UNIVERSIDAD DEL CAUCA Facultad de Ciencias Naturales, Exactas y de la Educacion Departamento de Quimica

Laboratorio de Bioquimica I Periodo de 2011

Pruebas Generales para Aminocidos y Protenas

David Alejandro Mera Benavides1, Mnica Alexandra Rodrguez Burbano1, Daniel Mauricio Sarmiento Torres1
1

Ingenieria Ambiental, Facultad de Ingeniera Civil, Universidad del Cauca, Carrera 2 con Calle 15 Norte Esquina, Sector Tulcn - Edificio de Ingenieras, Popayn, Cauca, Colombia Recibido: 4 de Abril de 2011 Resumen En la prctica de laboratorio, se usaron distintas pruebas para la caracterizacin de aminocidos tales como: la prueba Xantoprotica, la de Biuret, la de Nihidrina, Hopkins-Cole, Ehrlich. Esto con el fin de ver las caractersticas y propiedades de las pruebas y de los aminocidos estudiados. La muestra problema en la prctica, es el triptfano, aunque haya dado negativo para la prueba de Ehrlich. Palabras claves: estructuras de aminocidos, pruebas de cualificain de aminocidos Abstract In the actual laboratory, different tests for the characterization from amino acids were used such as: the Xantoprotica test, the one of Biuret, the one of Nihidrina, Hopkins-Cole, Ehrlich. This with the purpose of to see the characteristics and properties of the tests and the studied amino acids. The sample problem actually, is the triptfano, although it has given negative for the test of Ehrlich. Key words: structures of amino acids, tests of cualificain of amino acids

Introduccin: Los aminocidos forman parte de todas las clulas de los seres vivos, y participan en muchas reacciones bioqumicas del cuerpo. Los aminocidos son los componentes de las protenas de tejidos estructurales del cuerpo, y son esenciales para la vida. Desempean un papel importante en funciones de neurotransmisores, regulacin del factor pH, metabolismo del colesterol, control del dolor y de inflamacin y en los procesos de desintoxicacin. La medicin de de cualificacin y cuantificacin de aminocidos es una parte integral de toda evaluacin metablica y alimenticia. Las protenas son compuestas de carbono, oxigeno hidrogeno y nitrgeno. La mayora de ellas contienen adems azufre, y algunos fsforos. Sus molculas son de proporciones coloidales, todas son muy complejas molecularmente y tienen alto peso molecular. La molcula proteica esta compuesta de una combinacin de aminocidos por condensacin. Las pro teosas, peptonas, pptidos y aminocidos son derivados de las protenas formados en sntesis e hidrlisis. Hay ciertas reacciones coloreadas que dan las protenas y dependen de los aminocidos presentes en la molcula pro-

teica. Se basan en reacciones tpicas de los aminocidos dependiendo de la estructura de stos y con eso lleva a la distinta coloracin o incoloracin de las sustancias. Objetivos: Reconocer la presencia de Aminocidos y Protenas en una muestra a travs de la realizacin de pruebas generales bioqumicas de identificacin. Conocer la importancia y sus principales caracterstica de los Aminocidos y Protenas en Bioqumica.

Consultas Preliminares:

1.

Aminocidos Esenciales y no Esenciales:

De los 20 aminocidos que se combinan para formar las protenas, algunos pueden ser sintetizados por el organismo, por lo que se denominan no esenciales (alanina, arginina, cido asprtico, asparragina, cistena, cido glutmico, glutamina, glicina, prolina, serina y tirosina). Hay otros, los denominados aminocidos esenciales o indispensables que,

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sin embargo, no pueden ser sintetizados por el hombre por lo que tienen que ser aportados por los alimentos, por la dieta, condicionando su esencialidad. Estos son: histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptfano y valina. La arginina puede ser esencial para los nios muy pequeos ya que sus requerimientos son mayores que su capacidad para sintetizar este aminocido. Hay tambin dos aminocidos no esenciales que se forman a partir de otros esenciales: cistena (y cistina) a partir de metionina y tirosina a partir de fenilalanina. Si la dieta no aporta suficiente cantidad de fenilalanina o si el organismo no puede transformar la fenilalanina en tirosina por algn motivo como sucede en la enfermedad hereditaria denominada fenilcetonuria-, entonces la tirosina se convierte en esencial. 2. Frases R y S:

