ESTUDIO COMPARATIVO DE 4 PROTOCOLOS PARA LA OBTENCIN DE PLASMA RICO EN PLAQUETAS (PRP)

Autores:GARCIA R. LUIS ALBERTO Odontlogo, Universidad Central de Venezuela. Caracas. Especializacin Estomatologa Integral del Adulto, Maestra en Periodoncia e Implantes Dentales, Universidad Santa Mara. Caracas. Profesor Invitado del Diplomado en Implantologa Dental, Universidad de Carabobo, Valencia, Edo. Carabobo. Docente de Periodoncia e Implantes Dentales y Coordinador del Diplomado de Periodoncia, Instituto Somos Educacin. Caracas. Conferencista Nacional e Internacional. Odontlogo Periodoncista e Implantodontlogo (ejercicio exclusivo), grupos UNDAMO y CEO, Caracas. Venezuela. RESMEN Desde la utilizacin del Plasma Rico en Plaquetas (PRP) en los procedimientos quirrgicos periodontales regenerativos, se han descrito diversos protocolos para su obtencin, siendo cada uno de estos diferentes en cuanto al tiempo y nmero de revoluciones utilizadas durante el centrifugado de la sangre tomada del paciente. Sabemos que el producto final obtenido mediante los protocolos descritos, es el denominado PRP, pero existe la interrogante de cual de ellos ofrece el plasma con mayor nmero o concentracin de plaquetas. Es conocido que a mayor cantidad de estos elementos, los resultados de la cicatrizacin o de la regeneracin del lecho quirrgico se vern incrementados y se disminuir el riesgo de complicaciones postoperatorias. El objeto de este estudio es evaluar cul de los cuatro protocolos seleccionados (Anitua y Anda, 2000; De Obarrio y col, 2000 y Camargo y Leckovics, 2002; Okuda y col (2003) y Kawase y col (2003); y Garca y col, 2005) proporciona el PRP con mayor cantidad de plaquetas, al ser sometidos a las variables de tiempo y velocidad de centrifugacin diferentes preestablecidas por cada autor. Se realiz la toma de 5 muestras de sangre de 6 pacientes y se sometieron al proceso de obtencin del PRP segn los parmetros de los 4 protocolos nombrados. Luego se procesaron para determinar la cantidad de plaquetas presentes y as conocer de cul de los cuatro protocolos estudiados se obtiene el PRP con mayor concentracin plaquetaria.

INTRODUCCIN Las plaquetas son clulas sanguneas enucleadas contenidas en el plasma sanguneo, y aunque poseen una estructura compleja, son pequeos discos redondos u ovales de 2 a 4 de dimetro cuya concentracin normal en sangre oscila entre 150.000 y 300.000 por microlitro (Guyton y Hall, 1997; Anitua y Andia, 2000; Marx y Garg, 2005). En ellas se encuentran los llamados grnulos alpha a que contienen un grupo de factores de crecimiento (FC) que, al liberarse, hacen posible la multiplicacin y el desarrollo de las clulas endoteliales vasculares, de las clulas musculares lisas y de los fibroblastos, y ejercen mltiples efectos sobre los fenmenos de remodelacin celular (Barnes y col, 1999; Anitua, 2001; Marx y Garg, 2005), permitiendo que interacten recprocamente con los leucocitos y con las clulas endoteliales para modular la reaccin inflamatoria en los procesos de

cicatrizacin y de regeneracin tisular (Klinger, 1997; Bazzoni y col, 1999). La mayora de stos FC son protenas de bajo peso molecular que varan entre 1.000 y 4.000 daltons. Cada factor posee un tejido u rgano sobre el cual actuar, aunque todos los tipos de clulas responden a uno o ms factores al mismo tiempo (Benito, 1991; Graves y Cochran, 1994; Marx y Garg, 2005). Las plaquetas tienen una semi-vida til de 8 a 12 das, al final de la cual acaba su ciclo vital y despus son eliminadas de la circulacin principalmente por el sistema de macrfagos titulares (Guyton y Hall, 2001) (ver Grfico No. 1).

