Evaluacin de la calidad microbiolgica de bocaditos fritos a base de Papa (Solanum tuberosum) que se elaboran y expenden en forma artesanal en la Urb.

Ciudad del Pescador Distrito Bellavista Callao.

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

VICERRECTORADO DE INVESTIGACIN
FACULTAD DE INGENIERA PESQUERA Y DE ALIMENTOS

Evaluacin de la Calidad Microbiolgica de Bocaditos Fritos a base de Papa (Solanum tuberosum) que se elaboran y expenden en forma artesanal en la Urb. Ciudad del Pescador Distrito Bellavista Callao.
Blgo. Mblgo.: ARTURO MARIANO GARCA MERINO
.

RESOLUCIN: N1383-2010-R (10 de Diciembre del 2010 al 30 de Noviembre del 2011)

BELLAVISTA CALLAO 2012

NDICE
Pag. RESUMEN. I. INTRODUCCIN.. 1.1. Objetivos y alcance de la investigacin.................... 1.2. Importancia y Justificacin de la investigacin. II. PARTE TERICA O MARCO TERICO III. MATERIALES Y MTODOS. 3.1. Mtodo para la obtencin de papas fritas en hojuela... 3.2. Procesamiento de muestras para su anlisis Microbiolgico. IV. RESULTADOS.. V. DISCUSIN.. VI. CONCLUSIONES.. VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. VIII. APNDICE...... 08 09 10 11 12 17 17 21 56 62 64 65 66

PAPA FRITA EN SU PRESENTACION HOJUELA

I. DATOS GENERALES
1. TITULO DEL PROYECTO Evaluacin de la calidad microbiolgica de los bocaditos fritos a base de Papa (Solanum tuberosum) que se elaboran y expenden en forma artesanal en la Urb. Ciudad del Pescador Distrito Bellavista Callao. 2. FACULTAD Facultad de Ingeniera Pesquera y de Alimentos. 3. INSTITUTO DE INVESTIGACION Instituto de la Facultad de Ingeniera Pesquera y de Alimentos. 4. INVESTIGADOR RESPONSABLE O JEFE DEL PROYECTO Apellidos Nombres Categora Clase Condicin Cdigo Profesin : : : : : : : Garca Merino Arturo Mariano. Auxiliar Dedicacin Exclusiva Nombrado 1364 Bilogo - Microbilogo / Ing. Alimentario

5. PROFESORES ORDINARIOS A T.C o D.E PARTICIPANTES Ninguno. 6. PERSONAL ADMINISTRATIVO DE APOYO Ninguno. 7. DURACION DEL PROYECTO 12 meses.

RESUMEN El presente trabajo se desarrollo en el laboratorio de Microbiologa - Chucuito. Basado segn la exigencia de la Norma Sanitaria que establece los criterios

microbiolgicos de calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano (R.M. N 591 2008/MINSA) , grupo V. GRANOS DE CEREALES, LEGUMINOSAS, QUENOPDIACEAS Y DERIVADOS (harinas y otros), (V-8): Hojuelas a base de granos (gramneas, quenopodiceas y

leguminosas) que requieren coccin. Para la determinacin y/o seguimiento de los microorganismos indicadores de calidad segn dicha norma, se realizaron bajo los mtodos indicados por la ICMSF; en la evaluacin de muestras, se realizaron anlisis cuantitativos como cualitativos.

El Tipo de muestreo es aleatorio, las muestras se adquiri de los diferentes carrito expendedores que circundan en la Urb. Ciudad del Pescador Distrito Bellavista Callao.- durante 11 meses: Enero (2011) a Noviembre (2011) Las pruebas se hicieron por duplicado, se trabaj un total de 22 muestras en el laboratorio de Microbiologa de Chucuito- FIPA-UNAC.