Hidrxido de Sodio: R35: Provoca quemaduras graves. S26: En caso de contacto con los ojos, lvense inmediata y abundantemente con agua y acdase a un mdico. S37/39: sense guantes adecuados y proteccin para los ojos/la cara. S45: En caso de accidente o malestar, acdase inmediatamente al mdico (si es posible, mustrele la etiqueta). Acido Sulfanilico: R36: Irrita los ojos. R38: Irrita la piel. R43: Posibilidad de sensibilizacin en contacto con la piel. S24: Evtese el contacto con la piel. S37: sense guantes adecuados. Hidrxido de Amonio: R34: Provoca quemaduras. R50: Muy txico para los organismos acuticos. S26/37/39: sense indumentaria y guantes adecuados y proteccin para los ojos/la cara. S45: En caso de accidente o malestar, acdase inmediatamente al mdico (si es posible, mustrele la etiqueta). S61: Evtese su liberacin al medio ambiente. Recbense instrucciones especficas de la ficha de datos de seguridad. Acido Actico: R10: Inflamable. R35: Provoca quemaduras graves. S23: No respirar los gases/humos/vapores/aerosoles [denominacin(es) adecuada(s) a especificar por el fabricante]. S26: En caso de contacto con los ojos, lvense inmediata y abundantemente con agua y acdase a un mdico. S36/37/39: sense indumentaria y guantes adecuados y proteccin para los ojos/la cara. S45: En caso de accidente o malestar, acdase inmediatamente al mdico (si es posible, mustrele La etiqueta). Nitrito de Sodio:

Acido Ntrico: R35: Provoca quemaduras graves. S23: No respirar los gases/humos/vapores/aerosoles [denominacin(es) adecuada(s) a especificar por el fabricante]. S26: En caso de contacto con los ojos, lvense inmediata y abundantemente con agua y acdase a un mdico. S36/37/39: sense indumentaria y guantes adecuados y proteccin para los ojos/la cara. S45: En caso de accidente o malestar, acdase inmediatamente al mdico (si es posible, mustrele la etiqueta). Sulfato Cprico: R22: Nocivo por ingestin. R36/38: Irrita los ojos y la piel. S22: No respirar el polvo. Ninhidrina: R22: Nocivo por ingestin. R36/37/38: Irrita los ojos, la piel y las vas respiratorias. Acido Sulfrico: R35: Provoca quemaduras graves. S26: En caso de contacto con los ojos, lvense inmediata y abundantemente con agua y acdase a un mdico. S30: No echar jams agua a este producto. S45: En caso de accidente o malestar, acdase inmediatamente al mdico (si es posible, mustrele la etiqueta).

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R8: Peligro de fuego en contacto con materias combustibles. R25: Txico por ingestin. S45: En caso de accidente o malestar, acdase inmediatamente al mdico (si es posible, mustrele la etiqueta).

Datos y Resultados:

Tabla #1: Resultados de las pruebas de coloracin de Aminocidos y Protenas.

PRUEBA Ovoalbumina Gelatina Asparagina Histidina Triftofano Muestra Problema Agua

XANTOPROTEICA +(Amarillo) - (Incolora) - (Incolora) - (Incolora) +(Naranja) +(Naranja) - (Incolora)

BIURET + + + -

NINHIDRINA + (Violeta) - (Incolora) + (Naranja) + (Violeta) + (Azul Oscuro) + (Violeta) - (Incolora)

HOPKINS - COLE + + + -

EHRLICH + (Rojo) - (Naranja Oscuro) -(Naranja) + (Rojo) + (Rojo) -(Naranja) - (Naranja)

Identificacin de Muestra problema:

Triptfano

anillos aromticos activos (lo que indica que pueden nitrarse). El aminocido fenilalanina tambin tiene en su estructura un anillo aromtico pero no est activado, por lo tanto no va por el proceso de nitracin fcilmente. La reaccin de nitracin, cuando se usa para identificar la presencia de un benceno activo, es llamada la prueba xantoprotica. Es llamada xantoprotica porque la palabra xantoprotica viene de la palabra griega xanthos , que significa amarillo. El producto de la reaccin es amarillo. La intensidad del color depende si la reaccin ocurre en una solucin bsica. Esta reaccin tambin ocurre cuando se derrama cido ntrico en la piel. Las protenas de la piel que

