You are on page 1of 5

A N K A R A N V E R S T E S TIP F A K L T E S M E C M U A S I

Cilt 53, S a y l ,

2000

11-15

MDE KARSNOMLARINDA HCRE PROLFERASYON BELRLEYCS OLARAK PCNA, Ki-67 VE AgNOR KULLANIMI
Mustafa Cihat Avunduk akir Tavl Serdar Yol Lema Tavl Aye Yavuz*

Salim Gngr* Osman Ylmaz*


ZET Seluk niversitesi Tp Fakltesi Patoloji Anabilim Oal'nda Mide adeokarsinomu tans alan 30 olgu tespit edildi. Bu olgularn tmrl ve normal mukoza alanlarn ayn preparat zerinde ieren bloklar seildi. Bu bloklardan hazrlanan kesitlere immnhistokimyasal olarak PCNA ve Ki-67 boyamas ile NOR cisimlerini boyamak iin gm impregnasyonu uyguland. Mitoz says ve mitotik indeksi belirlemek iin ise Hematoksilen Eozin ile boyal tan koyduran preparatlar kullanld. Tm deerlendirmeler mmkn olduunca ayn alanlar taranarak yapld. Olgularn elde edilen sonular birbirleri ile karlatrldnda mide adenokarsinomlarnda, hcresel proliferasyon belirleyicisi olan AgNOR, PCNA ve Ki-67 nin birbirleri ile istatistiksel olarak uyumluluk ierisinde olduklar belirlendi. SUMMARY Usirg of PCNA, Ki-67 and AgNOR as a markers of celi proliferation in adenocarcinomas of stomach. W e studies 30 consecutive cases with the diagnosis of adenocarcinomas of stomach in histopatologically. The paraffin blocks were investigated ifthey contained both the normal mucosa and tumour areas in the same preparation. We used PCNA and Ki-67 stains as immunohistochemical staining methods and silver impregnation technique was utilized for staining of NOR bodies. The number of mitosis and mitotic index were established in the Heamatoksilen Eosin stained preparations. Searching thoroughly the same areas of differet slides performed ali evaluations. When the results were compared with each other, we showed that AgNOR, PCNA and Ki-67 staining methods, which were markers of cellular proliferation in stomach carcinoma, were statistically correlated to each other. Key words: PCNA, Ki-67, AgNOR, Cellular tion markers, adenocarcinoma, stomach. prolifera-

Anahtar kelimeler: PCNA, Ki-67, AgNOR, proliferasyon belirleyicileri, adenokarsinoma,

Hcresel mide

Patolojide immiinhistokimyann rutin kullanm sonucunda, tansal zelliklerin bildirilmesi yan sra, tmrn prognostik zellikten hakknda da sz syleyebilmek bir ihtiya haline gelmitir. Prognostik zelliklerin belirlenebilmesi ile hastaya yaklam etkileyecek bilgiler elde edilerek, tedavinin planlanmasnda daha geni bir perspektife sahip olmak amalanmaktadr. Bu nedenle de hcresel proliferasyon belirleyicilerinin kullanm gndeme gelmitir. Son zamanlarda kliniko-patolojik zelliklerle tmr proliferasyonu arasndaki ilikiyi belirlemek iin immnohistokimyasal olarak prolifere hcre nkleus antijeni (PCNA) ve Ki-67 kullanm (1) ile baka bir hcresel proliferasyon belirleyicisi olan gm impregnasyonu ile ncleolar organizer region saym (AgNOR yntemi) (2) kullanlr hale gelmitir.
* Seluk niversitesi Tp Fakltesi Patoloji Anabilim Dal "

