1

PERCOBAAN I PENENTUAN BEBERAPA PARAMETER FARMAKOKINETIK TUJUAN 1. Menetapkan laju eliminasi (K); waktu paruh (t), tetapan laju absorpsi (Ka) dari suatu obat dengan menggunakan data sampel darah setelah pemberian dosis tunggal. 2. Menentukan luas daerah di bawah kurva (AUC). PENDAHULUAN Kadar obat dalam darah setelah pemberian dosis tunggal secara oral akan diperoleh kurva sebagai berikut : II CPo Log Kadar I

t (jam) 0 t1 t2 t3 t4 t5 t6 t7 t8

Fase I : Fase ascending, dimana dDa/dt > dDe/dt Fase I : Fase descending, dimana dDe/dt > dDa/dt Dengan mengetahui log konsentrasi pada t5, t6 dan t7 dapat dibuat persamaan garis II, dimana pada titik potong garis tersebut dengan sumbu Y akan diperoleh konsentrasi obat dalam darah pada t = 0 atau Cpo, sedangkan arah lereng (tg ) dikalikan dengan 2,303 akan diperoleh nilai K. K = slop x 2,303 t = Cara mendapatkan nilai Ka diperoleh dengan melalui dengan beberapa tahap : 1. Log konsentrasi obat pada t1, t2, t3 sehingga dapat dibuat persamaan garis I. 2. Dengan memasukan nilai t1, t2, t3 pada persamaan I, akan diperoleh C1-I, C2-I, C3-I sedangkan pada persamaan II akan diperoleh C1-II, C2-II, C3-II. 3. Pengurangan nilai C1-II dengan C1-I ; C2-II dengan C2-I ; C3-II dengan C3-I ; akan diperoleh C1diff, C2diff, dan C3diff. 4. Dengan menggunakan log dari ketiga nilai C ini, dapat dibuat persamaan yang menunjukan nilai Ka. Ka = slop x 2,303 CATATAN 1. Periode sampling paling sedikit 3-4 x waktu paruh obat. 2. Pada fase absorpsi paling sedikit 3 titik, pada daerah puncak juga 3 titik dan pada fase eliminasi juga 3 titik. 3. Untuk menentukan faktor F (fraksi obat terabsorpsi) harus dibandingkan dengan pemberian I.V. Daerah dibawah kurva (AUC = Area Under Curv) adalah integral kadar obat didalam darah dari waktu t 0 sampai t , dimana besarnya AUC berbanding langsung dengan jumlah total obat yang diabsorpsi.
LABORATORIUM BIOFARMASI
,

AUC merupakan salah satu parameter untuk menetapkan bioavaibilitas (ketersediaan hayati). Cara yang paling sederhana untuk menghitung AUC adalah dengan metode trapezoid. Kurva kadar obat didalam darah vs waktu dijadikan beberapa trapezium, kemudian setiap luas trapezium tersebut dihitung kemudian dijumlahkan. Cara lain adalah metode penimbangan : buat kurva kadar obat dalam darah vs waktu pada kertas grafik, kemudian daerah yang terbentuk dipotong dan selanjutnya ditimbang pada timbangan analitis. Berat potongan grafik ini berbanding lurus dengan besarnya AUC. BAHAN DAN ALAT YANG DIGUNAKAN 1. Larutan natrium salisilat 5% 2. Larutan antikoangulan : kalium oksalat dalam air, dengan dosis 20 mg/10 mL darah. 3. Reagens pengendap dan pewarna : R/ HgCl2 8,0 g Feri nitrat 8,0 g HCl 1 N 24,0 mL Aquades ad 200,0 mL HEWAN UJI YANG DIGUNAKAN Tikus putih jantan atau kelinci jantan dewasa dan sehat. CARA KERJA 1. Berikan sejumlah dosis (250 mg/kg BB) secara oral pada hewan uji yang telah dipuasakan. Sebelumnya, ambil sampel darah sebanyak 0,5 mL untuk blanko (t = 0). 2. Selanjutnya tentukan kadar Natrium salisilat didalam darah pada 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, dan 240 menit setelah pemberian. (lihat cara analisis kadar Na salisilat di dalam sampel darah). 3. Buat grafik kadar obat didalam plasma (Cp) vs waktu. 4. Tentukan K (tetapan laju eliminasi) dari kurva fase descending (menurun) dari kurva askending (menanjak) tentukan harga C diff. 5. Dengan menggunakan harga C diff dapat dibuat persamaan garis dan tentukan nilai Ka (tetapan laju absorpsi). 6. Tentukan waktu paruh biologisnya (t ). 7. Buat pada kertas grafik numerik grafik hubungan antara kadar obat dalam darah (mcg/mL) dengan waktu, tentukan AUC dengan 2 cara : a. Metode penimbangan b. Metode trapezoid. CARA ANALISIS KADAR Na SALISILAT DALAM SAMPEL DARAH Kedalam tabung sentrifuge yang berisi 5,0 mL reagens pengendap protein dan pewarna dimasukkan 0,5 mL darah yang sudah diberi antikoangulan. Campur baik-baik dan (sentrifuge) campuran tersebut selama 5 menit. Ambil supernatan dan baca absorbans pada panjang gelombang 540 nm, bandingkan dengan blanko. DATA YANG DIPEROLEH No. BB (Kg) Dosis obat (mg) 15 30 Absorbans pada menit 45 60 90 120 150 180 240