Anlisis y Discusion

Prueba Xantoprotica Algunos aminocidos contienen grupos aromticos que derivan del benceno. Una reaccin caracterstica del benceno y sus derivados, es la nitracin del benceno con cido ntrico. Los aminocidos tirosina y triptfano contienen

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contienen tirosina y triptfano, se vuelven amarillas porque se nitratan. En la prctica del laboratorio, la prueba dio positivia para la muestra problema, el triptfano y la la albmina. Este resultado es debido a que en la estructura del triptfano se encuentra un anillo aromtico:

Reaccin de biuret Al llevar a cabo esta reaccin se noto un cambio de color para la albumina, gelatina y la asparagina, el color al que cambio fue violeta, mientras que para los restantes se torno azul. La presencia de protenas en una solucin se puede determinar mediante la reaccin del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solucin acuosa alcalina gracias a la presencia de NaOH . La reaccin se basa en la formacin de un compuesto de color violeta, debido a la formacin de un complejo de coordinacin entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos.

O C HN

C O NH HC R Cu2+ C O NH HC R

(Figura 1. Estructura del triptfano)

R CH

En la albmina tambin da positiva la prueba ya que en su estructura contienen aminocidos como la leucina, isoleucina, lisina, fenilalanina, treonina, triptfano y valina. De los cuales la fenilalanina (fig 2.) y el triptfano tienen un anillo aromtico, por lo tanto reaccionara con estos dos aminocidos para que de una coloracin amarilla. En la muestra problema, la prueba nos di positiva; indicando que en la sustancia desconocida, se encuentra un anillo aromtico. En las dems muestras, nos dio negativa. Esto se debe a que ninguna de las dems muestras posee un anillo aromtico en su estructura.

O C HN R CH

La gelatina, aasparagina y albumina poseen enlaces peptidicos y protenas para las cuales la prueba debera ser positiva, las dems soluciones dan negativas ya que estas muestras no presentan pptidos ni protenas. Prueba de Ninhidrina El grupo alfa-amino de los aminocidos forma complejos coloreados con la ninhidrina: violeta azuloso en la mayora de los aminocidos cuyo grupo amino es primario, amarillo para la prolina e hidroxiprolina y caf para la asparagina que tiene un grupo amino en la cadena lateral. Esta reaccin tambin identifica los grupos alfa-amino libres presentes en pptidos y protenas.

Ovoalbumina: La prueba es postiva, en la gran cadena larga de aminocidos, esta protena contiene a lo largo de su cadena de aminocidos grupos amino el cual es primario.

(fig 2. Estructura de la fenilalanina)

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Gelatina: La prueba es negativa, la gelatina esta compuesta de colgeno, la cual no contiene en su estructura grupos aminos, por tanto es incolora a esta prueba. Asparagina: La prueba es postiva, dando un color naranja o amarillo oscuro, es color tenue entre el color caf tambin, esto demuestra que la Asparagina contiene un grupo amino en la cadena lateral. Histidina: La prueba es positiva, este aminocido contiene un grupo amino en uno de sus extremos. Triftofano: La prueba es positiva, al igual que la Ovoalbumina, la Asparagina y la Histidina, este aminocido contiene un grupo amino en su estructura. Muestra Problema La prueba es positiva, para seguir constryendo la estructura de este aminoacido o protena, un elemento que la constituye, es un grupo amino en su cadena. Agua: La prueba es negativa, por no ser un aminoacido o una protena, obviamente adems de su estructura, no contiene ningn grupo amino en su estructura, su formula como se sabe es H2O. Reaccin de Hopkins-Cole El resultado positivo de esta prueba se puede evidenciar con el anillo indolico que degrada el aminocido triptfano a Indol produciendo compuestos de color rojizo- anaranjado. A diferencia del triptfano, el Indol es soluble en el alcohol y slo este compuesto reaccionar con el aldehdo produciendo el anillo coloreado caracterstico de esta prueba. Con las soluciones de gelatina, asparagina, histidina, y agua la prueba dio negativa, pero con la albumina, el triptfano y la muestra problema se evidencio la formacin del anillo indolico, por lo que esta ultima debe tener como uno de sus componentes el triptfano.