Biz bu almamzda immnhistokimyasal hcresel proliferasyon belirleyicileri Ki-67 ve PCNA ile birlikte baka bir proliferasyon belirleyicisi olan AgNOR yntemini mide adenokarsinomlar zerinde uygulayp karlatrmak istedik. GERE VE YNTEM Bu almada Seluk niversitesi Tp Fakltesi Genel Cerrahi Anabilim Dal'nda pere edilen, ayn niversitenin Patoloji Anabilim Dal'nda mide adenokarsinomu tans alm 30 olgu incelendi. almaya; Hematoksilen Eozin (HE) ile boyanm , nceden tans konmu preparatlar gzden geirilerek baland. Ayn preparatlar ierisinde tmr dokusu ile birlikte normal mukoza alanlarnn da yer ald bloklar belirlendi. Belirlenen bloklardan hazrlanan kesitlere immnhistokimyasal olarak PCNA, Ki-67 boyamas ile NOR ci-

Seluk niversitesi Tp Fakltesi Genel Cerrahi Anabilim Dal Kabul tarihi: 1 Haziran 1999

Geli tarihi: 21 Eyll 1998

12

MDE KARSNOMLARINDA HCRE PROLFERASYON BELRLEYC OLARAK PCNA, K-67 VE AgNOR KULLANIMI

simcikleri iin gm impregnasyonu (AgNOR) uyguland. immnhistokimyasal boyamada Streptavidin-Botin Peroksidaz yntemi uyguland. PCNA boyamas iin Clone PC10, Dako belirleyicisi; K-67 iin de Dako tercih edildi. PCNA iin pozitif kontrol olarak youn lenfoid doku ieren tonsil preparatlar, Ki-67 iin bazal tabakasnda nkleer pozitiflik gsteren epitel dokusu kullanld. Negatif kontrol olarak her iki immn boyama iin ayn preparatlar primer negatif kontrol ajan damlatlarak hazrland. Preparatlarn hazrlanmasnda DAB kromojen kullanld. Hematoksilen Eozin ve dier yntemlerle boyanan preparatlar deerlendirilirken preparat zerindeki ayn alanlar seilerek, mmkn olduunca ideale yakn deerlendirme yaplmas amaland. Mitoz says ve mitotik indeks HE ile boyal kesitlerde saptand. Mitoz saysn belirlerken her olgu iin 10 adet byk biytmelik alandaki mitoz says ortalamalar esas alnrken, mitotik indeks bin tmr hcresi ierisindeki mitoz says olarak belirlendi. Ortalama mitoz says ve ortalama mitotik indeks, tm olgularn mitoz says ve mitotik indekslerin toplamnn allan olgu says olan 30 a blnmesi ile elde edildi. Olgularmzn AgNOR profillerini belirlerken 100 tmr hcresi ierisindeki NOR benekleri saylarak, nkleus bana den ortalama NOR deerleri AgNOR indeksi olarak verildi. NOR beneklerini sayma ilemi 1000 bytmede ve immersiyon ya kullanarak gerekletirildi (ekil 1). Ayrca normal ve tLimral alanlardaki hcrelerin AgNOR indeksleri toplanp olgu says olan 30 a blnerek; normal ve tmral alanlarn ortalama AgNOR indeksleri elde edildi.