LABORATORIUM BIOFARMASI

PERCOBAAN II PENENTUAN VLUME DISTRIBUSI TUJUAN Mempelajari distribusi obat dalam tubuh dari oabt yang diberikan secara I.V maupun oral. PENDAHULUAN Volume distribusi adalah suatu parameter farmakokinetik yang menggambarkan luas dan intensitas distribusi obat dalam tubuh. Volume distribusi bukan merupakan volume yang sesungguhnya dari ruang yang ditempati obat didalam tubuh tetapi hanyalah volume semu. Besar volume distribusi dapat digunakan sebagai gambaran tingkat distribusi obat didalam darah dan cairan tubuh lainnya. Besarnya volume distribusi tergantung pada beberapa faktor. Antara lain : 1. Kecepatan aliran darah dalam jaringan. 2. Kelarutan obat dalam lipid. 3. Koefisien partisi obat dan perbedaan jenis jaringan. 4. pH lingkungan serta afinitas obat oleh material biologis. Untuk menetapkan volume distribusi (Vd) ddengan cara Intra Vaskuler dapat dilakukan dengan setelah obat mencapai kesetimbangan, dengan membagi dosis yang diberikan secara intra vaskuler (Db0) dengan kadar obat didalam plasma pada waktu t = 0 (Cp0). Vd = Volume distribusi dapat juga diperoleh dengan membagi jumlah obat yang berada didalam plasma (Cp). Db dapat diperoleh dari pengurangan jumlah obat yang diberikan secara intravaskuler dengan jumlah obat yang dieksresi pada waktu t. Dengan syarat bahwa obat tersebut hanya dieksresi melalui ginjal atau eksresi yang melalui cara lain dapat diabaikan, atau cara penetapan kadarnya untuk kadar total. Volume distribusi pada pemberian bukan secara intravaskuler dengan mengalikan dosis dengan fraksi obat terabsorpsi. . Vd = BAHAN DAN ALAT YANG DIGUNAKAN 1. Larutan Na sulfadiazin 5% 2. Asam trikloro asetat 15% 3. Amonium sulfamat 0,5% 4. Larutan NaNO2 0,1% 5. HCl 4N 6. N-(1-naftil)-etilen diamonium klorida 0,1% dalam alkohol. 7. Antikoangulan K Oksalat 2% (dosis 20 mg/10 mL darah). 8. Spektrofotometer (Spectroni-20). HEWAN UJI YANG DIGUNAKAN Kelinci jantan, dewasa yang sehat dengan BB sekitar 1 kg.

LABORATORIUM BIOFARMASI

CARA KERJA 1. Timbang hewan yang telah dipuasakan, kemudian tentukan dosis yang akan diberikan. Ambil 0,5 mL sampel darah sebagai blanko. 2. Berikan injeksi secara IV pada Vena marginalis dengan jarum suntik yang halus. 3. Ambil sampel darah hewan coba pada vena tersebut setelah 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 dan 240 menit. 4. Campurkan dengan 0,5 mL dari sampel darah tersebut dengan 15,5 mL air, tambahkan 4 mL larutan asam trikloro asetat 15%, campur hingga homogen kemudian saring atau sentrifuge. 5. Kedalam 10 mL filtrat/supernatan bebas protein tambahkan 0,5 mL HCl 4 N. Panaskan diatas penangas air selama 1 jam. Kemudian dinginkan dan tambahkan lagi air hingga volume cukup 10 mL. 6. Ambil 5 mL cairan jernih, tambahkan 0,5 mL larutan NaNO2 0,1%, campur dengan baik, kemudian tambahkan 0,5 mL larutan amonium sulfamat 0,5%. 7. Tambahkan 2,5 mL larutan N-(1-naftil)-etilen diamonium klorida 0,1% dalam alkohol, campur dengan baik. Diamkan ditempat gelap selama 10 menit. Ukur absorbans pada panjang gelombang 540 nm, bandingkan dengan blanko.

DATA YANG DIPEROLEH

No.

BB (Kg)

Dosis obat (mg)

15

30

Absorbans pada menit 45 60 90 120 150 180 240

LABORATORIUM BIOFARMASI

PERCOBAAN III PENGARUH FAKTOR FORMULASI TERHADAP BIOAVAIBILITAS SEDIAAN ORAL TUJUAN Mengamati pengaruh formulasi sediaan terhadap ketersediaan hayati berdasarkan waktu onset of action (mulai kerja) dan durasi (lama kerja) obat yang diberikan secara oral. PENDAHULUAN Pemberian obat secara oral dapat dilakukan dengan mudah, praktis dan ekonomis. Obat tersebut akan masuk keperedaran darah setelah mengalami absorpsi dalam saluran cerna. Dari proses tersebut dapat diperoleh efek sistematis. Proses absorpsinya sangat menentukan, karena berkaitan langsung dengan intensitas farmakologi yaitu onset of action (mula kerja) dan durasi (lama kerja) obat. Namun demikian kecepatan absorpsi dapat dipengaruhi oleh berbagai faktor, diantaranya adalah kekentalan (viskositas) sediaan. Berbagai bahan dapat digunakan sebagai bahan pengental dalam formulasi sediaan obat untuk berbagai tujuan diantaranya adalah untuk menjaga kestabilan dan mengatur sifat alir sediaan dari dalam wadahnya. Konsentrasi obat pada saat terjadinya aksi awal disebut konsentrasi efektif minimal (Minimum Effective Consentration : MEC). Konsentrasi ini mencapai maksimum (Cpmax) pada tmax mereda dengan menurunnya konsentrasi pada titik tangkap maupun didalam darah.
Kadar Oabt di Dalam Darah (Cp) Intensitas KEM (Kadar Efektif Minimum) Durasi

KTM (Kadar Toksik Minimum)

Grafik Hubungan Mulai Kerja (Onset). Durasi dan Intensitas Kerja Obat. BAHAN DAN ALAT YANG DIGUNAKAN 1. Natrium fenobarbital (30 mg/kg BB) sebagai larutan 5% yang didispersikan masingmasing dalam : - Larutan Farmagel A 1% - Larutan Tragakan 1% - Larutan CMC 1% 2. Timbangan 3. Pencatat waktu 4. Spoit ujung tumpul (spoit oral) HEWAN UJI Mencit jantan (Mus muscullus).

