FACS Brdu + PI

(ensaio com clulas knockdown)

1 dia. Plaqueamento. 1.10 clulas/poo em placas de Petri de 60mm em meio RPMI 1640 com 10% SFB. 2 dia. Carenciamento com meio RPMI 1640, sem soro. 3 dia. Tratamento com doxiciclina 2ug/mL a todas as placas. 4 dia. Incubao (T=24h) 5 dia. Incubao (T=48h) 6 dia. Incubao (T=70h) e tratamento com Brdu. No tempo T=70h, adicionar 5uL de Brdu (stock 10mM) por mL de meio de cultura em cada placa e incubar por mais 2h, finalizando as 72h de incubao.

Protocolo de coleta e fixao

Colocar as placas em gelo. Coletar sobrenadante em tubos, no gelo. Lavar 1X com PBSA gelado e transferir para os tubos. Tripsinizar clulas aderidas placa (em temperatura ambiente). Inativar a tripsina com 10% SFB gelado. Transferir as clulas para os tubos. Lavar a placa com PBSA gelado e transferir para o tubo. Centrifugar tubos a 1500rpm por 3 minutos. Descartar sobrenadante. Lavar os pellets 1X com PBSA gelado e centrifugar novamente a 1500rpm por 3 minutos. Descartar sobrenadante. Ressuspender pellets em 250uL de PBSA. Adicionar 250uL de etanol gelado e homogeneizar a soluo. Adicionar 250uL mais duas vezes sucessivas. Estocar clulas fixadas na geladeira.

Dupla marcao com BrdU e PI

1. Centrifugar as clulas a 1000rpm por 5 minutos, descartar o sobrenadante e lavar 1X com PBSA gelado. 2. Ressuspender as clulas em uma soluo HCl 2M 0,5% Tween 20 preparada na hora para desnaturar o DNA. 3. Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos sob leve agitao, protegendo as amostras da luz e tomando cuidado para no exceder o tempo. 4. Centrifugar as clulas a 1000rpm por 5 minutos, descartar o sobrenadante e ressuspend-las em uma soluo de tetraborato de sdio 0,1M pH 8,5 para neutralizao. 5. Centrifugar a 1000rpm por 5 minutos e lavar as clulas 1X com PBSA.

6. Ressuspender cada tubo em 100uL de uma soluo contendo anti-Brdu conjugado ao Alexa 488 na diluio 1:100. 7. Incubar a temperatura ambiente po 1h, protegido da luz e sob leve agitao. 8. Centrifugar as clulas a 1000rpm por 5 minutos, descartar o sobrenadante e lavar 1X com PBSA. 9. Ressuspender as clulas na soluo de marcao de DNA total contendo iodeto de prodio na diluio 1:500 (50ug/mL) com RNase A a 100ug/mL num volume mnimo de 500uL. 10. Deixar a temperatura ambiente por 20 minutos e realizar a leitura.