Grfico No. 1: Plaquetas. Tomado de: http://health.upenn.edu/News/News_Releases/platelet.jpg El PRP es una concentracin autloga de plaquetas humanas en un volumen pequeo de plasma que representan un aumento de plaquetas sobre la lnea normal, siendo as una fuente de fcil acceso a los FC contenidos en ellas, permitiendo as acelerar y mejorar los procesos de cicatrizacin y de regeneracin tisular. Es definido como una concentracin autloga de plaquetas humanas en un volumen pequeo de plasma. Por consiguiente, el trmino PRP se refiere al gel o concentrado de plaquetas autlogas o plasma rico en FC. Al ser un agregado de plaquetas contiene los cinco FC o protenas fundamentales que son secretados al activarse las mismas cuando se inicia el proceso de cicatrizacin de las heridas (Anitua y Anda, 2000; Marx, 2004; Marx y Garg, 2005). El PRP es otra forma normal de cogulo sanguneo autlogo que contiene un nmero favorablemente elevado de plaquetas y presenta un pH entre 6,5 y 6,7. Proviene de la propia sangre del paciente, por lo cual est libre de enfermedades trasmisibles y no puede causar reacciones de hipersensibilidad. La cuenta de plaquetas requerida en un cogulo para calificar como PRP puede ser discutible, pero una concentracin de aproximadamente 1 milln de plaquetas/L, o de 4 a 7 veces sobre su cuenta bsicamente usual (200.000 plaquetas/L), ha demostrado proporcionar beneficios clnicos (Marx y col, 1998; Marx y col, 2001; Marx y Garg, 2005). Un cogulo de sangre normal contiene 93% de clulas de rojas, 6% de plaquetas y en algunos casos menos de un 1% de clulas blancas; en contraste, un cogulo de PRP contiene 94% de plaquetas, slo un 5% de clulas rojas y un 1% de clulas blancas. Esta alteracin de las proporciones celulares de las clulas que no estimulan la cicatrizacin (clulas rojas) por las que si estimulan todas las fases de la cicatrizacin (plaquetas), es lo que explica su habilidad en reforzar la regeneracin tisular. La estrategia simple y beneficiosa del PRP es aumentar las acciones de los FC en regenerar los tejidos a travs del aumento de la cantidad de plaquetas (Marx y col, 1998; Marx y col, 2001; Anitua, 2001; Anitua 2001b; Gruber y col, 2002; Marx,

2004; Marx y Garg, 2005). A finales de los aos noventa, Whitman y col (1997) introdujeron el uso del PRP en el rea de la ciruga bucal, el cual ha sido aceptado ampliamente como una nueva biotecnologa que es parte del inters creciente en la ingeniera tisular y la terapia celular actual, aunque se considera a Robert Marx como uno de los emprendedores de sta nueva biotecnologa. En el rea de la Periodontologa se ha planteado el empleo del PRP para el relleno de defectos seos producto de la enfermedad periodontal, como complemento de la Regeneracin Periodontal y sea Guiada y en la estimulacin de la regeneracin de los tejidos blandos, a travs de la promocin del crecimiento y la diferenciacin de las clulas epiteliales, clulas conectivas, clulas del ligamento periodontal y las clulas seas (Marx y col, 1982; Marx y col, 1990; Marx y col, 1998; Anitua y Andia, 2000; Marx, 2004; Marx y Garg, 2005).

OBTENCIN Y ACTIVACIN DEL PLASMA RICO EN PLAQUETAS Recientemente ha surgido una creciente demanda del PRP en el campo de la ciruga odontolgica (Marx y col, 1982; Marx y col, 1990), por lo que se han desarrollaron dispositivos pequeos y compactos que proporcionan cantidades de PRP a travs de la toma de poca sangre del paciente, los cuales tienen amplia aceptacin en sta rea. El clnico debe tener presente que cualquier dispositivo de PRP debe procesar una concentracin aproximada de 1.000.000 plaquetas /L en 5 ml de volumen de sangre; ste debe ser un proceso viable, estril y libre de pirgenos para que las plaquetas se mantengan ilesas (Anitua y Anda, 2000; Marx, 2001; Marx, 2004; Marx y Garg, 2005). La obtencin de las plaquetas y su concentracin se inician con asepsia y una tcnica con mnimo traumatismo para obtener un pequeo volumen de sangre, normalmente entre unos 10-60 ml, dependiendo de la extensin y el tipo de ciruga (Anitua y Anda, 2000; Marx, 2001; Marx y Garg, 2005). Para que sta no coagule inmediatamente, la muestra se coloca en un recipiente estril (tubo de ensayo) con 45,83,100 citrato sdico al 3,8% como anticoagulante, ya que esta solucin capta los iones calcio que se encuentran en la sangre y los neutraliza formando un compuesto qumico llamado quelato impidiendo de esta manera la coagulacin sangunea, adems, el citrato sdico no altera los receptores de membrana de las plaquetas y permitir revertir el proceso al aadir calcio en forma de cloruro de calcio. Se coloca 1ml de anticoagulante por cada 5ml de sangre y ambos se mezclan moviendo el tubo o la jeringa por inversin (Pierce y col, 1992; Anitua y Anda, 2000; Marx, 2001; Marx y Garg, 2005). La sangre autloga anticoagulada se coloca entonces en el dispositivo para su centrifugacin. Marx, en su tcnica de obtencin del PRP, emplea un dispositivo (SmartPRep) de centrifugacin doble. El primer giro llamado giro fuerte o giro de separacin, es a una velocidad de 5.600 rpm, obteniendo la separacin de las clulas rojas (glbulos rojos) del resto de los componentes de la sangre. El segundo giro llamado giro suave o giro de concentracin, es a una velocidad de 2.400 rpm, que separa y une fuertemente a las plaquetas, clulas blancas y un pequeo nmero de clulas rojas residuales del plasma. Este giro suave produce el PRP y lo separa del plasma pobre en plaquetas (PPP) ambos procedimientos se realizan en un tiempo total de 15 minutos aproximadamente (Marx y col, 1998; Anitua y Anda, 2000; Marx y Garg, 2005).