LABORATORIUM BIOFARMASI

CARA KERJA 1. Hewan uji dibagi dalam tiga kelompok (sediaan diberikan secara oral) : - Kelompok I diberi sediaan dalam larutan Farmagel A. - Kelompok II diberi sediaan dalam larutan tragakan - Kelompok III diberi sediaan dalam larutan CMC 2. Timbang berat masing-masing hewan. Hitung volume pemberian sesuai dengan dosis dan berat badan. 3. Catat waktu saat mulai timbulnya efek. 4. Catat waktu saat hilangnya refleks balik badan (RBB) atau righting reflex (bila mencit ditelentangkan tidak bisa kembali ke posisi normal dalam waktu 30 detik). 5. Setelah refleks tersebut hilang, catat waktu saat refleks tersebut diperoleh kembali (durasi). 6. Hasil pengamatan dari tiap kelompok dikumpulkan dan dibuatkan tabel. Kemudian disusun rancangan percobaannya dan dilanjutkan uji statistik terhadap data yang diperoleh. 7. Simpulkan bagaimana pengaruh bahan pengental terhadap bioavaibilitas sediaan yang diberikan secara oral.

DATA YANG DIPEROLEH Waktu untuk onset dan durasi LRR Onset

Klp/No.

Ataxia Onset

LRR Durasi

I/1 I/2 I/3 Rata-rata II/1 II/2 II/3 Rata-rata III/1 III/2 III/3 Rata-rata Keterangan : - Kelompok I diberi sediaan dalam larutan Farmagel A. - Kelompok II diberi sediaan dalam larutan tragakan - Kelompok III diberi sediaan dalam larutan CMC

LABORATORIUM BIOFARMASI

PERCOBAAN IV PENGARUH UNTUK KIMIAWI OBAT TERHADAP BIOAVAIBILITAS TUJUAN Membandingkan AUC, tinggi puncak (Ctp) dan waktu mencapai puncak (tp) suatu obat dalam bentuk kimia yang berbeda yang diberikan secara oral. PENDAHULUAN Sebelum diabsorpsi dari saluran gastrointestinal. Kecepatan disolusi merupakan faktor yang penting. Kecepatan disolusi ini ditentukan oleh tetapan kecepatan disolusi (Kd). Faktor yang dapat mempengaruhi harga Kd ini antara lain bentuk kimia dari obatnya, misalnya dalam bentuk asam, basa, ester (garam) dan lain-lain. Pada umumnya obat berupa asam lemah atau basa lemah. Disamping itu dapat pula dalam bentuk garam atau esternya. Kelarutan dalam bentuk garam pada umumnya lebih besar daripada bentuk asam atau basanya. Karena absorpsi tergantung pada kecepatan disolusinya, maka bentuk kimia obat mempunyai kecepatan disolusi yang lebih besar dalam cairan gastrointestinal dapat memperbesar atau meningkatkan absorpsinya. Dengan menghitung AUC, Ctp dan tp maka akan dapat diketahui bioavaibilitas suatu obat. Dalam percobaan ini dengan diketahuinya AUC, Ctp dan tp dapatlah diketahui obat yang mana (dengan bentuk kimia yang berbeda) yang mempunyai kecepatan absorpsi paling besar. Perhitungan Ctp dan tp dilakukan dengan cara pembuatan grafik logaritmik kadar obat dalam darah (Cp) vs waktu (t) seperti berikut :
Cp

Ctp
C4 C3 C2 I C1 C5 C6 II

C7 tp

1. Dengan menggunakan nilai logaritmik dari C1, C2, C3 dan C4 untuk t1, t2, t3, dan t4, maka dapat dibuat persamaan garis I. 2. Demikian pula dengan menggunakan nilai logaritmik dari C5, C6, dan C7 untuk t5, t6, dan t7 dapat dibuat persamaan garis II. 3. Perpotongan antara garis I dan II merupakan puncak dari grafik tersebut. Dengan demikian dapat diketahui Ctp dan tp. Untuk penetapan AUC dapat dilakukan dengan metode trapezoid maupun metode penimbangan (Lihat percobaan I). BAHAN DAN ALAT YANG DIGUNAKAN 1. Larutan antikoangulan : Kalium oksalat 2% dalam air, dosis 20 mg/10 mL darah. 2. Pengendap protein dan pewarna (lihat percobaan I). 3. Spektrofotometer. 4. Sentrifuge.

LABORATORIUM BIOFARMASI

HEWAN UJI Kelinci jantan sehat dengan berat sekita 1 kg. CARA KERJA 1. Pada percobaan peserta dibagi dalam 3 kelompok masing-masing dengan seekor hewan coba yang dipuasakan sebelumnya (Obat diberikan peroral) : I : Diberi Na Salisilat dengan dosis 250 mg/kgBB II : Diberi asam salisilat dengan dosis 250 mg/kgBB III : Diberi asetosal dengan dosis 250 mg/kgBB 2. Timbang berat badan masing-masing hewan uji lalu tentukan jumlah dosis yang diberikan. Sebelumnya, ambil sampel darah sebanyak 0,5 mL untuk blanko (t=0). 3. Selanjutnya tentukan masing-masing kadar salisilat didalam darah pada 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150, 180, 210 dan 250 menit setelah pemberian. (Lihat cara analisis kadar salisilat didalam sampel darah). 4. Buat grafik kadar obat didalam plasma (Cp) vs waktu. 5. Dengan menggunakan kedua persamaan garis tersebut tentukan harga C-diff untuk masing-masing waktu sampling. Buat persamaan grafiknya. 6. Dengan menggunakan kedua persamaan garis tersebut tentukan harga C-diff untuk masing-masing waktu sampling. Buat persamaan garisnya. 7. Dengan melihat grafik kadar obat dalam darah (Cp) vs waktu (t) maka dapat ditentukan tinggi puncak (Ctp) dan waktu untuk mencapai puncak (tp). 8. Baut pada kertas grafik numerik grafik hubungan antara kadar obat dalam darah (mcg/mL) dengan waktu, tentukan AUC masing-masing bentuk kimia obat (bandingkan antara satu obat dengan lainnya). CARA ANALISIS KADAR NA SALISILAT DI DALAM SAMPEL DARAH Kedalam tabung sentrifuge yang berisi 5,0 mL reagens pengendap protein dan pewarna dimasukkan 0,5 mL darah yang sudah diberi 0,1 mL antikoagulan. Campur baikbaik dan sentrifuge (pusingkan) campuran tersebut selama 5 menit. Ambil supernata dan baca absorbansnya pada panjang gelombang 540 nm, bandingkan dengan blanko. DATA YANG DIPEROLEH BB (kg) Obat yang diberikan Natrium salisil Asam salisil Asam asetat salisil Dosis obat (mg) Absorbans pada menit 45 60 90 120 150 180 240