Prueba de Ehrlich La presencia de anillos aromticos fenlicos o nitrogenados en la cadena lateral de los Aminocidos se puede identificar mediante la reaccin con cido sulfanlico y nitrito de Sodio por formacin de sales de Diazonio fuertemente coloreadas permitiendo as detectar la presencia de Tirosina e Histidina libres o formando pptidos y protenas. Ovoalbumina: La prueba es positiva, demostrando asi la presencia de aniilos fenolicos o nitrogenados, ambos provenientes de benceno, en la cadena de aminocidos de esta protena.
Gelatina: La prueba es negativa, observndose un color

peculiar naranja oscuro, como se muestra el colgeno no contiene anillos fenolicos o nitrogenados. Asparagina: La prueba es negativa, este aminoacido no contiene en su estructura ningn anillo fenolico o nitrogenado. Histidina: La prueba es positiva, debido a que la prueba de Elrich identifica en protenas, aminoacidos como la Histidina y la Tirosina, por lo tanto esta prueba da un colo rojo intenso. Triftofano: La prueba es positiva, fuerte color rojo, el triftofano en su estrucura contiene un anillo nitrogenado. Muestra Problema: La prueba es negativa, esta proteinao aminocido no contiene ningn anillo nitrogenado o fenolico. Agua: La prueba es negativa, el agua no contiene en su estructura anillos organicos de ningn tipo.

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Identificacin de la muestra problema Se estableci que la muestra problema era una solucin con el aminocido triptfano. Esto se debe a lo siguiente: En la prueba de la nihidrina, se obtuvo que es positiva, por lo tanto deba ser una protena, un polipptido o un aminocido ya que estos tienen grupos amino. La muestra problema dio negativa para el test de Biuret, indicando que se trata de un aminocido y no de una protena o un polipptido. Esto se debe a que da positiva para las sustancias con enlaces peptdicos las cuales son protenas y polipptidos. Sabiendo que es un aminocido, la prueba Xantoprotica nos ayuda a determinar ms especficamente qu tipo de aminocido es. La muestra dio positiva, indicando que en la estructurta de la muestra problema, se encuentra un anillo aromtico. Por lo tanto, el aminocido puede ser la fenilalanina, tirosina o triptfano. Cuando En la prueba de Hopkins-Cole, di positiva para la muetra problema, se pudo determinar que el aminocido es triptfano. Esto se debe a que esta prueba da positiva especficamente para el aminocido triptfano ya que en la prueba, se evidencia la presencia del anillo indolico, indicando que se ha degradado el aminocido triptfano. La prueba de Ehrlich dio positiva con el triptfano ya que ste contienen un anillo nitrogendo (fig 1.). Pero con la muestra problema, di negativa, indicando una contradiccin. Esto se puede deber a que al ser la ltima prueba que se realizara, tuvo ms probabilidad de que sta fuera contaminada o que los materiales utilizados estuviesen ms propensos al ser contaminados con otros reactivos y/o sustancias usadas en la prctica.

2. Reaccin con la albmina:

3. Las protenas que dan positivo para la prueba de Hopkins-Cole son las protenas que contengan el aminocido triptfano ya que la prueba da positiva indicando un anillo indlico cuando hay presencia de este aminocido

Preguntas Complementarias: 1. Conclusiones Existen diferentes pruebas para la identificacin de protenas y aminocidos que permiten establecer un resultado positivo o negativo de acuerdo a las caractersticas y composicin de cada una de ellas, evidenciado en coloraciones, presencia de anillos, etc. Se establecieron las caractersticas de estas pruebas para la identificin cualitativa de sustancias que pueden contener aminocidos, protenas o pptidos. Y cuando se usan varias pruebas en la muestra, se pueden determinar ciertas sustancias en especfico El aminocido de la muestra problema fue el triptfano. Aunque en la prueba de Ehrich haya dado negativo, esto se

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debe a la contaminacin de la muestra problema y materiales usados en la prctica. Bibliografa:

http://webdelprofesor.ula.ve/farmacia/gmendez/manuales% 20PDF/EXPERIMENTO%202%20IDENT%20AA%200604.pdf visitado el 01 de Abril de 2011 http://www.cerlabs.com/experiments/10875404480.pdf visitado el 01 de Abril de 2011 http://es.scribd.com/doc/2309987/Proteinas-y-susreacciones visitado el 02 de Abril de 2011 GRANADOS Jairo Enrique, y GARCA Anselmo. fsico qumica aplicada. primera edicin. Editorial Unisur. Santa fe de Bogot, Colombia, 1995. pgs. 351-377, 383.