I. INTRODUCCION
a) Descripcin y anlisis del tema La higiene de los alimentos comprende el conjunto de condiciones y medidas necesarias para garantizar la seguridad y salubridad de los productos alimentarios incluida la manipulacin por el consumidor desde el momento que adquiere el alimento en un punto de venta hasta que lo prepara y consume. La seguridad alimentaria por su parte, se logra mediante el adecuado control de la calidad de la materia prima durante su procesamiento hasta obtener un producto manufacturado ptimo, pero tambin es crucial lograr condiciones adecuadas de almacenamiento, transporte y manipulacin del producto final en los mercados donde se comercializa. La venta de alimentos en la va pblica es hoy una caracterstica importante en nuestra capital y en las ciudades ms importantes al interior del pas ya constituye un factor positivo para la economa de nuestro pas ya que moviliza una gran cantidad de recursos y genera empleo informal, al mismo tiempo que satisface la necesidad de obtencin de comidas rpidas de bajo costo, junto al lugar de trabajo, especialmente por la poblacin de ms bajos ingresos. Adems, presenta como beneficio la satisfaccin de tradiciones y hbitos de consumo de alimentos tpicos.

b) Planteamiento del problema A pesar de las ventajas conocidas del comercio informal de alimentos, durante la elaboracin pueden ocurrir posibles riesgos para la salud de la poblacin ya que, en la mayora de los casos, los alimentos son preparados por personas que carecen de adiestramiento para su adecuada manipulacin y lo hacen en condiciones precarias de higiene. Estudios realizados en nuestro medio han demostrado que la gran mayora de los vendedores de alimentos no cuentan con un sistema de agua de buena

calidad, ni el volumen adecuado para las necesidades diarias, siendo comn la reutilizacin del agua para el lavado de utensilios, las manos y las superficies de trabajo, entre otras, transformndose en una fuente abundante cantidad en microorganismos. c) Problema Qu grado del calidad microbiolgica tendrn las frituras a base de Papa (Solanum tuberosum) que se elaboran y expenden? en la Urb. Ciudad del Pescador distrito Bellavista Callao? 1.1. Objetivos y alcance de la investigacin 1.1.1. Propsito de la Investigacin. Objetivo General Evaluar a la calidad microbiolgica de las frituras a base de Papa que se elaboran en la Av. Juan Pablo II de la Urb. Ciudad del Pescador Distrito Bellavista Callao.

Objetivo Especfico Determinar la presencia microorganismos indicadores de alteracin, de higiene y patgenos en muestras de papa frita en hojuela. 1.1.2. Alcances de la Investigacin Tipo de Investigacin Investigacin experimental (aplicada). Sector que s e ver beneficiado de los resultados de la investigacin. Se beneficiaran de los resultados de la investigacin. El Ministerio de Salud.
La Municipalidad de Bellavista Callao. El pblico consumidor. Los docentes de la especialidad y areas afines. Alumnos de la escuela Profesional de Ingeniera de Alimentos.

Los

Sectores

Industriales

(Industria

de

alimentos

industrias

Pesqueras). Las personas que realizan actividades afines. 1.2. IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIN DE LA INVESTIGACIN. 1.2.1. IMPORTANCIA El aporte de la presente investigacin, radica en demostrar mediante mtodos estandarizados, la presencia de microorganismos muchos de ellos patgenos, los cuales al ser ingeridos junto con el alimento preparado estos pueden desencadenar graves alteraciones en la salud del consumidor. Adems esta investigacin nos servir para demostrar la calidad microbiolgica de estos alimentos, por el solo hecho de presentarse coliformes o mohos ya nos indicando la falta de higiene y salubridad que ha tenido el alimento durante su elaboracin y/o durante su expendio.

1.2.2. JUSTIFICACION Existen razones fundamentales para realizar este tipo de investigacin como son la sola presencia de Coliformes, mohos, Bacillus y Salmonella en frituras que ya nos indica la contaminacin a partir de portadores que han manipulado el alimento y la exposicin de estos productos en plena va pblica.