15

30

LABORATORIUM BIOFARMASI

PERCOBAAN V PENGARUH CARA PEMBERIAN OBAT TERHADAP BIOAVAIBILITAS SECARA IN-VIVO TUJUAN Membandingkan luas daerah dibawah kurva dan konstanta absorbs obat (natrium sulfadiazine) pada berbagai cara pemberian. PENDAHULUAN Untuk tujuan pengobatan suatu penyakit telah dikenal beberapa cara pemberian suatu obat, antara lain : peroral, intravena, intramuscular, intra peritoneal, perrektal, topika, dan lain-lain. Kecuali pemberian secara topical, semua cara pemberian yang telah disebut diatas biasanya dimaksudkan untuk pengobatan secara sistemik yang harus mengalami proses absorbsi kecuali cara pemberian intravena. Efek biologis suatu obat biasanya dikaitkan pada reseptor. Konsentrasi obat yang berada dalam reseptor selalu dalam kesetimbangan dengan konsentrasi obat dalam darah. Untuk mengetahui kemanfaatan hayati suatu obat yang efek farmakologisnya dapat diukur dan mudah diamati, tidak perlu diadakan pemeriksaan kadar obat dalam darah. Misalnya sedative dan hipnotika, diuretika, anti hipertensi dan lain-lain. Pada obat-obat dimana efek farmakologisnya tidak dapat diukur, perlu ditetapkan kadar obat dalam darah untuk menentukan kemanfaatan hayatinya. Parameter yang digunakan untuk melihat kemanfaatan hayati suatu obat adalah : 1. Luas daerah dibawah kurva (AUC = Area Under the Curve). 2. Besarnya konsentrasi maksimum obat dalam darah (intensitas). 3. Waktu untuk mencapai konsentrasi maksimum tersebut. Ketiga parameter tersebut menggambarkan jumlah obat yang berada dalam darah serta kecepatan obat yang berada dalam darah/sirkulasi sistemik dimana sangat dipengaruhi oleh keceptan absorbsinya. BAHAN DAN ALAT YANG DIGUNAKAN 1. Injeksi natrium sulfadiazine 5% 2. Tablet sulfadiazine 3. Kalsium oksalat 2% 4. Asam trikloroasetat 15% 5. Asam klorida 4 N 6. Natrium nitrit 0,1% 7. Ammonium sulfamat 0,5% 8. Larutan N-(1-naftil) etilen diamonium klorida 0,1% dalam alcohol. 9. Spuit injeksi 10. Sentrifuge 11. Spektrofotometer HEWAN UJI Kelinci dengan BB 1 kg

LABORATORIUM BIOFARMASI

10

CARA KERJA 1. Siapkan dan timbang berat badan beberapa ekor kelinci dengan berat yang hamper sama 1 kg. Setiap kelinci diperlakukan sama sebelum dan sesudah percobaan. 2. Hewan tersebut dibagi dalam beberapa kelompok, masing-masing kelompok untuk satu satu macam cara pemberian. 3. Cara-cara pemberian obat yang dicobakan adalah : - Intra vena - Per oral - Intra muscular - Itra peritoneal - Sub kutan 4. Dosis yang diberikan sama untuk setiap cara pemberian yaitu 150 mg/kg berat badan. 5. Kadar sulfadiazine dalam darah ditetapkan pada 10 : 20 : 30 : 45 : 60 : 90 : 120 : 150 : 180 : dan 240 menit setelah pemberian obat. 6. Hitung AUC dan konstanta kecepatan absorbsinya (Ka) untuk masing-masing cara pemberian. ANALISA KIMIA DARI SULFADIAZINE Digunakan cara Bratton Marshall 1. Sebanyak 0,5 mL darah dotambah 15,5 mL air. Campur dengan baik. 2. Tambahkan 4 mL larutan asam trikloro asetat 15%. Campur dengan baik-baik dan pusingkan lalu disaring. 3. Kedalam 10 mL beningan/filtrate yang bebas protein tambahkan 0,5 mL HCl 4 N, panaskan diatas penangas air selama 1 jam. Kemudian dinginkan. 4. Ambil 5 mL cairan yang jernih, tambahkan 0,5 mL larutan NaNO2 0,1% campur baikbaik. Tambahkan 0,5 mL larutan ammonium sulfamat 0,5%. 5. Tambahkan 2,5 mL larutan N-(1-naftil)-etilen diamonium klorida 0,1% dalam alcohol. Campur baik-baik dan diamkan 10 menit ditempat gelap. 6. Warna yang terjadi diukur resapannya pada panjang gelombang 540 nm. Percobaan ini dibandingkan terhadap blanko darah yang diperlakukan secara sama. DARA HASIL PERCOBAAN I. Data Darah.
No (Kode) hewan BB Dosis obat (mg) Cara pemberian Absorbans pada menit 10 20 30 45 60 90 120 150 180