PCNA ve Ki-67 indeksi ise 1000 tmral hcre ierisindeki pozitif nkleer boyanma gsteren hcrelerin saysnn 1000 e blm ile elde edildi, immnhistokimyasal incelemede ayrca grade'leme sistemi de uyguland. Tmral hcrelerin %0-25 i pozitif boyanmsa Grade I, %26-50 si pozitif boyanmsa Grade II, %51 -75 i pozitif boyanmsa Grade III ve %76-100 ii pozitif boyanmsa Grade IV olarak kabul edildi. Tm olgularn PCNA ve Ki-67 indeksleri ayr ayr toplanp olgu says olan 30 a blnerek ortalama PCNA ve Ki67 indeksleri belirlendi. Elde edilen sonular Spearman sra korelasyonu ve Pearson korelasyonu ile istatistiksel olarak karlatrld. AgNOR indeksi, Ki-67 indeksi ve PCNA indeksi aralarnda karlatrlrken Pearson korelasyonu kullanld. Mitoz says, mitotik indeks, PCNA grade'i ve Ki67 grade'i Spearman sra korelasyonu ile istatistiksel olarak deerlendirildi. BULGULAR Tm olgularda bir byk biytmelik alandaki ortalama mitoz says 5.66, ortalama mitotik indeks ise 12.66 olarak saptand. Tmr bulundurmayan normal alanlarda mitoz says yok denecek kadar azd. Olgularn mitoz saylar ile mitotik indeksleri arasnda istatistiksel olarak anlaml bir ilikinin varl belirlendi (rs=0.75, p<0.1). Ortalama AgNOR indeksi tmral alanlarda 7.26 olarak saptanrken, bu deer tiimr bulundurmayan alanlarda 2.60 olarak tespit edildi. Tm olgularda tmral alanlarn immnhistokimyasal olarak PCNA ve Ki-67 ile pozitif boyand grld (ekil 2, 3). Tmral alanlarda ortalama PCNA indeksi 0.687, ortalama Ki-67 indeksi ise 0.358 olarak saptand. Tmre komu salam mukoza alanlarnda immnhistokimyasal boyama sonucu sadece 3 olguda PCNA ve Ki-67 pozitiflii saptanrken dier olgularda herhangi bir pozitif boyanma grlmedi. Bu 3 olguda ise normal mukoza hcrelerinin %5-15 orannda pozitif boyand belirlendi. Olgularn PCNA indeksi ve Ki-67 indeksi karlatrldnda olduka yksek oranda bir uyumluluun varl (r=0.94, p<0.01) grld. Ki-67 indeksi ile AgNOR indeksi uyumluluunun (r=0.85, p<0.05) PCNA indeksi ile AgNOR indeksi uyumluluundan (r=0.76, p<0.1) daha kuvvetli olduu belirlendi. 30 olgunun mitoz saylar, mitotik indeksleri, AgNOR indeksleri, Ki-67 indeksleri, Ki-67 grade'leri, PCNA indeksleri ve PCNA grade'leri arasndaki istatistiksel ilikiyi Tablo 1 de topluca grmekteyiz.

ekil 1. Mide adenokarsinomu olgusunda gtie affinite gsteren N O R cisimcikleri intrankleer olarak immersiyon altnda grlmekte (AgNOR; x 1000)

Mustafa Cihat Avunduk, akir Tavl, Serdar Yol, Lema Tavl, Aye Yavuz, Salim Gngr, Osman Ylmaz

13

ekil 2. immiinhistokimyasal olarak P C N A ile pozitif ekspresyon gsteren tmral hcreler grlmekte (PCNA; x40)

ekil 3. K-67 ile pozitif nkleer boyanma gsteren tmral hcreler grlmekte (Ki-67; x40)

Tablo 1. ndeksler ve gradeler aras istatistiksel iliki Mitotik indeks AgNOR ndeksi Ki-67 ndeksi Ki-67 Grade'i PCNA indeksi PCNA Grade'i

rs=0.75

rs=0.17

rs=0.35

rs=-0.06

rs=0.26

r=0.85 ( A )

rs=0.00

rs=0.06

rs=0.77 (-)

rs=0.86 (+)

rs=-0.05

rs=0.26

r=0.76 (-)

r=0.94 (*)

rs=0.68 (+)

rs=0.17 Mitoz says

rs=0.49 Mitotik indeks

rs=0.93(*) A g N O R indeksi

rs=0.93(*) Ki-67 indeksi

rs=0.78(-) Ki-67 grade'i

rs=0.93 P C N A indeksi

P<0.01 (*) 0.01 <p<0.05 ( A ) 0.05<p<0.1 (-) 0.1 <p<0.5 (+) TARTIMA Tmr dokusunda hcresel proliferasyon dzeyini belirlemek iin eitli yntemler kullanlmaktadr. Bu yntemlerin en kolay mitoz says ve mitotik indeksi belirlemektir. Ancak mitoz saysnn proliferatif aktiviteyi saptamada kullanlmas hala tartlmaldr (3). Kesit kalnlna dorudan bal olmas, tespitin uzun zaman almas, deiik alanlardaki saysal farkllklar, ki-