II. PARTE TEORICA O MARCO TEORICO Amrica Latina produce cerca de 8 millones de toneladas de papas anualmente. La produccin y el rendimiento varan considerablemente entre pases. Dentro de la Zona Andina, Per tiene la ms alta tasa de crecimiento de la produccin y rendimiento. El producto ha aumentado cerca del 300% desde los comienzos de 1960. El continuo aumento de la produccin es una respuesta a la fuerte demanda de la papa para consumo en fresco y procesada. El crecimiento en el producto ha sido facilitado entre otras cosas por la disponibilidad de un buen sistema de manejo de plagas y enfermedades.

Las industrias de nivel casero o semi-industrial procesan por su parte menos de 6 toneladas diarias. Los mayores niveles de urbanizacin reciente y una presencia ms activa de la mujer en el mercado laboral han ocasionado cambios en los hbitos de consumo que se reflejan en una mayor demanda por productos procesados o semiprocesados. Para el caso de la papa esto ha significado un crecimiento importante del mercado industrial en los ltimos aos y una previsin para el futuro inmediato que permite esperar que el porcentaje actual de

participacin de la industria de procesamiento en el mercado de la papa llegue por lo menos a duplicarse en los prximos 10 aos. (3) (2005).

Las papas fritas envasadas se obtienen de papas lavadas, peladas, cortadas y fritas en aceite. El mercado nacional ofrece este producto en distintos tamaos y texturas: con sal, con limn y sal, y de distintos sabores como queso o adobo (derivados de la adicin de diversos ingredientes), entre otros. Sin embargo, estrictamente, qu contienen las papas fritas, adems de aceite y sal? Acompenos a descubrirlo. Normalmente, el contenido en materia seca determina el rendimiento del producto terminado. As por ejemplo, aumenta el rendimiento de las hojuelas por menores prdidas cuantitativas de evaporacin de agua, mientras que disminuye la

retencin de aceite en la fritura. Esto es importante, tanto para la economa como para la nutricin fisiolgica. El contenido ideal es de 25% en el caso de papas fritas referidas a materia fresca (medidas a una temperatura prefijada); en caso contrario dejaran de ser comerciales. En la actualidad, las papas fritas envasadas son la marca favorita de todo el mundo, lo que explica la demanda tan alta que estos productos tienen. De hecho, el alto consumo de papas fritas ha dado origen a la fabricacin de otros productos que no son estrictamente papas fritas, pues estn elaborados a base de harina de papa y puestos en empaques que cuidan ms la presentacin del producto (rebanadas ms enteras). (20).(2008). 2.1. Qu contienen De acuerdo con los resultados obtenidos en el presente estudio de calidad, las papas fritas son productos salados y muy energticos, por cada 100 gramos proporcionan entre 489 a 587 kilocaloras, esto debido a su contenido de grasa (entre 23% y 40%) e hidratos de carbono (entre 50% y 60%), aunque tambin aportan otros nutrientes como protena vegetal (de 6% a 8%) y sal (entre el 0.2% y el 1.9%, segn la marca). (20).(2008). 2.2. El estudio En el estudio se evaluaron la calidad microbiolgica 22 muestras de bocaditos fritos a base de Papa (Solanum tuberosum) que se elaboran y expenden en forma artesanal en la Urb. Ciudad del Pescador Distrito Bellavista Callao. (venta ambulante), todos correspondientes a los que slo contienen sal. Para el anlisis se tomaron 2 muestras mensual de diferentes carritos expendedores en distintos puntos de venta. El estudio tambin incluye el anlisis de papas fritas a granel para informar sobre su calidad microbiolgica exigida por la Norma Sanitaria N RM-591. Cada producto se someti a las pruebas que a continuacin se indican.

Segn la Norma Sanitaria que establece los criterios microbiolgicos de calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano (R.M. N 591 2008/MINSA) Protocolo para los anlisis microbiolgicos de Granos de Cereales, leguminosos, quenopodiceos y derivados (harinas y otros), segn DIGESA grupo V. GRANOS DE CEREALES, LEGUMINOSAS,

QUENOPDIACEAS Y DERIVADOS (harinas y otros)

(V-8): Hojuelas a base de

granos (gramneas, quenopodiceas y leguminosas) que requieren coccin: (22)