II. Kelompok : ..
No (Kode) hewan Cara Pemberian : . Berat badan Dosis AUC AUC ratarata Ka Ka ratarata

LABORATORIUM BIOFARMASI

11

PERCOBAAN VI STUDI INDUKSI DAN INHIBISI BIOTRANSFORMASI OBAT SECARA IN-VIVO TUJUAN Mempengaruhi pengaruh pemberian suatu obat terhadap biotransformasi obat lain secara in vivo. PENDAHULUAN Biotransformasi adalah peristiwa perubahan kimiawi obat dalam tubuh. Hasil biotransformasi atau metabolit pada umumnya bersifat kurang larut dalam lipid, tidak aktif, mudah terionisasi pada pH fisiologis, kurang mampu menembus membran sel, sehingga obat akan lebih mudah dieksresi karena reabsorbsi obat secara difusi pada tubulus renalis berkurang. Jadi denga biotransformasi aktivutas obat akan berkurang atau hilang. Walaupun demikian, hasil biotransformasi ada kalanya bersifat aktif. Untuk metabolit yang demikian, berkurang atau hilangnya aktivitas obat berlangsung dengan proses biotransformasi lebih lanjut atau dengan eksresi metabolit aktif tersebut kedalam urine. Sebagian besar obat mengalami biotransformasi oleh sistem enzim makrosomal hepar, dimana proses biotransoformasi ini dapat diinduksi ataupun dihambat oleh obat alin diberikan sebelumnya. Pada tahun 1966 Jackson dan Shuster melaporkan bahwa biotransformasi obat dalam hepar dapat diinduksi atau dipercepat oleh senyawa pemacu enzim, akibatnya kecepatan sintesa naik dan kecepatan degradasi enzim berkurang didalam makrosomal hepar. Pada dasarnya senyawa pemacu enzim ini dibagi dalam tiga golongan yaitu : 1. Golongan steroid anabolik 2. Golongan hidrokarbon polisiklik 3. Golongan fenobarbital. Sebaliknya biotransformasi obat secara oksidasi didalam hepar dapat dihambat oleh karbon monooksida dan oleh senyawa hepatotoksik. Salah satu contoh senyawa hepatotoksik adalah karbon tetraklorida. Senyawa ini bersifat hepatotoksik karena dapat merusak sistem enzim di dalam retikulum endoplasmik yang bertanggung jawab atas biotransformasi obat. Pada dasarnya ada tiga parameter yang dapat dipakai untuk mempelajari aktivitas enzim makrosomal hepar yang bertanggung jawab atas biotransformasi obat ini, yaitu pengukuran terhadap durasi dari aksi suatu metabolit. Sebagai model pengukuran durasi dari aksi suatu obat biasanya dipakai : a. Pengukuran waktu tidur heksobarbital atau tiopental Yang dimaksud waktu tidur heksobarbital disini adalah waktu yang dihitung mulai dari hilangnya refleks balik badan setelah pemberian heksobarbital atau tiopental. Lamanya waktu tidur ini dapat menggambarkan kecepatan biotransformasi suatu obat. Sedangkan yang dimaksud dengan refleks balik badan (righting refleks) adalah kemampuan hewan untuk membalik badannya kekeadaan semula setelah pemberian heksobarbital atau tiopental kemudian ditelentangkan diatas papan atau kaca, dalam waktu 30 detik tetap terlentang. Sedangkan kriteria kembalinya refleks balik badan adalah bila sekonyong-konyong hewan tersebut dapat membalikkan badannya sendiri dari posisi terlentang. b. Pengukuran waktu paralisis zoksasolamina Seperti halnya pada waktu tidur heksobarbital, lamanya waktu paralisis zoksasolamina oleh enzim makrosomal hepar. Model ini dipakai jika pemberian suaru obat tidak mempengaruhi waktu tidur heksobarbital. Misalnya pemberian DDT tidak mempengaruhi

LABORATORIUM BIOFARMASI

12

waktu tidur heksobarbital tetapi memperpendek waktu paralisis zaksolamina. Waktu paralisis disini juga terhitung dari hilangnya refleks balik badan. c. Pengukuran waktu paruh biologi obat dan kecepatan eksresi metabolit Sebagai model pengukuran waktu paruh biologi obat dan kecepatan eksresi metabolit dapat dipakai penetapan waktu paruh biologi aminoprotein dalam darah dan penetapan eksresi 4-amino antipirin dalam urin setelah pemberian dipiron. BAHAN DAN ALAT YANG DIGUNAKAN 1. Timbangan 2. Spoit injeksi 3. Spoit oral 4. Larutan Natrium fenobarbital 5% 5. Larutan natrium tiopental 5% 6. Karbon tetraklorida 7. Pencatat waktu/stop watch 8. Larutan garam fisiologis HEWAN UJI - Mencit jantan dengan berat 20 g, dewasa dan satu keturunan atau, - Tikus putih jantan, dengan berat 100 200 g, dewasa dan satu keturunan. CARA KERJA Pada percobaan ini dipakai model pengukuran waktu tidur tiopental sebagai parameter aktivitas enzim makrosomal hepar. 1. Kelas dibagi menjadi 3 kelompok, masing-masing mendapat 3 ekor hewan percobaan. - Kelompok I mengerjakan percobaan kontrol (pengukuran waktu tidur tiopental) pada hewan, dengan praperlakuan dengan larutan garam fisiologis). - Kelompok II mengerjakan percobaan pemacu biotransformasi obat (pengukuran waktu tidur tiopental setelah perlakuan dengan fenobarbital). - Kelompok III mengerjakan percobaan penghambat biotransformasi obat (pengukuran waktu tidur tiopental setelah praperlakuan dengan karbon tetraklorida). 2. Timbang masing-masing hewan dan beri tanda atau kode. 3. Kelompok I Hewan diberi praperlakuan dengan garam fisiologis 0,2 mL secara intraperitoneal, diamkan selama 30 menit. Selanjutnya beri perlakuan dengan Na Tiopental 40 mg/kgBB juga secara Intra peritoneal. Catat onset dan durasi waktu tidur tiopental. Kelompok II Hewan diperlakukan seperti pada kelompok I. Bedanya adalah pada tahap praperlakuan hewan tidak diberi larutan garam fisiologis, tetapi diberi larutan Na Fenobarbital dengan dosis 75 mg/kgBB per hari. Kelompok III Hewan juga diperlakukan seperti pada kelompok I, tetapi pada tahap praperlakuan hewan diberi karbon tetraklorida 5,6 mL/kgBB secara oral 24 jam sebelum perlakuan dengan tiopental.