isel zellikler tartmann balca etkenleri olmaktadr. Ayrca deiik mikroskopla farkl saylara ulalmas da sk karlalan bir sonutur. Bu nedenlerle mitotik indeksin daha salkl olaca dnlmektedir. 30 olgumuzun mitotik indeksi ve mitoz saylarn karlatrdmzda anlaml bir ilikinin varln saptadk (rs=0.75, p<0.1). Mitotik indeks ve mitoz says arasnda istatistiksel olarak anlaml ilikinin bulunmasnda ayn alanlarn ayn kalnlkta kesilmesinin ve ayn patolog tarafndan deerlendirilmesinin etkili olduunu dndk. Ncleolar organizer region'un (NOR) belirlenmesi bir baka hcre proliferasyon gstergesidir. NOR ci-

14

MDE KARSNOMLARINDA HCRE PROLFERASYON BELRLEYC OLARAK PCNA, K-67 VE AgNOR KULLANIMI

simcikleri bnyesinde ribozomal genleri ve baz asidofilik proteinleri bulunduran, gme kar afinitesi olan bir yapya sahiptir (2). R-RNA'y kodlayan DNA paralardr. Gm impregnasyon metodu ile gsterilebilir ve AgNOR olarak adlandrlr. AgNOR saymnn gerekte neyi lt tam olarak bilinmemektedir. Ancak AgNOR saymnn rRNA protein sentezinin bir gstergesi olmas nedeniyle proliferasyon hz ile ilikili olduu ne srlmektedir. Benign-ve malign ayrmnda anlaml olmakla birlikte, snr lezyonlarda faydal olamamaktadr. Bizim almamzda tmral ve tmr bulundurmayan alanlardaki ortalama AgNOR indeksleri arasnda nemli bir farkn varln saptadk. Normal alanlardaki AgNOR indeksinin displazik alanlarda ortalama AgNOR indeksinden biraz daha yksek oluu dikkatimizi ekti. Ancak tmral alanlarda elde edilen deerlerle farkll kadar arpc deildi. Bu bulgudan; literatrde sz edildii gibi; AgNOR indeksi ile benign ve displazik alanlarn ayrmnn yaplmasnn olduka g olduunu grmekteyiz (4). 30 olguluk alma grubumuzda AgNOR indeksi ile mitotik indeks ve mitoz says karlatrldnda, mitotik indeksle AgNOR indeksi arasnda (rs=0.35), mitoz saysna (rs=0.17) nazaran daha kuvvetli bir iliki olmasna karn, istatistiksel olarak anlaml bir iliki gremedik. Hcre proliferasyonu ayn zamanda immnhistokimyasal tetkiklerle de gsterilebilir. B yntemlerle hcre bymesi ve blnmesi ile ilikili nkleer antijenler boyanarak mikroskop altnda deerlendirilir (5). Son zamanlarda ska kullanlmaya balanan hcre siklusu proteinlerinden PCNA ve Ki-67 benign ve malign dokulardaki hcre kinetiini kantitatif olarak gstermekte olduka yardmc olmaktadr. Yani hcre reme aktivitelerinden hcre siklus hzn, proliferatif hcre miktar artn, S faznda kalan hcre miktarn gstermektedir. Bylelikle konvansiyonel, duraan histopatolojik grnm yerine hastaya yaklam kolaylatran ve tedaviyi planlarken gz nnde tutulacak fonksiyonel grnm belirleyen bir yntem olarak kullanlmaktadr (6). Ayrca tedavi esnasnda tmrn cevap verip vermediini kontrol etme imkan da sunmaktadr (7). Ki-67 G-0 ve G-1 fazlar haricinde hcre siklusun tm fazlarnda salnan, nkleer antijene kar gelitirilmi fare monoklonal antikorudur. PCNA ise 36kD arlnda hcre siklusu ile ilgili nkleer bir proteindir. Hcre siklusunun ge G-1 ve S faznda hcre nkleusunda bulunur (1). Tmr hcrelerinde PCNA ile boyanmann Ki-67 ye gre daha fazla oranda olduu