2.3. PARAMETROS DE EVALUACION Limite por g Agentes Microbianos Aerobios mesfilos Mohos Coliformes Bacillus cereus Salmonella sp. Categora Clases N 2 2 5 8 10 3 3 3 3 2 5 5 5 5 5 c m 2 2 2 1 0 104 103 102 102 Ausencia/25g M 106 104 103 104

Categora.- Escala relativa al riesgo que representa un alimento y a la manipulacin posterior prevista. Grado de riesgo que representan los microorganismos en relacin a las condiciones previsibles de manipulacin y consumo del alimento. (22) Componentes del plan de muestreo "n" (minscula): Nmero de unidades de muestra, seleccionadas al azar de un lote, de acuerdo a normas nacionales o internacionales referidas a alimentos y bebidas apropiadas para fines de realizar el anlisis microbiolgicos. (22)

"c": Nmero mximo permitido de unidades de muestra rechazables en un plan de muestreo de 2 clases o unidades de muestra provisionalmente aceptables en un plan de muestreo de 3 clases. Cuando se detecte un nmero de unidades de muestra mayor a c se rechaza el lote.
(22)

"m" (minscula): Lmite microbiolgico que separa la calidad aceptable de la rechazable. En general, un valor igual o menor a m, representa un producto aceptable y los valores superiores a "m indican lotes rechazables en un plan de muestreo de 2 clases. (22) "M" (mayscula): Los valores de recuentos microbianos superiores a "M" son inaceptables, el alimento representa un riesgo para la salud. (22) Clase.- Son los planes de muestreo que se expresan en trminos de clase son dos o tres.- Los de planes de muestreo dependen del grado del peligro involucrado. (22). Tipos de plan de muestreo para lote o lotes: A. Plan de 2 clases: Es un plan de muestreo por atributos, donde puede establecerse nicamente la condicin de "aceptable" o "rechazable".- Se usa cuando no se puede tolerar la presencia o ciertos niveles de un microorganismo en ninguna de las unidades de muestra. Un plan de 2 clases queda definido por n y c; Para microorganismos patgenos: Condicin de "aceptable" = Para otros microorganismos Condicin de "aceptable" = menor o igual al nivel crtico establecido, c Condicin de "rechazable" = mayor al nivel crtico establecido, c ausencia Condicin de "rechazable" = presencia

B. Plan de 3 clases: Es un plan de muestreo por atributos.- Se usa cuando se

puede tolerar cierta cantidad de microorganismos en algunas de las unidades de muestra que queda definido por "n", "c", "m", "M"; donde se establece: Condicin de "aceptable": Cuando todas las unidades de muestra presentan recuentos igual o inferiores a "m". Cuando hasta "c" unidades de muestra pueden tener recuentos entre "m" y "M" (incluido "M"). Condicin de "rechazo": Cuando ms de "c" unidades de muestra presentan recuentos entre "m" y "M" (incluido "M"). Cuando al menos 1 de las unidades de muestra presentan recuentos superiores a "M".(22) La realizacin del presente trabajo servir como un aporte para la mejora del expendio ambulante de estos alimentos en dicha zona. No se han reportado oficialmente trabajos realizados en la zona. Contenido de sodio. La Organizacin Mundial de la Salud recomienda no consumir ms de seis gramos de sal al da (2,400 mg de sodio), por lo que se consider necesario consignar en las tablas de resultados el aporte que proporcionan los productos analizados. Calidad sanitaria. Para comprobar la inocuidad del producto, se determin la ausencia de microorganismos patgenos y de microorganismos indicadores de manejo sanitario deficiente. 2.4. Determinacin del Universo Las muestras para el anlisis se obtuvieron de los carritos expendedores que circulan por la Urb. Ciudad del Pescador Distrito Bellavista - Callao. El tipo de muestreo es aleatorio. Tamao de muestra = 22 muestras. 2.5. Mtodos experimentales La parte experimental se desarrollo en el laboratorio de Microbiologia Chucuito, se adquiri los medios y reactivos especficos para cada microorganismo, para la identificacin bioqumica y serolgica de los mismos.