LABORATORIUM BIOFARMASI

13

DATA YANG DIPEROLEH Waktu hilang RBB Onset waktu tidur (mnt) Waktu mulai kembali (RBB) Durasi waktu tidur (mnt)

Kelompok/ Praperlakuan I/ Garan fisiologis (kontrol) Rata-rata II/ Natrium fenobarbital Rata-rata III/ Karbon tetraklorida Rata-rata

No/Kode hewan I/1 I/2 I/3 II/1 II/2 II/3 III/1 III/2 III/3

Waktu pemberian tiopental

LABORATORIUM BIOFARMASI

14

PERCOBAAN VII UJI TOKSISITAS AKUT A. PENGERTIAN Ketoksikan akut adalah derajat efek toksik suatu senyawa yang terjadi secara singkat (24 jam) setelah pemberian dalam dosis tunggal. Jadi yang dimaksud dengan uji toksisitas akut adalah uji yang dilakukan untuk mengukur derajat efek suatu senyawa yang diberikan pada hewan coba tertentu dan pengamatannya dilakukan pada 24 jam pertama setelah perlakuan dan dilakukan dalam satu kesempatan saja. Data kuantitatif uji toksisitas akut dapat diperoleh melalui 2 (dua) cara, yaitu dosis letal tengah (LD50) dan dosis toksik tengah (TD50). Namun yang paling sering digunakan adalah dengan metode LD50. B. TUJUAN Tujuan dilakukannya uji toksisitas akut adalah untuk menentukan potensi ketoksikan akut dari suatu senyawa dan untuk menentukan gejala yang timbul pada hewan coba. Data yang dikumpulkan pada uji toksisitas akut ini adalah data kuantitatif yang berupa kisaran letal atau toksik dan data kualitatif berupa gejala klinis. C. PERLAKUAN HEWAN COBA Hewan coba dikarantina terlebih dahulu selama 7-14 hari. Pengkarantinaan ini bertujuan untuk menghilangkan stres akibat transportasi. Serta untuk mengkondisikan hewan dengan suasana laboratorium. Pada waktu pengkarantinaan, temperatur dan kelembaban harus diperhatikan. Temperatur yang cocok untuk karantina adalah tempertaur kamar serta kelembaban yang sesuai antara 40-60%. Pemberian senyawa pada hewan coba (mencit) memiliki dosis maksimum yaitu 5000mg/KgBB dan juga mempunyai batas maksimum volume cairan yang boleh diberikan pada hewan uji. Dosis yang diberikan dapat diperhitungkan dengan beberapa cara, yaitu : 1. Berdasarkan ED50 senyawa uji hasil uji farmakologi dengan hewan uji dengan jalur pemberian yang sama. 2. Berdasarkan harga LD50 senyawa uji pada hewan uji yang sama (5-10% intravena). 3. Berdasarkan kelipatan dosis yang disarankan untuk digunakan pada manusia. 4. Berdasarkan tabel konversi perhitungan dosis antar jenis hewan, berdasarkan nisbah (ratio luas permukaan tubuh badan mereka). D. CARA PEMBERIAN SENYAWA Lazimnya senyawa diberikan pada hewan coba adalah dengan cara per-oral, namun cara yang paling tepat adalah dengan mempertimbangkan kemungkinan cara pemberian senyawa tersebut seperti manusia. Kebanyakan orang lebih memilih memakai obat dari kulit atau melalui inhalasi karena kemudahannya. Tetapi uji toksistas melalui cara tersebut sulit dilakukan karena : 1. Uji toksisitas akut melalui inhalasi membutuhkan alat khusus, agar perhitungan induksi sesuai standar, sehingga butuh biaya lebih banyak serta menggunakan metode yang lebih rumit. 2. Uji toksisitas akut melalui kulit membutuhkan biaya yang lebih besar dibandingkan dengan pemberian per-oral. 3. Sedikit sekali hewan yang memiliki struktur kulit yang sama dengan manusia, karena manusia mempunyai epidermis (stratumcorneum) yang lebih tebal dari

LABORATORIUM BIOFARMASI

15

hewan coba umumnya. Hewan yang mempunyai tingkat kesamaan paling tinggi struktur kulit dengan manusia adalah babi. E. PENGAMATAN Pengamatan dilakukan 24 jam pertama sejak diberikan perlakuan, dan 7 14 hari pada kasus tertentu. Sebaiknya mengamati hewan coba sebelum diberi perlakuan. Hal ini bertujuan untuk mengetahui perubahan gejala yang terjadi setelah diberi perlakuan dengan membandingkan gejala atau perilaku sebelum perlakuan. Kriteria pengamatan meliputi : 1. Pengamatan terhadap gejala-gejala klinis. 2. Perubahan berat badan. 3. Jumlah hewan yang mati pada masing-masing kelompok uji. 4. Histopatologi organ. F. ANALISA DAN EVALUASI HASIL Data gejala-gejala klinis yang didapat dari fungsi vital, dapat dipakai sebagai pengevaluasi mekanisme penyebab kematian secara kualitatif. Data hasil pemeriksaan histopatologi digunakan untuk mengevaluasi spektrum efek toksik. Data jumlah hewan yang mati digunakan untuk menentukan nilai LD50. Jika pada batas dosis maksimum tercapai, namun belum diketahui LD50-nya, maka hasil yang didapat tertulis LD50 lebih dari 5000mg/KgBB. Jika pada batas volume maksimum yang boleh diberikan pada hewan uji, namun belum menimbulkan kematian, maka dosis tertinggi tersebut dinyatakan sebagai LD50 semu (LD0). G. LETHAL DOSE 50 Lethal Dose 50 adalah suatu besaran yang diturukan secara statistik, guna menyatakan dosis tungga sesuatu senyawa yang diperkirakan dapat mematikan atau menimbulkan efek toksik yang berarti pada 50% hewan coba setelah perlakuan. LD50 merupakan tolak ukur kuantitatif yang sering digunakan untuk menyatakan kisaran dosis letal. Pada umumnya, semakin kecil nilai LD50, semakin toksik senyawa tersebut. Demikian juga sebaliknya, semakin besar nilai LD50, semakin rendah toksisitasnya. Potensi ketoksikan akut senyawa pada hewan coba dibagi menjadi beberapa kelas adalah sebagai berikut : No. 1 2 3 4 5 6 Kelas Luar biasa toksik Sangat toksik Cukup toksik Sedikit toksik Praktis tidak toksik Relaif kurang berbahaya LD50 (mg/KgBB) 1 atau kurang 1 50 50 500 500 5000 5000 15000 Lebih dari 15000