bildirilmektedir (1, 8). Bizim almamzda da literatr ile uyumlu olarak ayn alandaki tmral hcrelerin ortalama PCNA indeksini (0.687), ortalama Ki-67 indeksinden (0.358) daha yksek bulduk. Bu farkl boyanma oranlan muhtemelen PCNA ve Ki-67 nin siklusun deiik safhalarndaki nkleuslar boyama zelliklerinden ileri gelmektedir. Bunu destekleyen bir bulgu da Ki-67 nin spermatogonialar, PCNA'nn ise primer spermatositlerin nkleuslarn boyadklarnn gsterilmi olmasdr (9). Ortalama indekslerin farkl olmasna karn30 vakadaki PCNA ve Ki-67 indeksleri karlatrldnda olduka yksek bir oranda istatistiksel uyumun (r=0.98, p<0.01) varln belirledik. Demek ki mide adenokarsinomlarnda hcre proliferasyon belirleyicisi olarak PCNA ve Ki-67 ayn derecede uyumluluk gstermektedir. Ortalama PCNA ve ortalama Ki-67 indeksinden daha yksek PCNA ve Ki-67 indeksi gsteren 12 olgumuzda midede izlenen tmrn tm duvar boyunca mideyi tuttuu ve evre ya dokusuna infiltrasyon gsterdii, ayrca bu 12 olgunun 9 unda ayklanan lenf nodlarnn yarsndan fazlasnda tmral infiltrasyonun mevcut olduu tespit edildi. Bu olgulardaki AgNOR indeksleri de ortalama AgNOR indeksinden fazla idi. Bylelikle hcresel proliferasyon un yksek olduu vakalarda histolojik grade'lerin de yksek olduunu literatrle uyumlu olarak gzlemi olduk (10). Malignitede artan hcre proliferasyon aktivitesinin, ayn zamanda malign olgularda gzlenen llerde olmasa bile displazi durumlarnda ve kuvvetli enfeksiyon hallerinde de artt bildirilmektedir (8, 11, 12). Bizim 3 olgumuzda tmral alan haricinde %5-15 orannda PCNA ve Ki-67 ile tespit ettiimiz pozitif boyanma alanlarnn orta ve ar derecede displazi bulundurduklarn gzledik. Ancak malign ve benign tmrler arasnda ayrmda kullanlabilecek PCNA ve Ki-67 boyamalarnn benign ve borderline lezyonlar arasnda anlaml farkllklar iermediinden sz edilmektedir (13). almamzda normal mide mukoza hcrelerinde hi boyanma tespit etmemize karn, displazik alanlarda izlediimiz %5-15 orannda pozitif boyanmay dar alma grubumuz ierisinde dikkat ekici bulduk. mmnhistokimyasal boyamalarn deerlendirmesinde Grade'leme ilemi daha abuk ve kolay sonu vermektedir. Byk bytmelik alanda izlenilen boyanan hcrelerin saysna gre olgular I ile IV arasnda deien 4 grade'e ayrlyor. Yani boyanan hcrelerin hangi %25 lik gruba girdii tespit edilerek grade'lemesi yaplyor. 1 ile 25 arasnda deien, geni bir marjdaki hcresel boyamalar ayn grade ierisinde deer-

