Cromatografia de Excluso Molecular

Bioqumica Experimental I
Departamento de Qumica e Bioqumica Licenciatura em Bioqumica

Docente: Marta Silva Trabalho realizado por:

Alexandra Salvado, n 40267 Andreia Sousa, n 40261 Telmo Paiva, n 40243 PL 3

7 de Novembro Ano Lectivo 2011/2012

Cromatografia de Excluso Molecular

ndice

Resumo ......................................................................................................................... 3 Material e Mtodos ....................................................................................................... 4 Resultados e Discusso ................................................................................................. 5 Cromatogramas ou grficos de eluio das separaes realizadas .............................. 5 #1. Absorvncia a 620 nm do azul de dextrano em funo do volume de eluio ... 5 #2. Absorvncia da mistura padro + azul de dextrano a 620, a 410 e a 280 nm ..... 8 #3. Absorvncia a 280 e a 620 nm da amostra desconhecida em funo do volume de eluio ............................................................................................................ 17 Discusso global dos resultados obtidos .................................................................. 20 Concluso ................................................................................................................... 24 Bibliografia ................................................................................................................. 25

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Resumo
Este trabalho experimental teve como objectivo ilustrar os princpios de separao de uma mistura de protenas globulares durante a realizao de uma cromatografia de excluso molecular (tambm designada como cromatografia de filtrao em gel). Inicialmente, empacotou-se a coluna com gel Sephadex G-100 obtendo-se uma coluna de separao com 39 cm de altura e 0,65 cm de raio (ao que corresponde um volume total de 51,76 mL). Depois da montagem da coluna, aplicaram-se as misturas que se pretendia separar por esta tcnica. mistura padro e amostra desconhecida foram adicionados 200L de azul de dextrano (Mr=2000 Da). Como o gel utilizado apresenta a sua gama de fraccionamento entre os 8 e 80 kDa, o azul de dextrano vai ser totalmente excludo pelas partculas do gel, pelo que o seu volume de eluio vai corresponder ao volume morto da coluna. Conhecendo o volume morto da coluna e o seu volume total foi possvel calcular o coeficiente de distribuio Kav para cada componente, retirando o seu volume de eluio do respectivo cromatograma. O Kav obtido para o azul de dextrano foi BSA foi , para a mioglobina foi e para a amostra desconhecida foi Atravs dos Kav do BSA, da mioglobina e do cromato de potssio e das suas massas moleculares relativas conhecidas, obteve-se uma recta de calibrao com equao: , para o

, para o cromato de potssio

Da equao anterior retirou-se o valor da massa molecular relativa da amostra desconhecida, que foi 19670 Da, que no correspondeu a nenhuma das massas moleculares relativas da amostra padro devido a erros experimentais e utilizao de uma recta de calibrao. Como qualquer dos erros mencionados aumentam o tempo de reteno da protena, a massa molecular obtida inferior massa molecular real da protena. Por comparao com os componentes da mistura padro, estimou-se que a amostra desconhecida era BSA. Pgina | 3

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Material e Mtodos
Neste trabalho laboratorial foi seguido o protocolo experimental excepo de alguns casos a seguir identificados: S foi preparada uma mistura padro e no duas, sendo esta composta por:

7,5 mg mL-1 Albumina srica bovina (BSA) 5 mg mL-1 Mioglobina 2 mg mL-1 K2CrO4 4 mg mL-1 Azul de dextrano No se procedeu aplicao isolada do azul de dextrano, visto que este foi adicionado tanto mistura padro como soluo desconhecida. A aplicao da mistura padro foi de 600L e no de 500L como referido no protocolo. amostra desconhecida (300 L) foi adicionado 200 L azul de dextrano 4 mg/mL. Apenas se traou o espectro de absoro do azul de dextrano. A absorvncia da mistura padro foi medida a 280, a 410 e a 620 nm. A absorvncia da amostra padro foi medida a 280 e a 620 nm. Amostra Padro