III. MATERIALES Y METODOS 3.1. Mtodo para la obtencin de papas fritas en hojuela Dentro de las mltiples posibilidades de la papa en Per, la ms interesante es la transformacin en hojuelas (Chips). La gran diversificacin de la industria procesadora obliga a un mejoramiento gentico de la papa para asegurar un buen rendimiento y la mxima calidad en papas fritas (hojuelas)). Los requerimientos de calidad que hay que cumplir son: color aceptable (bajo contenido en azcares menos del 0.1%), alto contenido en materia seca (ms del 20%), excelente textura y sabor del producto final, libre de enfermedades y daos y tamao entre 40 y 80 mm. El color tiene una relacin directa con el contenido en azcares reductores. En su apariencia externa y evolucin, el color debe ser: desde un color blancoamarillento, (aceptable) pasando por un color amarillo-oro (deseable) hasta un color marrn-negruzco (rechazable), que viene dado por una alta concentracin de azcares reductores (2%) y que hace un producto indeseable en sabor y apariencia. La buena apariencia, textura crujiente y sabor agradable son puntos importantes de cara al consumidor y a la venta del producto. Ello se consigue, lgicamente, procesando papas de alta calidad, supervisadas y clasificadas para este tipo de procesamiento. (5)(1998). Los factores que influyen directamente en la calidad final de las papas fritas y prefritas son, fundamentalmente, la temperatura en almacenamiento, variedad empleada y madurez fisiolgica del tubrculo y, con menor trascendencia, la composicin del suelo, la fertilizacin, el medio ambiente y el riego. PARDEAMIENTO POR COCCION DE PAPAS PARA CONSUMO FRESCO En diferentes variedades de papas para consumo en fresco aparece el pardeamiento por coccin, la cual es la coloracin azul-griscea que presentan los tubrculos

despus de cocinarlos. En esta coloracin estn involucradas sustancias qumicas como: hierro, cido clorognico, cido cafeico, fenoles totales, cido ctrico, etc.
(2)(1997).

3.1.1. Materiales a. Cinco variedades de Papas nativas b. Aceite vegetal de soya: 2 litros c. Freidora elctrica de capacidad de fritura 150 - 200 grs/batch de hojuela cortada d. Hervidor elctrico e. Papel absorbente f. Sal refinada g. Cortadora manual para hojuelas h. Selladora de bolsas i. Balanza j. Bolsas de polipropileno k. Coladores de plstico l. Detergente m.cido ctrico n. Cloros o. Baldes de plstico p. Diversos recipientes.

Diagrama de Flujo para Obtener Hojuelas de Papa

Recepcin y pesado

Seleccin y clasificacin

Lavado y desinfectado (con 20 ppm de cloro)

Agua

Cortado

Agua a 50 C

Escaldado

Escurrido

Agua

Fritado:

Temperaturas 170, 180 y 190 C Tiempo 5, 6 y 7 minutos

Enfriado

Envasado y pesado

3.1.2. Descripcin del proceso: a. Recepcin y pesado: Se realiza esta operacin con la finalidad de determinar el rendimiento conversin de la materia prima a hojuelas o chips de papa. b. Seleccin y clasificacin: En este proceso se retira del proceso, aquellas papas que tiene defectos externos visibles. c. Lavado y desinfectado: El objetivo es eliminar la suciedad que viene inherente al producto por sucesivos lavados con la ayuda de esponjas; despus se aade cloro al agua para reducirla carga microbiana. d. Cortado: Se cort en forma de laminas cuyo espesor debe fluctuar entre 1 a 1.2 mm. variando el dimetro en funcin a las caractersticas fenotpicas de la variedad. e. Escaldado: Se considera como una operacin crtica. Las rodajas de papa son escaladas enagua para inactivar enzimas y cuya temperatura no deber de exceder los 50 C por un tiempo de 3 a 5 minutos; un exceso de calor y tiempo puede modificar las caractersticas del producto. f. Oreado: En lo posible eliminar el sobrenadante del agua que queda en las hojuelas porque encaso contrario en el fritado se formaran bolsas de aire, el cual le resta calidad. g. Fritado: Tiene por finalidad de la coccin y brindar las caractersticas organolpticas y principalmente crocantes debido a la baja humedad que queda en el producto, se ensayaron diferentes tiempos y temperaturas de fritado. h. Enfriado: Las hojuelas fritas previo escurrido del aceite se enfriaron en bandejas los cuales contenan papel para absorber el aceite adherido a las hojuelas. i. Salado: Con la finalidad de resaltar el sabor de las hojuelas se le agrega una pizca de sal finamente molida a gusto del cliente. j. Envasado y pesado: Con la finalidad de mantener las caractersticas organolpticas del producto como crocantes, textura y el crounch las hojuelas de papa son envasadas en bolsas de polipropileno. (2) (1997), (6) (1989).