Marx y col (1998) y Marx (2000) afirman queintentar obtener PRP con un solo giro no producira un verdadero concentrado teraputico. En cambio se obtiene una mezcla de PRP y plasma pobre en plaquetas (PPP) que contiene poca cantidad de plaquetas. Esto se debe principalmente a que mediante la realizacin de un solo giro, las clulas rojas interfieren con la separacin de las plaquetas. Este es el principal error que ocurre con las centrfugas convencionales de laboratorio, ya que stas son diseadas con propsitos diagnsticos y no para el desarrollo del PRP. Dichos dispositivos no producen un rendimiento suficiente y pueden lesionar a las mismas (Marx y col, 1998; Marx, 2001; Marx y Garg, 2005). Luego del segundo giro de concentracin, la sangre es separada en sus tres componentes bsicos en funcin a su densidad del menos denso al ms denso. Plasma pobre en plaquetas (PPP) primero, plasma rico en plaquetas (PRP) de segundo y por ltimo las clulas rojas (CR) que son las ms densas. El componente del PPP es el plasma acelular, que cuenta con aproximadamente 200 cc de volumen, el componente de las clulas de sangre rojas se condensa esencialmente y cuenta con aproximadamente 180 cc de volumen. El PRP es el plasma con un nmero concentrado de plaquetas y clulas de sangre blancas (Marx, 2001) (ver Grfico No. 2).

Grfico No. 2: Separacin de la sangre en sus tres componentes bsicos en funcin de su densidad. Tomado de: http://plasmarico.com.ar/prp2.asp A diferencia de Marx y Garg (2005), Anitua y Anda (2000) y Anitua (2001) obtienen el PRP en un proceso de una sola fase, centrifugando el plasma a 1.800 rpm durante 8 minutos, separando los componentes sanguneos en varias fases. (Grfico No. 3).

Grfico No. 3: Proceso de centrifugacin del PRP. Foto del autor En el fondo del contenedor quedan igualmente las clulas rojas. La fase superior amarillenta se subdivide en tres fases: una fraccin 1 (superior) que corresponde al PPP, luego la fraccin 2 (intermedia), que representa un plasma con un nmero de plaquetas similar al que presenta la sangre perifrica, y por ltimo, la fraccin 3 (inferior) que es el PRP (Anitua y Anda, 2000; Anitua y Anda, 2001) (ver Grfico No. 4).

Grfico No. 4: Fracciones de la separacin del plasma. Tomado de: http://profesional.medicinatv.com/fmc/anitua/ Luego del proceso de centrifugacin, la fraccin del PRP es separada y tomada por medio de un pipeteado y colocada en un tubo estril, donde permanecer anticoagulado hasta que el proceso de coagulacin sea inducido. El PRP debe