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Resultados e Discusso
Cromatogramas ou grficos de eluio das separaes realizadas
#1. Absorvncia a 620 nm do azul de dextrano em funo do volume de eluio
Na aplicao das misturas na coluna, no se aplicou a amostra de azul de dextrano isoladamente, pelo que, para realizar o cromatograma do azul de dextrano se considerou as duas outras aplicaes: azul de dextrano + amostra desconhecida e azul de dextrano + mistura padro. O traado do cromatograma do azul de dextrano permite calcular o volume morto, ou de excluso, da coluna. Este volume corresponde ao volume total do espao que rodeia as partculas do gel. Como o azul de dextrano apresenta uma massa molecular na ordem dos 2000 kDa e como o gel utilizado apresenta a sua gama de fraccionamento entre os 8 e 80 kDa, este vai ser totalmente excludo pelas partculas do gel. Esta excluso observada visivelmente devido cor azul do composto utilizado. Quadro 1. Valores de absorvncia obtida e considerada para amostra padro e desconhecida de azul de dextrano. Resultados Obtidos Abs620 Abs620 Mistura Amostra Padro Desconhecida 0,000 -0,005 0,028 0,128 -0,010 0,018 0,060 0,016 0,002 -0,003 0,001 0,082 0,003 0,031 0,078 0,213 0,098 0,386 0,014 0,288 0,016 0,077 Resultados Considerados Abs620 Abs620 Mistura Amostra Padro Desconhecida 0,000 0,000 0,028 0,128 0,000 0,018 0,060 0,016 0,002 0,000 0,001 0,082 0,003 0,031 0,078 0,213 0,098 0,386 0,014 0,288 0,016 0,077

Veluio (mL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

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Absorvncia a 620 nm do Azul de Dextrano na Mistura Padro e na Amostra Desconhecida

0,420 0,400 0,380 0,360 0,340 0,320 0,300 0,280 0,260 0,240 0,220 0,200 0,180 0,160 0,140 0,120 0,100 0,080 0,060 0,040 0,020 0,000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Absorvncia a 620 nm

Azul Dextrano (Mistura Padro) Azul Dextrano (Amostra desconhecida)

Volume de Eluio /mL

Figura 1. Cromatograma de absorvncia a 620 nm do azul de dextrano na mistura padro e na amostra desconhecida Como se pode observar pela figura anterior (Figura 1), registou-se um mximo de absorvncia para o azul de dextrano aos 9 mL de eluio, a uma absorvncia de 620 nm (Abs620 = 0,098). O azul de dextrano tem uma massa molecular bastante elevada, como j foi dito e, por isso, no conseguiu penetrar nos poros do gel, sendo o primeiro composto a ser eludo. Em todos os ensaios realizados, verificou-se um mximo de absoro para este composto tambm aos 280 nm, por isso, para se comprovar que o azul de dextrano absorve, de facto, aos 620 nm e aos 280 nm, traou-se um espectro de absoro desta soluo, entre os 200 nm e os 700 nm.

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Figura 2. Espectro de absoro do azul de dextrano.

No espectro obtido, traado entre 200 e 700 nm observam-se ento dois mximos de absoro. Esses mximos so, aproximadamente, aos 280 e aos 620 nm, tal como esperado. No entanto, seria esperado que o mximo aos 620 nm fosse superior ao mximo a 280 nm. O que influncia as absorvncias medidas para as fraces, como exemplo, para a fraco 9, volume de eluio 9 mL, registou-se um mximo de absoro aos 620 nm, o valor da absorvncia obtido foi de 0,098 enquanto para o mesmo volume de eluio, a 280 nm o valor obtido foi de 0,499. Como j foi dito anteriormente, o objectivo da eluio do azul de dextrano o de determinar o volume morto da coluna cromatogrfica. Este composto vai ser o primeiro a ser eludo uma vez que no consegue penetrar nos poros do gel devido sua grande massa molecular, sendo assim o valor de Kav deste composto igual a 0. O volume morto da coluna, V m, corresponde, ento ao volume de eluio do azul dextrano que 9 mL.

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#2. Absorvncia da mistura padro + azul de dextrano a 620, a 410 e a 280 nm

Tal como explicado no procedimento, aplicou-se uma mistura de azul de dextrano com a mistura padro. Procedeu-se leitura de absorvncia de cada uma das fraces recolhidas e traou-se o respectivo cromatograma. Quadro 2. Valores de absorvncia obtidos durante a eluio da mistura com o azul de dextrano e considerados na construo do cromatograma Resultados obtidos Absorvncia 620 410 280 nm nm nm 0,000 0,000 0,000 0,028 0,019 0,016 -0,010 0,010 0,010 0,060 0,088 0,085 0,002 0,007 0,004 0,001 0,002 0,003 0,003 0,003 0,008 0,078 0,035 0,308 0,098 0,049 0,499 0,014 0,026 0,233 0,016 0,077 0,189 0,120 0,243 0,227 0,014 0,300 0,134 0,017 0,513 0,156 0,022 0,813 0,204 0,066 0,936 0,275 0,034 1,067 0,267 0,023 0,935 0,208 0,018 0,732 0,164 0,015 0,610 0,147 0,010 0,414 0,139 0,008 0,334 0,223 0,007 0,356 0,514 0,004 0,396 0,934 0,003 0,486 1,399 0,002 0,451 1,385 Resultados considerados Absorvncia 620 410 280 nm nm nm 0,000 0,000 0,000 0,028 0,019 0,016 0,000 0,010 0,010 0,06 0,088 0,085 0,002 0,007 0,004 0,001 0,002 0,003 0,003 0,003 0,008 0,078 0,035 0,308 0,098 0,049 0,499 0,014 0,026 0,233 0,016 0,077 0,189 0,120 0,243 0,227 0,014 0,3 0,134 0,017 0,513 0,156 0,022 0,813 0,204 0,066 0,936 0,275 0,034 1,067 0,267 0,023 0,935 0,208 0,018 0,732 0,164 0,015 0,610 0,147 0,01 0,414 0,139 0,008 0,334 0,223 0,007 0,356 0,514 0,004 0,396 0,934 0,003 0,486 1,399 0,002 0,451 1,385