Beberapa hal yang dapat mempengaruhi nilai LD50 antara lain spesis, strain, jenis kelamin, umur, berat badan, kesehatan nutrisi dan isi perut hewan coba. Teknis pemberian juga mempengaruhi hasil yaitu, meliputi waktu pemberian, suhu lingkungan, kelembaban dan sirkulasi udara. Selain itu, kesalahan manusia juga dapat mempengaruhi hasil ini. Oleh karena itu, sebelum melakukan penelitian kita harus memperhatikan faktor-faktor yang mempengaruhi hasil itu.

LABORATORIUM BIOFARMASI

16

H. BEBERAPA METODE PENENTUAN LETAL DOSIS Banyak metode yang digunakan dalam perhitungan LD50. Setiap metode yang digunakan memiliki kelebihan dan kekurangan. Beberapa metode yang digunakan dalam perhitungan nilai LD50 menggunakan cara grafik atau aljabar. a. Metode Trevan Metode trevan mulai digunakan pada tahun 1972 (Anonimous 2006). Metode ini merupakan cara yang sederhana, tetapi memerlukan jumlah hewan yang besar untuk memperoleh hasil yang lebih teliti. Beberapa tingkat dosis harus ditentukan terlebih dahulu. Pengamatan dilakukan 24 jam setelah perlakuan dan ditentukan persen kematian dihubungkam sehingga didapatkan grafik yang berbentuk sigmoid. Nilai LD50 didapatkan dengan cara menarik garis dari angka 50% pada sumbu Y dan diplotkan pada sumbu X. titik potong pada absis merupakan LD50 yang ditentukan. b. Metode Perhitungan dengan Cara Grafik Miller dan Tainter Metode perhitungan Millerdan Tainter mulai digunakan pada tahun 1944. Metode Miller dan Tainter merupakan metoda yang paling umum dipakai dalam perhitungan efektif dosis (Anonimous 2006). Perhitungan LD50berdasarkan metode ini memerlukan kertas probit logaritma. Skala yang digunakan adalah skala logaritma dan skala probit. Skala logaritma digunakan pada absis sebelah kanan sedangkan skala probit digunakan pada ordinat sebelah kiri. Skala dibuat dalam skala persen yang setara dengan skala probit atau nilai persen dapat dilihat di dalam tabel probit. c. Metode Aritmatik Reed dan Muench Metode ini menggunakan nilai-nilai kumulatif. Asumsi yang dipakai bahwa kematian seekor hewan akibat dosis tertentuakan mengalami kematian juga oleh dosisyang lebih besar dan hewan bertahan hidup pada dosis tertentu juga akan tetap bertahan hidup pada dosis yang lebih rendah. Kematian kumulatif diperoleh dengan menambahkan secara suksesif ke bawah dan hidup kumulatif diperoleh dengan menambahkan secara suksesif ke atas. Persen hidup dari dosis-dosis yang berdekatan dengan LD50dihitung. Penetuan LD50didapatkan berdasarkan persamaan berikut : . = 50% % 50% % 50% 50%

Sehingga nilai LD50 didapatkan, Log 10 LD50 = -7 + (P.Dx 10) Dimana :

P.D = Jarak proporsional P = Proporsi peningkatan dosis d. Metode Karber Metode Karber mulai digunakan pada tahun 1931 (Anonimous 2006). Perhitungan nilai LD50 berdasarkan metode Karber menggunakan rata-rata dari jumlah kematian hewan pada tiap kelompok dan perbedaan antar dosis untuk interval yang sama. Hasil-hasil dari dosis yang lebih besar dari dosis yang menyebabkan kematian seluruh hewan dalam sekelompok dosis dan dosis yang lebih rendah yang dapat ditolerir oleh seluruh hewan dalam suatu kelompok, tidak digunakan. Jumlah perkalian diperoleh dari hasil kali beda dosis dengan rata-rata kematian pada interval yang sama. Nilai LD50, didapatkan dari dosis terkecil yang menyebabkan kematian seluruh hewan dalam satu kelompok, dikurangi dengan jumlah perkalian dibagi jumlah hewan dalam tiap kelompok. Apabila dijabarkan dalam bentuk rumus adalah seperti berikut.

