UNIVERSIDADE DE CUIAB UNIC MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Contagem Padro em Placa de Bactrias Aerbias e Anaerbias Facultativas Mesfilas

O QUE ? A contagem padro em placa (pour plate) estima o numero de bactrias viveis por grama ou mililitro de amostra. Este mtodo pode ser aplicado para a contagem de microorganismos psicrotrfilos, mesfilos ou termfilos, segundo a temperatura de incubao selecionada. Nessa tcnica, uma quantidade conhecida de inculo colocada numa placa de Petri, seguindo-se a adio de gar Padro para Contagens fundido, que misturado com o inculo atravs de movimentos rotatrios. A solidificao do meio fixa os microrganismos no gel. Admite-se que cada microrganismo vivel cresce e multiplica-se, dando origem a uma massa visvel - uma colnia - ou seja, cada organismo d origem a uma colnia. Dessa forma, atravs do nmero de colnias formadas pode-se saber o nmero de microrganismos viveis no inculo. A amostra original diluda vrias vezes para que o nmero de colnias presentes na placa fique compreendido entre 30 e 300. Dentro desse limites a contagem pode ser precisa e a possibilidade de interferncia do crescimento de um microrganismo com o de outro mnima. As colnias so contadas contra um fundo escuro ou sobre uma tela iluminada com uma grande lente de aumento, num aparelho chamado contador de colnias. A tcnica de contagem em placas baseada no princpio de que cada organismo vivel formar uma colnia e, alm disso, admite-se que a suspenso microbiana seja homognea e que no existam agregados de clulas. Obviamente, os nicos microrganismos que podero ser contados sero aqueles que puderem crescer no meio utilizado e sob as condies de incubao adotadas (tempo, temperatura, etc.). Esse fato pode ser muito importante no caso da contagem de uma mistura de microrganismos. Se as clulas tiverem tendncia de formar agregados, como cocos em cachos, estafilococos, ou em cadeias, estreptococos, ou leveduras formando pseudo-miclios, as contagens resultantes sero mais baixas que o nmero de clulas individuais, pois cada um dos agregados produzir apenas uma colnia. Por essa razo, as contagens so expressas como Unidades Formadoras de Colnias (U.F.C.) por unidade de volume ou massa dependendo da natureza da amostra de alimento (lquido ou slido) e no como nmero de microrganismos; por exemplo, para uma amostra de carne moda: 1,2x10 3 UFC.g-1, ou ento, para uma amostra de leite: 3,1x104 UFC.mL-1. A tcnica de contagem em placas apresenta como vantagens o fato de ser de fcil realizao; alm disso, mede populaes de qualquer grandeza em virtude das vrias diluies realizadas e apresenta sensibilidade para a deteco de populaes muito pequenas. Essa tcnica utilizada rotineiramente na contagem de microrganismos presentes na gua, leite e alimentos em geral.

MTODO PARA CONTAGEM PADRO EM PLACAS

1 - MATERIAL: - Estufa bacteriolgica regulada a 37C; - Placas de Petri estreis; - Pipetas bacteriolgicas - gar padro para contagem estril; - Tubos contendo 9 mL de soluo salina peptonada.

- Ala de Drigalski - Pipeta automtica. 2 - PROCEDIMENTO: Preparar a amostra medindo ou pesando 10 ml ou 10 gramas da mostra em 90 ml de salina peptonada e homogenizar. Diluio 1: 10. - Preparar as diluies necessrias, 10-2 e 10-3 , a partir da diluio 10-1, da amostra preparada anteriormente, transferindo 1 ml da diluio inicial para tubos com 9 ml de soluo salina peptonada e homogeneizar; - Distribuir 100 microlitros de cada diluio no centro de placas de Petri estreis e distribuir a amostra de forma homognea com a ala de Drigalski - Incubar a 37C por 48 horas. 3 - OBTENO DOS RESULTADOS: - Sero consideradas significativas as contagens das diluies que apresentarem entre 30 e 300 unidades formadoras de colnias; - Para calcular o nmero de UFC por grama do produto, multiplicar o nmero significativo encontrado pelo fator de diluio correspondente. Observaes: 1. Leituras abaixo de 30 colnias na menor diluio (10-1), expressar como abaixo de 300 UFC/grama. 2. Ausncia de crescimento em 10-1, expressar como abaixo de 10 UFC/grama. 3. Leituras acima de 300 colnias na maior diluio expressar como maior que 300 x 103 UFC/grama. 4. Leituras entre 30 e 300 colnias, expressar o resultado multiplicando-se o valor encontrado, pelo fator de diluio correspondente. 4 - EXEMPLO DE EXPRESSO DO RESULTADO: 250 unidades formadoras de colnias na diluio 1: 1000 Contagem Padro em Placa: 2,5 x 104 UFC/g. 5 - OBSERVAES: Recomenda-se, na realizao do teste, o uso de placas em duplicata; O procedimento para a pesquisa de psicrotrfilos e termfilos o mesmo utilizado para os mesfilos, variando o tempo, a temperatura de incubao: a) Psicrotrfilos.................. 7 C por 10 dias.

