Dot Blot inversa

Dot Blot

Dot Blot assay

Metodologa de anlisis del DNA en la cual la muestra est marcada y se somete a hibridacin con una sonda directamente aplicada sobre una membrana.

Es una tcnica sencilla para identificar una protena conocida en una muestra biolgica. La facilidad y simplicidad de la tcnica permite una transferencia de puntos herramienta de diagnstico ideal.

DOT BLOT EN LA IDENTIFICACIN DE LA PROTENA DE INTERS

En un Dot Blot de las biomolculas para ser detectados no se separan en primer lugar por cromatografa.

Una mezcla que contiene la molcula a detectar se aplica directamente sobre una membrana en forma de punto. Se detecta a travs de plantillas circulares directamente en la membrana o substrato de papel.

DOT BLOT INVERSA

Procedimiento consiste en tres pasos: 1. Extraccin de ADN (reactivos no incluidos en el kit); 2. Amplificacin PCR (reactivos s incluidos en el kit): los fragmentos deseados del gen son amplificados simultneamente por la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Durante esta PCR, una etiqueta (biotina) se aade a los fragmentos del ADN amplificado. 3. Hibridacin/deteccin (reactivos s incluidos en el kit): Las membranas llevan sondas de DNA unidas covalentemente que reconocen especficamente fragmentos de cada secuencia gnica, amplificados durante la PCR. Hay una sonda ms para el control del proceso de revelado y como ayuda para la interpretacin de resultados. Emplean marcadores enzimticos y sustratos colorimtricos que requieren un

DOT BLOT ASSAY

Para detectar el anticuerpo directamente sobre la membrana (Fluoruro de polivinilideno) PVDF. El manchado membrana se trata despus con el anticuerpo primario especfico seguido de lavado para eliminar el anticuerpo no unido y unido inespecficamente.

Ventajas
Ahorro en tiempo (4 a 6 horas)
Confirmar la presencia o ausencia de una biomolcula o biomolculas que pueden ser detectados por el ADN sondas o el anticuerpo.
EXPERIMENTAL DE ALTO RENDIMIENTO, ya que estos sistemas permiten un anlisis comparativo de los resultados inmediatos.

Desventajas
No proporciona informacin sobre el tamao de la diana biomolecula.

Si dos molculas de diferentes tamaos se detectan, todava aparecer como un solo punto.

RENDIMIENTO tcnica sustancial con cualquier tipo de membrana comercial

QU DETECTA LA PRUEBA Y PARA QUE?

Detecta infecciones por Chlamydia trachomatis y otras enfermedades de transmisin sexual.

Se utiliza para detectar antidiacyltrehalose anticuerpos en pacientes con tuberculosis y fiebre tifoidea.
Este examen sirve para aumentar el numero de vidas salvadas que se ven afectadas con estas enfermedades.