LABORATORIUM BIOFARMASI

17

Rumus : LD50 = a (b/c) Dimana : a = Dosis terkecil yang menyebabkan kematian tertinggi dalam satu kelompok dosis. b = Jumlah perkalian antara beda dosis dengan rata-rata kematian pada interval sama. c = Jumlah hewan dalam satu kelompok. e. Metode Thomson dan Weil Metode Thomson dan Weil mulai digunakan pada tahun 1952. Metode Thomson dan Weil memiliki kelebihan dari pada metode-metode sebelumnya. Metode Thomson dan Weil mempunyai tingkat kepercayaan yang cukup tinggi (Anonimous 2006). Metode ini merupakan metode yang sering digunakan karena tidak memerlukan hewan percobaan yang cukup banyak. Perhitungan LD50 tidak menggunakan kertas probit logaritma. Uji heterogenitas data tidak dilakukan dalam metode Thomson dan Weil (Anonimous 2006). Metode ini menggunakan daftar perhitungan LD50 sehingga hasil lebih akurat. Bentuk rumus dari metode Thomson dan Weil adalah sebagai berikut : Log LD50 = Log D + d (f + 1) Keterangan. D = dosis terkecil yang digunakan D = logaritma kelipatan F = suatu faktor pada daftar perhitungan LD50 Weil (1952), dimana r adalah jumlah kematian hewan dalam satu kelompok uji n adalah jumlah hewan percobaan per kelompok k adalah jumlah hewan percobaan -1 Kisaran nilai LD50 dihitung dengan rumus Log kisaran = Log LD50 2 d f Dimana f = suatu nilai pada tabel yang tergantung pada nilai n dan k f. Metode Perhitungan Secara Grafik Litchfield dan Wilcoxon Metode Litchfield dan Wilcoxon mulai digunakan pada tahun 1949. Metode ini merupakan salah satu metode yang sering dipakai dalam penetuan efektif dosis (Anonimous 2006). Metode ini terdiri dari tingkat data dan range data dosis yang digunakan. Tingkat data akan dibandingkan dengan suatu nilai untuk melihat diterima atau tidaknya hipotesis yang digunakan (EPA 2002). Metode ini menggunakan banyak tabel dan beberapa monogram. Heterogenitas data ditentukan dengan uji chi kuadrat.

LABORATORIUM BIOFARMASI

18

BAHAN DAN METODE PENELITIAN A. Bahan dan Alat 1. Bahan - Obat Paracetamol - NaCMC - Bahan pakan mencit - Mencit jantan 6 Ekor, umur 2 bulan dan kisaran BB 18 30 g 2. Alat - Neraca - Penyaring - Kandang peliharaan - Bak penampung - Sonde lambung B. Rancangan Pengamatan 1. Uji pendahuluan Pengujian pendahuluan menggunakan mencit sebanyak 2 ekor mencit jantan. Suspensi Paracetamol diberikan sebanyak...... g/KgBB secara oral menggunakan sonde lambung. Hewan diamati selama 24 jam. Bila selama 24 jam tidak ada hewan yang mati maka dilakukan pengujian toksisitas akut LD50. 2. Pengujian LD50 dengan Metode Thomson dan Weil Sebanyak 6 ekor mencit dibagi menjadi 3 kelompok perlakuan yang digunakan dalam pengujian ini. Mencit tersebut diadaptasikan terlebih dahulu selama satu minggu. Pakan dan minum diberikan ad libitum. Semua mencit yang digunakan dalam penelitian dipuasakan selama 24 jam sebelum diberikan perlakuan. Setiap hari dilakukan dua kali pengamatan terhadap jumlah kematian mencit untuk perhitungan nilai LD50. Pengamatan terhadap mencit dilakukan selama 48 jam. Selanjutnya perlakuan-perlakuan tersebut dapat disajikan sebagai berikut. Kelompok I : Mencit percobaan diberikan secara oral suspensi Paracetamol dengan dosis .......... mg/KgBB. Kelompok II : Mencit percobaan diberikan secara oral suspensi Paracetamol dengan dosis .......... mg/KgBB. Kelompok III : Mencit percobaan diberikan secara oral suspensi Paracetamol dengan dosis .......... mg/KgBB. C. Parameter yang Diamati Parameter yang diamati dalam perlakuan ini adalah nilai LD50 suspensi Paracetamol dan Kisaran LD50. D. Analisa Data Perhitungan nilai LD50 menggunakan metode Thomson dan Weil (1952). Tabel perhitungan Thomson dan Weil digunakan untuk menentukan nilai LD50. Nilai LD50 dihitung dengan persamaan sebagai berikut : Log LD50 = Log D + f (f + 1)

LABORATORIUM BIOFARMASI

19

DAFTAR PUSTAKA 1. Bocher. F., Cruthers, G. J., and Steiner, J., Handbook of Clinical Pharmacology, 1st edition, Little Brown and Company. 1978. P. 22 25.

2. Curry, S. H., Drug Disposition and Pharmacokoneticks. 2nd ed., Balckwell Scientific Publication, Oxford. 1977. P. 1971, P. 8 17. 3. Gibaldi, M., Introduction to Biopharmaceutics. Lea and Febriger. Philadelphia, 1971. P. 15 27. 4. ------------- Biopharmaceutics and Clinical Pharmacokinetics, 2nd, ed., Lea and Febiger, Philadelphia, 1977. P. 15 27. 5. Hepler, O. E. Manual of Clinical Laboratory Methods. 4th edition, Charles C. Thomas Publisher, Springfield, USA, 1960. P. 322 325. 6. Krisharwarny, K., Drug Metabolisme in Adults, National Institute of Nutrition, Indian Council of Medical Research, Hyderbad, p. 500 507. 7. Ritscel, W. A., Handbook of Basic Pharmacokinetics. 1st edition, Drug Intelegence Publications, Inc, Hamilton, 1976., P. 281 304. 8. Ritscel, W. A., Laboratory Manual of Biopharmaceutics Pharmacokinetics, Drug Intelegence Publication. Inc. 1974, P. 43 53. and

LABORATORIUM BIOFARMASI

20

PENUNTUN PRAKTIKUM

BIOFARMASETIKA DAN FARMAKOKINETIKA

DISUSUN OLEH : TEAM TEACHING

LABORATORIUM BIOFARMASI JURUSAN FARMASI FIKK UNIVERSITAS NEGERI GORONTALO 2012

LABORATORIUM BIOFARMASI