Veluio (mL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

Cor Azul Azul Azul claro Amarelo claro Amarelo claro Amarelo Amarelo Amarelo Amarelo Amarelo Amarelo Amarelo claro Amarelo claro Amarelo claro Amarelo claro Amarelo Amarelo Amarelo

Composto

Azul Dextrano

BSA e Mioglobina

K2CrO4

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27 28 29 30 31 32 33 34 35 36

0,003 0,002 0,002 0,001 0,010 0,001 0,001 0,002 0,002 0,002

0,367 0,214 0,132 0,093 0,103 0,062 0,049 0,045 0,038 0,035

1,125 0,625 0,354 0,241 0,210 0,163 0,129 0,119 0,101 0,087

0,003 0,002 0,002 0,001 0,001 0,001 0,001 0,002 0,002 0,002

0,367 0,214 0,132 0,093 0,103 0,062 0,049 0,045 0,038 0,035

1,125 0,625 0,354 0,241 0,210 0,163 0,129 0,119 0,101 0,087

Amarelo Amarelo Amarelo claro Amarelo claro Amarelo claro Amarelo claro Amarelo claro -

K2CrO4

Absorvncia da Mistura Padro com Azul de Dextrano a 620, 410 e 280 nm

1,600 1,500 1,400

1,300
1,200

1,100

Absorvncia

1,000 0,900 0,800 0,700 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 Absorvncia a 620 nm Absorvncia a 410 nm Absorvncia a 280 nm

Volume de Eluio /mL

Figura 3. Cromatograma da eluio da mistura de mistura de azul de dextrano com a mistura padro.

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De forma a determinar quais os comprimentos de onda a que se deve monitorizar as diferentes separaes realizadas necessrio traar o espectro de absoro de cada um dos componentes que constituem a mistura, determinando a que comprimento de onda corresponde o seu mximo de absoro. , ento, a este comprimento de onda que se devem efectuar as leituras de absorvncia das fraces que contm o composto em questo. Assim, os comprimentos de onda usados para realizar as leituras de absorvncia das fraces eludas correspondem ao comprimento de onda mximo para cada um dos compostos que constituem a mistura. Sabendo que o azul de dextrano foi o primeiro composto a ser eludo (por apresentar maior massa molecular, poder afirmar-se que o primeiro pico do cromatograma corresponder ao azul de dextrano e, assim, o mximo de absoro do azul de dextrano ocorrer aos 620 nm. Para alm disto, nas fraces que, possivelmente, conteriam azul de dextrano, observa-se tambm um pico de absoro ao comprimento de onda de 280 nm. Estes factos so comprovados, tal como explicado anteriormente, quando se observa o espectro de absoro do azul de dextrano e se distinguem dois picos de absoro, um perto dos 280 nm e outro prximo dos 620 nm. Relativamente aos outros compostos constituintes da mistura padro (BSA, mioglobina e K2CrO4), pode supor-se que estes tero o seu mximo de absoro ao comprimento de onda de 410 nm. Esta concluso deve-se ao facto de se observarem picos de absorvncia correspondentes a estes compostos quando se l a absorvncia (das fraces que se supe que as contenham) a este comprimento de onda. Pelas razes atrs mencionadas, para a mistura do azul de dextrano com a amostra padro A efectuaram-se leituras de absorvncia aos comprimentos de onda de 280, 410 e 620 nm. Para interpretar o cromatograma obtido necessrio, em primeiro lugar, ter em conta que o tamanho e a forma das molculas so os factores dominantes em todo o processo de separao. Portanto, molculas com maior massa molecular relativa e com maior raio de Stokes no penetram nos poros do gel e, como tal, so as primeiras a ser eludas. Pgina | 10