b) Termfilos...................... 55 C por 48 horas. 6 ENTENDENDO O SIGNIFICADO DA CONTAGEM EM PLACA DE BACTRIAS AERBIAS E ANAERBIAS FACULTATIVAS MESFILAS A maioria dos alimentos industrializados (exceto, por exemplo, alimentos fermentados) devem ser considerados inadequados para ao consumo quando contm um grande nmero de microrganismos, mesmo quando estes no sejam conhecidos como patgenos e no haja alterao de forma aprecivel nos caracteres organolpticos do alimento, segundo a Comisso Internacional de Padres Microbiolgicos para Alimentos (I.C.M.S.F.). Esta afirmao prende-se aos seguintes fatos: 1. Contagens altas em alimentos estveis, em geral, indicam matrias-primas contaminadas ou tratamentos no satisfatrios do ponto de vista sanitrio. Nos produtos perecveis podem indicar tambm condies inadequadas de tempo e/ou temperatura durante seu armazenamento. A presena de um nmero elevado de bactrias aerbias mesfilas que crescem bem temperatura corporal ou prximo a ela, significa que podem ter existido condies favorveis multiplicao de microrganismos patgenos de origem humana ou animal. 2. Algumas cepas de bactrias mesfilas comuns, no geralmente consideradas como agentes transmissores de enfermidades por alimentos, por exemplo, Proteus spp, Streptococcus spp e Pseudomonas mesfilas, j foram incriminadas como causa de enfermidades quando existia um nmero elevado de clulas viveis no alimento. 3. Todas as bactrias patognicas conhecidas, veiculadas por alimentos, so mesfilas e em alguns casos contribuem com sua presena para as contagens em placas encontradas. 4. A causa mais freqente de alterao nos alimentos devida ao desenvolvimento de microrganismos, podendo-se esperar, nos mesmos contagens elevadas. Os nveis de populao necessrios para produzir modificaes organolpticas ostensivas variam amplamente segundo o tipo de alimento e, de modo particular, a classe dos microrganismos. No momento em que a decomposio pode ser detectada pelo odor, gosto ou aspecto, a maioria dos alimentos contm mais de 106 microrganismos por grama. EXERCCIOS PARA AVALIAO DA AULA PRTICA 1. Faa um esquema de como deve ser organizado o material para a realizao de uma Contagem Padro em Placas num alimento. (desenho) 2. Na colheita da amostra, se ao invs de pegar 10 mL de leite e dispens-lo num frasco com 90 mL de diluente, poderamos colher apenas 1,0 mL de leite (com uma pipeta de 1 mL) e dispens-lo num tubo de ensaio contendo 9,0 mL de diluente? Explique. 3. Na etapa de semeadura, o que aconteceria se, por engano, voc pipetasse apenas 0,5 ml da diluio na placa de Petri e se desse conta disso somente aps ter feito a incorporao do meio? Repetir o exerccio admitindo que voc colocou 2,0 ml de inculo na placa. 4. Por que se pode semear com apenas uma pipeta se for obedecida a ordem de se ir das suspenses mais diludas para as mais concentradas?

5. Por que o meio, durante a homogeneizao, no pode molhar a tampa da placa? 6. Por que as placas devem ser colocadas invertidas na estufa (de novo)? 7. Calcule quanto de diluente ser utilizado para se fazer a diluio 1/10 nos seguintes casos: a) 5g de canela em p. b) 25 g de carne moda c) 100 gramas de pimento do reino moda d) 1 kg de frango desossado. e) 1 litro de leite f) 500g de pescado salgado. g) 1 po de queijo. DATA DE ENTREGA: PRXIMA AULA REFERNCIAS BRASIL. MINISTRIO DA SADE. ANVISA. Resoluo RDC n 12 de 2 de janeiro de 2001. Regulamento Tcnico sobre Padres Microbiolgicos para Alimentos. Braslia, 2001. FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. So Paulo: Atheneu, 2008. 182 p. JAY, J. M. Microbiologia de alimentos. Porto Alegre: Artmed, 2005. 711 p. SILVA, N. et al. Manual de Mtodos de Anlise Microbiolgica de Alimentos. So Paulo: Varela, 2007.317 p