Mustafa Cihat Avunduk, akir Tavl, Serdar Yol, Lema Tavl, Aye Yavuz, Salim Gngr, Osman Ylmaz

15

lendirildiinden indekse gre daha anlaml istatistiksel ilikiler vermektedir. (Tablo 1). Ancak bu durum yanltc olduu dnlmektedir. nk indeks belirlerken daha hassas davranlmaktadr. 25 lik hcre gruplar deil her boyanan hcre indeks deerini etkilemektedir. Sonu olarak; mide karsinomlarnda AgNOR, PCNA indeksi, PCNA grade'i, Ki-67 indeksi, Ki-67

grade'i hcre proliferasyon belirleyicileri olarak birbirleri ile istatistiksel olarak anlamllk tamaktadr. Ancak mitotik indeks ve mitoz says kendi aralarnda istatistiksel olarak anlaml iliki bulundurmasna ramen, yukarda sz edilen hcresel proliferasyon belirleyicileri ile istatistiksel olarak anlaml iliki bulundurmamaktadr.

KAYNAKLAR
1. Rosa C, Mendes R, Filipe MI, Morris R W : Measurement of celi proliferation in gastiric carcinoma: comparative analysis of Ki-67 and proliferative celi nuclear antigen (PCNA). Histochemical J. 1992; 24: 93-101. Crocker J: Ncleolar organiser regions. Curr Top Pathol 1990; 82: 91-149. Linden M D , Torest FX, Kubus J, Zarbo RJ: Clinical aplication of morphologic and immunohistochemical assesments of celi proliferation. Am J Clin Pathol 1992; 97(Suppl 1): 4-13 4. Undervvood JCE, Ciri D D : Ncleolar organiser regions as diagnostic diskriminants for malignancy. J Pathol 1998; 41: 1, 62-7. Rosai J: Ackerman's Surgical Pathology. Mosby, St Louis, 1996; Eighth ed. Pp47-8. Brugal C : Quantitative microscopy and tumour celi proliferation. Bul Cancer 1995; 82: 5, 511-7. VVllet C C , Hagan M , Daley W , VVarland C et al.: Changes in tumor proliferation of rectal cancer included by preoperative 5-Fluorourasil and irradiation. Dis Colon Rectum 1998; 41: 1, 62-7. Miracco C Spina D, Vindigni C Flipe MI et al.: Celi proliferation pattern and p53 expression in gastric dysplasia. Int J Cancer 1995; 17: 62(2), 149-54. 9. Steger K, Aleithe I, Behre H, Bergmann M : The proliferation of spermatogonia in normal and pathological human seminiferius epitelium: An immunohistochemical study using monoclonal antibodies against Ki-67 protein and proliferating celi nclear antigen. Mol Hum Reprod 1998; 4:3, 227-33.

2. 3.

10. Jass JR, Ajioka Y, Rodojkovic M , Allison LJ et al.: Failure to detect colonic mucosal hyperproliferation in mutation positive members of a family vvith hereditarynon polyposis colorectal cancer. Histopathol 1997; 30: 3, 2017. 11. Kullmann F, Fadaie M , Gross V, Knuchel R et al.: Expression of proliferating celi nuclear antigen (PCNA) and Ki67 in dysplasia in inflammatory bowel disease. Eur J Castroenterol Hepatol 1996; 8: 4, 371-9. 12. Terada T, Otha T, Kitamura Y, Ashida K et al.: Celi proliferative activity in intraductal papillary mucinous neoplasms and invasive ductal adenocarcinomas of the pancreas: an immunohistochemical study. Arch Pathol Lab M e d 1998; 122(1): 42-6 13. Ma CK, Peralta M N , Amin M B , Linden M B et al.: Small intestinal stromal tumors.: a clinicopathologic study of 20 cases vvith immunohistochemical assesment of celi differentiation and the prognostic role of proliferation antigens. A m J Clin Patho 1997; 108: 6, 641-54.

5. 6. 7.

8.