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Conhecendo a massa molecular de cada um dos compostos que constituam a mistura aplicada na coluna cromatogrfica, facilmente se pode prever a ordem de eluio de cada um delas: 1 composto a ser eludo: Azul de Dextrano 2 composto a ser eludo: BSA 3 composto a ser eludo: Mioglobina 4 composto a ser eludo: K2CrO4 Procede-se, ento, anlise do cromatograma de forma a comprovar os pressupostos explicitados anteriormente. Pela anlise da absorvncia medida a 620 nm, observa-se um pico (mais saliente) correspondente a, aproximadamente, 9 mL. Este pico corresponde eluio do maior volume de azul de dextrano que, tal como se esperava, foi o primeiro composto a ser eludo. No entanto, tal como referido anteriormente, o azul de dextrano tambm absorve radiao a 280 nm, pelo que o pico que se observa a este comprimento de onda para o mesmo volume (9 mL) corresponde tambm eluio deste composto. Assim, conclui-se que o raio de Stokes do Azul de Dextrano superior ao dimetro dos poros do gel, pelo que este no tem capacidade de penetrar neste ltimo, tal como referido anteriormente. Relativamente curva que corresponde absorvncia medida a 410 nm, esta vai dar-nos informao acerca da segunda e da terceira protenas eludas, a BSA e a mioglobina. Na fraco correspondente a 17 mL eludos detecta-se a presena de um pico relativamente elevado de absorvncia. Este pico corresponde eluio da BSA, tal como esperado. No entanto, observa-se que se trata de um pico com uma largura bastante elevada, permitindo inferir que, a este volume, a BSA no foi a nica protena eluda, tendo sido eluda juntamente com a mioglobina. Sabe-se que a mioglobina possui menor massa molecular, quando comparada com a BSA logo, seria de esperar que esta tivesse ficado retida por mais tempo nos poros do gel, sendo-se recolhido apenas BSA a este volume de eluio. No entanto isto no aconteceu, dado que a

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mioglobina poder ter sido arrastada durante a eluio da BSA, tendo-se recolhido BSA (em maior quantidade) e um pequeno volume de mioglobina. Continuando a seguir o cromatograma ao nvel da absorvncia a 410 nm, detecta-se um novo e ltimo pico de absorvncia (menor que o anterior) a um volume de eluio de, aproximadamente, 25 mL. Conclui-se, ento, que este pico corresponde eluio do restante (e maior) volume de mioglobina que ter ficado retido na coluna aps a eluio do volume inicial acoplado eluio da BSA, o que comprova a diminuio da altura deste pico relativamente ao anterior. Este dado encontra-se de acordo com o esperado, uma vez que a mioglobina possui menor massa molecular que a BSA e, desta forma menor raio de Stokes. No que diz respeito curva da absorvncia medida a 280 nm, de salientar, essencialmente, a observao de dois picos a 9 e a 25 mL, respectivamente. O primeiro corresponde eluio do Azul de Dextrano, tal como referido, enquanto que o segundo pico corresponde eluio do K2CrO4. De facto, este composto aquele que apresenta menor massa molecular, pelo que faz todo o sentido que seja aquele que permanece retido nos poros do gel durante mais tempo e, como tal, o ltimo a ser eludo. Apesar disso, analisando o cromatograma, conclui-se que eludo, praticamente, em simultneo com a mioglobina nas fraces prximas dos 25 mL, ainda que em maior volume e em mais fraces que esta ltima. No geral conclui-se que a ordem de eluio verificada experimentalmente correspondeu quela que era suposto, sendo que o azul de dextrano foi aquele que permaneceu menor tempo na coluna (no foi retido pelos poros do gel), enquanto o K2CrO4 foi o composto que permaneceu mais tempo retido nos poros do gel. Assim, relativamente ao raio de Stokes, este assume um menor valor quando se trata deste ltimo composto. O volume morto da coluna corresponde ao volume presente no exterior das partculas do gel, ou seja, o volume de eluio de um composto de massa molecular elevada, o qual no consegue penetrar no interior dos poros do gel. Neste caso, dado que o Azul de Dextrano corresponde a um composto com as caractersticas acima descritas, o seu volume de eluio corresponde ao volume morto da coluna:

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O volume total diz respeito ao volume total do leito do gel na coluna e obtm-se conhecendo a altura ocupada pelo gel na coluna (39 cm) e o seu raio (0,65 cm):

Dado que o volume ocupado pelo gel um parmetro de difcil determinao, para caracterizar o comportamento de um composto, desprezando a contribuio do volume slido das partculas de gel para o volume total da coluna. Este parmetro corresponde ao Kav e dado por:

Em que Vt e V0 correspondem aos parmetros acima explicitados e Ve ao volume necessrio para a remoo de um determinado componente da coluna, ou seja, volume de eluio. Assim, procedeu-se ao clculo do Kav para cada um dos compostos eludos e, consoante esse resultado, interpreta-se da seguinte forma: Kav < 0: existem canais no leito do gel por onde as molculas podem passar facilmente ( necessrio proceder a novo empacotamento da coluna para que se possa proceder a uma cromatografia em condies correctas); Kav = 0: as molculas do soluto no podem penetrar nas partculas do gel; Kav < 1: as molculas do soluto encontram-se em maior percentagem no exterior do que no interior das partculas do gel; Kav = 1:as molculas de soluto encontram-se igualmente distribudas no interior e no exterior das partculas do gel; Kav> 1: as molculas do soluto encontram-se em maior percentagem no interior das partculas do que no seu exterior (ocorreu alguma adsoro das partculas do soluto ao gel). Pgina | 13

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Para o clculo do Kav dos compostos considera-se o seu volume de eluio (Ve) observado no cromatograma e usam-se os valores de Vt e V0 descritos anteriormente, os quais so iguais para cada um dos compostos. Azul de Dextrano (Mr=2 000 000 Da)

Albumina srica bovina (Mr=66 400 Da)

Mioglobina (Mr=16 900 Da)

K2CrO4 (Mr = 194 Da)

Os resultados obtidos nos clculos do Kav e a sua interpretao encontram-se sintetizados no quadro seguinte:

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Quadro 3. Valores

de Kav calculados para cada composto e respectiva interpretao. Kav 0 0,07 0,16 0,37 Interpretao No penetrou nos poros do gel. Encontra-se em maior percentagem no exterior do gel do que no interior. Encontra-se em maior percentagem (menor que no caso da BSA) no exterior do gel do que no interior. Encontra-se em maior percentagem (menor que no caso da mioglobina) no exterior do gel do que no interior.

Composto Azul de Dextrano BSA Mioglobina K2CrO4

O azul de dextrano, como j explicado no cromatograma 1, no entra nos poros do gel, Kav=0. Sendo um composto no retido pelo coluna, o seu volume de eluio corresponde ao volume morto. Relativamente BSA, obtm-se um Kav maior do que 0 e muito menor do que 1, ainda que, quando aproximado, corresponde a 0. Para a mioglobina, o Kav foi menor que o da protena anterior e, consequentemente, mais prximo de 1, ainda que bastante afastado desse valor. No que diz respeito ao cromato de potssio, o seu Kav maior que todos os anteriores e, consequentemente, mais prximo de 1. No geral, todos os valores de Kav calculados permitem confirmar as concluses retiradas da anlise dos cromatogramas, ou seja, a ordem de eluio de acordo com a diminuio da sua massa molecular. Segundo isto, conclui-se que a BSA se encontrava em maior quantidade no exterior do que nos interior dos poros do gel, passando-se o mesmo para a mioglobina e para o cromato de potssio. Comparativamente uns com os outros, pode dizer-se que o composto que se encontrava em maior quantidade no exterior dos poros do gel era o Azul de Dextrano, seguido da BSA, da mioglobina e, finalmente, do cromato de potssio. Em suma, a percentagem relativa de cada composto no exterior dos poros do gel consequncia da massa molecular de cada um deles e, portanto, do seu raio de Stokes. Desta forma, quanto maior a quantidade de composto no exterior dos poros do gel, mais rpida foi a eluio e, consequentemente, menor o seu tempo de reteno.

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Usando os valores de Kav calculados e conhecendo a massa molecular de cada um dos compostos constituintes da mistura padro traa-se a curva de calibrao da coluna. Os dados usados encontram-se especificados no quadro a seguir: Quadro 4. Valores usados na construo da curva de calibrao da coluna. Componente BSA Mioglobina K2CrO4 Kav 0,07 0,16 0,37 Mr (Da) 66400 16900 195 4,822 4,228 2,29

Relao linear entre Kav e o log10(Mr)

0,40 0,35

0,30
0,25 Kav 0,20 0,15 0,10

y = -0,116x + 0,6384 R = 0,9951

0,05
0,00 0 1 2 3 log10 (Mr) 4 5 6

Figura 4. Curva de calibrao da coluna. Atravs da equao onde A e B so duas constantes e

Mr o valor da massa molecular relativa de cada protena, traou-se uma regresso linear, a qual corresponde recta de calibrao [y corresponde ao Kav e x ao ].