3.2. Procesamiento de las muestras de papa en hojuela para su anlisis Microbiolgico. 3.2.1. Triturado de la muestra Se trata de una operacin importante dentro de la preparacin de la muestra para su anlisis. En el triturado hay que evitar la destruccin de los grmenes por rotura de su membrana o por un calentamiento excesivo. Adems de una perfecta trituracin de los alimentos, es necesario obtener una mezcla homognea para lograr la distribucin equilibrada de los grmenes y sus toxinas. (10) (2000).

3.2.2. Tcnica del Triturador de paletas (Stomacher) (*)(Mtodo ICMSF). Que acta golpeando rtmicamente la mezcla de alimento y diluyente que ha sido introducida previamente en una bolsa de plstico estril. Los choques producidos por las paletas dislaceran el alimento y ponen a las bacterias en suspensin.

3.2.2.1. Material y Aparatos 1. Stomacher Colworth, o aparato similar, operando a unas 230 r.p.m. y con una capacidad de 400 ml. 2. Bolsas de polietileno de paredes delgadas (aproximadamente del calibre 200), de unos 18 x 30 cm y con el fondo soldado. 3. balanza de una capacidad no inferior a 2.5 g y de una sensibilidad de 0.1 g. 4. Instrumentos para prepara las muestras: cuchillos, tenedores, pinzas, tijeras, cucharas, esptulas depresores linguales, todo ello previamente esterilizado en autoclave o por aire caliente. 5. Frigorfico, a 2 5 C. 6. Pipetas bacteriolgicas estriles de 1 y 10 ml.

7. Agua de peptona para diluciones o agua de peptona salina para diluciones. El diluyente se repartir en volmenes de 9 o de 90 ml en tubos de cultivo o en frascos de dilucin. Tanto el diluyente como los recipientes en los que se reparten deben estar convenientemente esterilizados.

3.2.2.2. Tcnica 1. Comenzar a trabajar tan pronto como sea posible despus de la toma de muestras. Pesar, en un bolsa de polietileno previamente tarada, al menos 10g representativos de la muestra total (ICMSF, 1974). Los alimentos congelados no precisan ser previamente descongelados a no ser que ello resulte necesario para pesar las unidades de muestra. Tampoco es necesario picar, antes de homogeneizar, alimentos como la carne. Si es preciso descongelar la muestra, esta se mantendr en su envase original (o en el recipiente en que llego al laboratorio) en un frigorfico a 2 5 C y se iniciara el anlisis tan pronto como la descongelacin permita tomar adecuadamente las unidades de muestra (el tiempo mximo de

descongelacin no superara las 18 horas). 2. Aadir un volumen de diluyente igual a 9 veces la muestra. As se obtiene una dilucin 10-1. 3. Si se sabe o se sospecha que el alimento contiene grmenes patgenos, es conveniente colocar la bolsa conteniendo la muestra y el diluyente dentro de otra bolsa como precaucin frente a la posibilidad de que se rompa la primera. 4. Para alimentos con un elevado contenido en grasa (superior al 20%) como ocurre por ejemplo en ciertas carnes, es necesario aadir un 1 % de Tween 80 o de otro tensoactiv no toxico. 5. Colocar la bolsa en el Stomacher y hacer funcionar el aparato durante 60 segundos.