permanecer estril para que las plaquetas sean viables y bioactivas durante las prximas 8 horas desde que se obtuvieron a temperatura ambiente (Anitua y Anda, 2000; Marx, 2001; Marx y Garg, 2005). Se recomienda que el PRP sigua anticoagulado hasta que se active, para poder ser colocado de esta manera en el sitio quirrgico. No se aconseja almacenar este concentrado por ms de 8 horas, ya que su viabilidad no se ha probado en horarios extendidos a este tiempo y la congelacin puede lesionar o romper las membranas de las plaquetas (Marx y Garg, 2005). Desde que se desarroll el PRP en el rea odontolgica slo se requiere una pequea cantidad de sangre y el proceso entero puede completarse en slo 15 minutos o menos. Se recomienda desechar cualquier PRP si no se usa despus de 8 horas y desarrollar un segundo proceso (Marx y Garg, 2005). La activacin del PRP requiere reemplazo del calcio y la iniciacin de la cascada de la coagulacin sangunea. Para Anitua y Anda (2000), Marx (2004) y Marx y Garg (2005), esto se logra agregando cloruro clcico. Marx emplea conjuntamente con esta solucin trombina bovina, a diferencia de Anitua y Anda (2000) que no describen su empleo, ya que existen ciertas controversias con la utilizacin de la misma porque se han detectado anticuerpos antitrombina en pacientes que han sido tratados con este producto (Anitua y Anda, 2000; Anitua, 2001; Marx, 2001; Marx y Garg, 2005). El usar una mayor cantidad de solucin activadora es contraproducente; un mayor volumen de esta solucin no acelerar el proceso de la coagulacin, ms bien, reduce su velocidad de formacin o la inhibe totalmente, ya que esto diluye la concentracin del fibringeno que es un factor importante en la formacin del cogulo (Knighton y col, 1984; Marx y Garg, 2005). OBJETIVO El objetivo del presente estudio es determinar el nmero de plaquetas contenidas en el PRP obtenido mediante cada uno de los cuatro protocolos de centrifugacin escogidos, los cuales difieren en el nmero de revoluciones y en el tiempo de centrifugado entre s (ver Tabla No.1), para conocer de sta forma cul de ellos ofrece el mayor nmero de plaquetas. 4- MATERIALES Y METODOS Un total de cinco (5) muestras de sangre fueron obtenidas de 6 pacientes sistmicamente sanos, cuatro se sometieron al centrifugado segn cada protocolo: el primero propuesto por Anitua y Anda (2000) a 1800 rpm por 8 minutos; el segundo de De Obarrio y col (2000) y Camargoy col (2002) a 5600 rpm por 6 min; el tercero de Okuda y col (2003) y Kawasey col (2003) con un centrifugado inicial de 2400 rpm durante 10 minutos, seguido de otro centrifugado del plasma aislado de 3600 rpm por 15 minutos; y el cuarto y ltimo protocolo propuesto por Garca y col (2005) con un centrifugado inicial de 1800 rpm por 8 minutos seguido por un segundo centrifugado slo del plasma obtenido a 1800 rpm por 8 minutos. La quinta muestra se dej sin centrifugar para determinar el nmero de plaquetas en condiciones normales. Se realiz el contaje por medio del sistema automatizado de la mquina Coulter para anlisis hematolgico (ver Tabla No.2). TABLA N 1: Autores de los protocolos utilizados

TABLA N2: Descripcin de la centrifugacin de los protocolos utilizados.

RESULTADOS El mayor nmero de plaquetas obtenido equivalente a un promedio de 191.31 % del contaje promedio inicial fue contado en el PRP obtenido segn el protocolo nmero 4 propuesto por Garca y col (2005), seguido por el nmero 1 de Anitua y Anda (2000) donde se obtuvo un promedio de 90,31 %, luego el nmero 3 de Okuda y col (2003) y Kawasey col (2003) con un promedio del 31.74 %, y por ltimo, el nmero 2 de la tcnica de De Obarrioy col (2000) y Camargo y col (2002) con un contaje promedio de 5.29 %. En ninguno de los protocolos se logr obtener ms del 200 % de concentrado plaquetario (ver tabla No.3).