Pela equao da recta de calibrao retira-se o valor das constantes A e B: A = 0,116 e B = 0,6384. Assim:

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#3. Absorvncia a 280 e a 620 nm da amostra desconhecida em funo do volume de eluio

A amostra aplicada na coluna consiste em 300 L de amostra desconhecida e 200 L de azul de dextrano. Da cromatografia de excluso molecular, obtiveram-se os seguintes resultados:

Quadro 5. Registos dos resultados obtidos para a amostra desconhecida Veluio (mL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Resultados Obtidos Resultados considerados

Absorvncia 620 nm 280 nm -0,005 -0,001 0,128 0,105 0,018 0,056 0,016 0,053 -0,003 0,017 0,082 0,098 0,031 0,077 0,213 0,397 0,386 0,645 0,288 0,573 0,054 0,323 0,064 0,249 0,089 0,202 0,098 0,167 0,172 0,151 0,159 0,141 0,019 0,081 0,002 0,042 -0,003 0,011 -0,003 0,010 -0,004 0,006 -0,004 0,006 0,053 0,092 -0,004 0,003

Absorvncia 620 nm 280 nm 0,000 0,000 0,128 0,105 0,018 0,056 0,016 0,053 0,000 0,017 0,082 0,098 0,031 0,077 0,213 0,397 0,386 0,645 0,288 0,573 0,054 0,323 0,064 0,249 0,089 0,202 0,098 0,167 0,172 0,151 0,159 0,141 0,019 0,081 0,002 0,042 0,000 0,011 0,000 0,010 0,000 0,006 0,000 0,006 0,053 0,092 0,000 0,003

Cor

Composto

Azul Azul Azul Azul -

Azul de Dextrano

Amostra desconhecida

Note-se que se mediu a absorvncia a 280 e a 620 nm porque amostra desconhecida juntou-se azul de dextrano, e como mostrado anteriormente, so os comprimentos de onda onde os valores de absorvncia so mximos. Como se

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obtiveram valores de absorvncia negativos, esses valores foram considerados zero, e obteve-se o seguinte cromatograma:

Absorvncia da Amostra Desconhecida a 280 e a 620 nm

0,700 0,650 0,600 0,550 0,500 0,450 0,400 0,350 0,300 0,250 0,200 0,150 0,100 0,050 0,000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Volume de Eluio (mL)

Absorvncia a 280 nm

Absorvncia a 280 nm Absorvncia a 620 nm

Figura 5. Absorvncia a 280 e a 620 nm da amostra desconhecida em funo do volume de eluio.

Numa cromatografia de excluso molecular a separao das molculas efectuada com base na sua massa molecular relativa ( ), ou seja, molculas com maior so

menos retidas pelo gel da coluna sendo eludas primeiro, enquanto molculas com menor so mais retidas pelo gel da coluna por entrarem nos seus poros sendo as

ultimas a serem eludas. Assim, a ordem de eluio d-se das molculas com maior para molculas com menor .

Sabendo que a massa molecular relativa do azul de dextrano cerca de 2 000 000 Da, pode-se afirmar que este ser o primeiro composto a ser eludo, constituindo o composto que no retido pela coluna, ou seja, o seu volume de eluio corresponde ao volume morto da coluna ( ). Assim, atravs do cromatograma da mistura padro (Figura 3), da observao do quadro e da representao grfica anterior (Quadro 5 e Figura 5, respectivamente) possvel identificar que o volume de eluio do azul de dextrano 9 mL, seguindo-se, depois, a eluio da amostra desconhecida Pgina | 18

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No segundo cromatograma (cromatograma da mistura padro) atravs do clculo do coeficiente de distribuio, Kav, para cada componente da mistura e da sua relao linear com o logaritmo de base 10 do valor da massa molecular relativa, obteve-se uma recta de calibrao com equao: ,

Atravs da equao anterior, calculando o Kav da amostra desconhecida possvel determinar a massa molecular relativa do composto desconhecido e compar-la dos compostos da mistura padro. Ento, para a amostra desconhecida, que corresponde ao pico do cromatograma que segue o azul de dextrano, o volume de eluio 15 mL logo o seu Kav :

Substituindo na equao da recta de calibrao obtm-se:

Ao comparar a massa molecular relativa obtida com a dos componentes da mistura padro possvel verificar que existe uma grande discrepncia entre massa molecular dos componentes da mistura padro e da amostra desconhecida, podendo ento concluir-se erroneamente que a amostra desconhecida no se encontrava na mistura padro. No entanto, possvel prever que a massa molecular relativa obtida encontra-se abaixo do valor real devido a erros experimentais e s aproximaes realizadas na utilizao de uma curva de calibrao. Durante a aplicao da mistura da amostra desconhecida com o azul de dextrano, o topo da coluna secou o que conduziu abertura de fendas no gel. Assim, a entrada da mistura no gel exigiu um maior volume de eluio, o que aumenta o Kav obtido (maior volume de eluio da amostra), e como tal a massa molecular relativa obtida menor que a real. Na utilizao de uma curva de calibrao admite-se que a separao dos compostos de uma mistura apenas condicionada por efeitos estreos e de partio no caso de se estabelecerem interaces entre os componentes, o volume de eluio ser maior do que o suposto o que resulta no clculo de uma massa molecular relativa inferior real, como o caso. Pgina | 19

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Como a massa molecular relativa da amostra calculada inferior real, quando comparada com a mistura padro, poder estimar-se que a amostra desconhecida era albumina srica bovina (BSA) com massa molecular relativa de 66 400 Da.

Discusso global dos resultados obtidos

Atravs dos cromatogramas traados foi possvel determinar o volume morto da coluna, calcular o Kav dos diferentes componentes da mistura padro e preparar a curva de calibrao da coluna. O grfico de eluio do azul de dextrano permitiu calcular o volume morto da coluna, uma vez que a massa molecular relativa deste composto da ordem dos 2000 kDa e, como o gel utilizado apresenta a sua gama de fraccionamento entre os 8 e 80 kDa, este vai ser totalmente excludo pelas partculas do gel. Esta excluso observada visivelmente devido cor azul do composto utilizado e podemos concluir que volume de eluio do azul de dextrano se deu at aos 9 mL (que corresponde tambm ao mximo de absorvncia a 620 nm), pelo que este volume corresponde ao volume morto. No entanto, em todos os ensaios realizados, verificou-se um mximo de absoro para este composto tambm aos 280 nm, por isso, para se comprovar que o azul de dextrano absorve a estes dois comprimentos de onda 620 nm e 280 nm , traou-se um espectro de absoro desta soluo, entre os 200 nm e os 700 nm. Como este composto vai ser o primeiro a ser eludo devido sua grande massa molecular e consequente no penetrao nos poros do gel, o valor de Kav do azul de dextrano igual a 0. Traou-se tambm o cromatograma da mistura de azul de dextrano com a mistura padro e procedeu-se leitura de absorvncia de cada uma das fraces recolhidas. Os comprimentos de onda usados para realizar estas leituras correspondem ao comprimento de onda mximo para cada um dos compostos que constituem a mistura. Relativamente aos compostos constituintes da mistura padro (BSA, mioglobina e K2CrO4), sups-se que estes teriam o seu mximo de absoro ao comprimento de onda Pgina | 20

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de 410 nm, uma vez que se observaram picos de absorvncia correspondentes a estes compostos quando se l a absorvncia, das fraces que se supe que os contenham, a este comprimento de onda. Portanto, para o traar do cromatograma, foram lidas as absorvncias para os comprimentos de onda de 280 nm, 410 nm e 620 nm. Uma vez conhecendo a massa molecular relativa de cada um dos compostos que constituam a mistura aplicada na coluna cromatogrfica e tendo em conta que o tamanho e a forma das molculas so os factores dominantes em todo o processo de separao, facilmente se pode prever a ordem de eluio de cada um delas, visto que molculas com maior massa molecular relativa e com maior raio de Stokes no penetram nos poros do gel e, como tal, so as primeiras a ser eludas, seguindo-se as de menor massa. Assim, a ordem prevista para a eluio seria: azul de dextrano, BSA, Mioglobina, K2CrO4, respectivamente por ordem decrescente de massa molecular relativa. Pela anlise do cromatograma 2 (Figura 3), observa-se um pico (mais saliente) da absorvncia medida a 620 nm, correspondente a, aproximadamente, 9 mL. Este pico corresponde eluio do maior volume de azul de dextrano que, tal como se esperava, foi o primeiro composto a ser eludo. O pico que se observa ao comprimento de onda de 280 nm para o mesmo volume de azul de dextrano corresponde tambm eluio deste composto, uma vez que este tambm absorve radiao a 280 nm, como j foi dito. A curva que corresponde absorvncia medida a 410 nm d-nos informao acerca da segunda e da terceira protenas eludas, a BSA e a mioglobina. Na fraco correspondente a 17 mL eludos detecta-se a presena de um pico relativamente elevado de absorvncia. Este pico corresponde eluio da BSA, tal como esperado. No entanto, como se tratou de um pico com uma largura bastante elevada, permitiu assumir que, a este volume, a BSA no foi a nica protena eluda, tendo sido eluda juntamente com a mioglobina. Aos 25 mL de eluio detectou-se um novo e ltimo pico de absorvncia, concluindo-se, ento, que este pico corresponde eluio do restante volume de mioglobina. A diminuio da altura deste pico relativamente ao anterior deve-se ao facto de ter sido eludo volume de mioglobina inicial acoplado eluio da BSA. Este dado tambm se encontra de acordo com o esperado, uma vez que a

