 95% antes de ser usado. Adems, las membranas de PVDF tienden a ser ms delgadas y ms resistentes a los daos durante su uso.

[editar] Aplicaciones
[editar] Investigacin
Actualmente, el Western blot es una de las tcnicas ms usadas en el estudio de la biologa molecular.19

[editar] Diagnstico

Prueba de VIH: Aunque el VIH suele detectarse mediante la tcnica ELISA, el Western Blot se usa como prueba confirmatoria cuando el ELISA da un resultado positivo en un grupo que no es de riesgo o en una poblacin donde la prevalencia del virus es muy baja. Mediante el Western blot se buscan los anticuerpos anti-VIH en una muestra de suero humano. Se transfieren a una membrana las protenas de clulas que, se sabe, estn infectadas por el VIH. Entonces, se incuba el suero que hay que probar con esta membrana. Este paso es equivalente a la incubacin con el anticuerpo primario; si hay anticuerpos anti-VIH en el suero, sern estos los que realizen el papel de anticuerpo primario. Se lava, para eliminar los anticuerpos no unidos, y la membrana se vuelve a incubar con un anticuerpo secundario anti-humano unido a una enzima-seal. La aparicin de bandas indica la presencia de protenas contra las cuales el suero del paciente contiene anticuerpos, es decir, el paciente es seropositivo. Se emplea como prueba definitiva de la encefalopata espongiforme bovina, comnmente llamada "enfermedad de las vacas locas". Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme usan el Western blot. En veterinaria, ocasionalmente se emplea el Western blot para confirmar la presencia del FIV en gatos.

[editar] Protocolos
http://es.wikipedia.org/wiki/Western_blot