DISCUSION Muchos estudios han evaluado diferentes dispositivos y/o protocolos para obtener PRP. Uno de stos fue el presentado por Weibrich y Kleis (2002) donde se compararon dos mtodos: el Curasan PRP Kit de Alemania y el PCCS PRP system de Estados Unidos de Norte Amrica. Se extrajo sangre de 47 donantes sistmicamente sanos, con edades comprendidas entre 20 y 59 aos y se prepar el PRP de cada uno de ellos con ambos sistemas. Los resultados difirieron significativamente, encontrndose que con el sistema PCCS PRP system la concentracin y el recuento de plaquetas fue mucho mayor (901.999 a 2.209.000) que el obtenido al emplear el sistema Curasan PRP Kit (636.000 a 1.075.000). Los resultados de ste estudios difieren significativamente de nuestros resultados, los cuales estn muy por debajo de stos nmeros. Por su parte, Appel y col (2002) compararon tres preparaciones diferentes para obtener el concentrado de plaquetas. Una de estas fue Curasan PRP Kit, el PCCS PRP system y un procedimiento rutinario empleado en laboratorios de transfusiones. Se tomaron las muestras de sangre de 12 voluntarios y se emplearon los tres sistemas, obteniendo los siguientes resultados: el incremento absoluto de plaquetas parece ser mayor con el PCCS PRP system, la ms alta concentracin por l se gan con el sistema Curasan PRP Kit y finalmente los autores reportan que el sistema de laboratorio puede ofrecer una alternativa, si el sistema intraoperatorio no est disponible, aunque con ste se obtiene una concentracin muy pobre de PRP, coincidiendo con nuestros resultados. Weibrich y col (2003) compararon el sistema Harvest Smart PReP system (Alemania) con el Friadent-Schtze platelect rich plasma kit (Austria). Se extrajo sangre de 54 donantes sanos, con edades comprendidas entre 23 y 79 aos y se obtuvo PRP de cada paciente por ambos mtodos. El dispositivo de Smart PReP fue el sistema con mejor facilidad de manejo, mejor tiempo operatorio y tuvo una mayor eficacia en la recoleccin de plaquetas que el kit de Friadent-Schtze, ya que ste slo ofrece una ligera ventaja en la concentracin de plaquetas del PRP resultante. Aunque no reportan en nmero de plaquetas obtenido, sus conclusiones se acercan ms a los resultados obtenidos segn el protocolo de Garcia y col (2005). Si los resultados obtenidos en las investigaciones son diferentes, es lgico pensar que esto puede estar influenciado por el empleo de distintos dispositivos y equipos de evaluacin, y de distintos protocolos de obtencin del PRP. Es necesario entender que el verdadero PRP es obtenido con mquinas calificadas para tal fin; dispositivos en mal estado pueden alterar las proporciones y la calidad del PRP y su

beneficio no ser el mismo si se compara con el obtenido por una centrfuga certificada (Marx y Garg, 2005). Los estudios revisados de Weibrich y Kleis (2002), Appel y col (2002), Weibrich y col (2003) y Garca y col (2005) que evalan la concentracin de las plaquetas obtenidas con distintos dispositivos y protocolos tienen una significativa importancia, puesto que plantean la diversidad de resultados que se pueden obtener de acuerdo al dispositivo empleado, lo que quiere decir que si la concentracin de plaquetas difiere de un concentrado a otro, es de esperarse que los resultados postoperatorios sean tambin diferentes. Esta es una importantsima variable que hay que tomar en consideracin cuando se comparan dos o ms estudios en los cuales se hayan empleado diferentes sistemas. Algunos pueden mostrar grandes beneficios con el PRP al emplear dispositivos que garanticen una ptima concentracin, contra los resultados pobres obtenidos en otros estudios donde se emplean equipos que no garantizan una concentracin adecuada de plaquetas (Luces y Garcia, 2006).

CONCLUSIONES El PRP es una preparacin autloga inherentemente seguro, libre de enfermedades transmisibles, lo que representa relativamente una nueva biotecnologa que es parte del inters creciente en la ingeniera tisular y la terapia celular de hoy da, el cual es obtenido mediante un procedimiento sencillo y econmico. Desde que se plante el empleo del PRP en odontologa, esta biotecnologa ha gozado de gran popularidad dentro del rea de la ciruga bucal, periodontal, y maxilofacial. Es importante analizar detalladamente la diversidad de resultados obtenidos en los estudios publicados, partiendo inicialmente por la diferencia entre los dispositivos de medicin que se emplearon para cada variable, ya que para realizar una comparacin certera y aceptable, se hace necesario que se empleen dispositivos estandarizados que les permitan la cuantificacin y evaluacin de cada componente tisular en cada fase del proceso de cicatrizacin. Indudablemente, los odontlogos involucrados con la regeneracin tisular tienen algo que esperar del PRP. Sin embargo, en esta fase temprana de estudio, todava es mucho lo que queda por investigar y descubrir, y un cuerpo adecuado debe preceder el uso extendido de este material, como ocurrira con cualquier otro agente biolgico. Un buen diseo, ensayos humanos rigurosos y estandarizados deben demostrar su beneficio. REFERENCIAS

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