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mioglobina possui menor massa molecular que a BSA e, desta forma menor raio de Stokes. No que diz respeito curva da absorvncia medida a 280 nm, de salientar, essencialmente, a observao de dois picos: 9 e 25 mL, respectivamente. O primeiro corresponde eluio do azul de dextrano, como j foi referido, enquanto o segundo pico corresponde eluio do K2CrO4. De facto, este composto aquele que apresenta menor massa molecular, pelo que permaneceu retido nos poros do gel durante mais tempo e, como tal, foi o ltimo a ser eludo. Apesar disso, atravs da anlise do cromatograma, concluiu-se que eludo praticamente em simultneo com a mioglobina. Os resultados obtidos para os valores de Kav foram, respectivamente, para o azul de dextrano, BSA, mioglobina e K2CrO4:0, 0,07, 0,16 e 0,37. Os valores de Kav calculados permitiram confirmar as concluses retiradas da anlise do cromatograma, ou seja, a ordem de eluio de acordo com a diminuio da sua massa molecular assim como traar a curva de calibrao da coluna (Figura 4). Foi traado tambm o cromatograma da mistura de azul de dextrano com a mistura desconhecida e procedeu-se leitura de absorvncia de cada uma das fraces recolhidas. Pela observao do cromatograma 3 (Figura 5) foi possvel identificar que o volume de eluio do azul de dextrano foi de 9 mL, seguindo-se, depois, a eluio da amostra desconhecida. Atravs da equao obtida no cromatograma 2 possvel determinar a massa molecular relativa do composto desconhecido e compar-la dos compostos da mistura padro, calculando o Kav para os picos obtidos na eluio da mistura desconhecida. Ento, para a amostra desconhecida, que corresponde ao pico do cromatograma que segue o azul de dextrano, o volume de eluio 15 mL pelo que o seu valor de Kav de 0,14. A massa molecular relativa obtida foi de 19 670 Da. A comparao deste valor com o dos componentes da mistura padro permite verificar que existe uma grande discrepncia entre a massa molecular dos componentes da mistura padro e da amostra desconhecida, concluindo-se erroneamente que a amostra desconhecida no se encontrava na mistura padro. Erroneamente porque durante a aplicao da mistura da amostra desconhecida com o azul de dextrano, o topo da coluna secou o que conduziu abertura de fendas no gel. Assim, a entrada da mistura no gel Pgina | 22

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exigiu um maior volume de eluio, o que aumenta o Kav obtido e como tal a massa molecular relativa obtida menor que a real. Sendo a massa molecular relativa da amostra calculada inferior real, quando comparada com a mistura padro, poder estimar-se que a amostra desconhecida era albumina srica bovina (BSA) com massa molecular relativa de 66 400 Da.

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Concluso
Atravs do mtodo cromatogrfico de excluso molecular, baseado na velocidade de migrao das partculas em funo do seu raio de Stokes e da sua massa molecular relativa, Mr, procurou-se determinar a massa molecular de uma protena desconhecida, tendo por base o comportamento de uma amostra padro. Atravs do cromatograma obtido para a mistura padro com azul de dextrano, e tal como era esperado, a ordem de eluio dos componentes foi a seguinte: azul de dextrano, BSA, mioglobina e K2CrO4 (cromato de potssio), que corresponde a uma ordem decrescente de valores de massas moleculares relativas. Atravs do clculo do volume morto, correspondente ao volume de eluio do azul de dextrano (V0=9mL) foi possvel estabelecer uma relao de Kav entre os diferentes componentes e as suas respectivas Mr. Para o azul de dextrano, o valor de Kav obtido foi igual zero, o que coincide com o valor previsto, uma vez que este composto apresenta uma massa molecular relativa bastante elevada e superior ao limite de excluso do gel, para o BSA, mioglobina e cromato de potssio, os Kav so superiores a 0 e inferiores a 1, assumindo valores distintos entre si devido s suas diferentes massas moleculares relativas. Atravs destes valores de Kav, foi possvel traar uma recta de calibrao de onde se obteve o valor da massa molecular relativa da amostra desconhecida. Apesar do valor obtido para a massa molecular da protena desconhecida no ter correspondido a nenhuma das massas moleculares relativas da amostra padro, estimouse, por comparao com os componentes da mistura padro, que a amostra desconhecida era BSA.

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Bibliografia
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