6. Agitar energticamente la bolsa con las manos y pipetear 10 ml en un frasco conteniendo 90 ml de diluyente, o bien pasar 1 ml a un tubo conteniendo 9 ml de diluyente. De este modo se obtiene la dilucin 10-2 7. Agitar energticamente la suspensin de 100 ml 25 veces en un arco de 30 cm, o aspirar 10 veces la suspensin de 10 ml con una pipeta estril. Pipetear 10 ml en un nuevo blanco de dilucin de 90 ml o 1ml en uno de 9 ml, obteniendo de esta forma la dilucin 10-3. Repetir esta operacin para preparar las diluciones 10-4 y 10-5, o las necesarias, segn indique la experiencia, para el alimento que se va a analizar.

(*)

Este mtodo no es utilizado especficamente en ninguna regin determinada del mundo,

pero est adquiriendo

cada vez mayor popularidad debido a las ventajas que presenta sobre todo en lo que se refiere a ahorro de trabajo. El Stomacher Colworth 400 puede obtenerse de la firma A. J. Seward and Co. Ltd., BlacKfriars Road, Londres, Inglaterra. (10) (2000).

3.2.3. Recuento Estndar en placa de Microorganismos Aerobios (Mtodo ICMSF). 3.2.3.1. Material y Aparato 1. Los sealados anteriormente en la prctica, para la preparacin y dilucin de los homogenizados de alimentos. 2. Placas petri de vidrio (100 x 15 mm) o plstico (90 x 15 mm). 3. Pipetas bacteriolgicas de 1,5 y 10 ml (de idnticas caractersticas a las exigidas para diluciones de muestras de leche; Hausler 1972). 4. Bao de agua o estufa de aire para templar y mantener el medio fundido a 44 - 46C. 5. Estufa de incubacin, 29-31C. (Nota: la constancia y uniformidad de la temperatura en las estufas son notoriamente deficientes. Para comprobar el primer factor, mantenimiento de una temperatura constante, deben realizarse lecturas continuas o frecuentes de la temperatura interior,

durante un periodo de tiempo de varias horas, utilizando pares trminos o termmetros adecuados. Para comprobar la uniformidad de la temperatura en el interior de la estufa, deben hacerse lecturas similares, tambin en un periodo de varias horas y en distintos lugares, cuando se encuentre llena de placas petri {vase tambin Hausler, 1972}. Al colocar las pilas de placas de petri dentro de la estufa hay que tener presente que estas

deben estar separadas entre s y tambin de las paredes y del techo de la estufa. Cada montn o pila debe estar formado como mximo por seis placas, siendo preferible que su nmero no sea superior a cuatro). 6. Contador de colonias (se recomienda el modelo Quebec de campo oscuro o equivalente). 7. Dispositivo de registro automtico del nmero de colonias contadas. 8. Agar para recuento en placa Plate Count: P.C.(Agar de los Standards Methds;).

3.2.3.2. Tcnica 1. Preparar la muestra de alimentos por el procedimiento recomendado en la seccin sobre preparacin y dilucin de los homogenizados de alimentos. 2. Pipetear por duplicado, en placas de petri, alcuotas de 1ml de las diluciones 10-1,10-2, 10-3, 10-4, 10-5 y una alcuota de 0,1 ml de la dilucin 10-5, lo que supone la siembra por placa de 10-1 a 10-6g de alimentos. Se aconseja esta serie de disoluciones en aquellos casos en que se desconoce el nmero aproximado de grmenes presentes en el alimento, pero el rango de diluciones preparadas y sembradas puede modificarse en funcin a la cifra de microorganismos esperada. De todos modos, siempre deben sembrarse tres diluciones distintas. 3. Fundir el agar para recuento en placa utilizando vapor de agua hirviendo y procurando que este en tratamiento trmico no sea excesivamente prolongado. Templar el medio a 44-46C y controlar cuidadosamente su temperatura para que al mezclarlo con la dilucin del alimento no sean inactivados los grmenes. Verter inmediatamente en las placas de petri 1015 ml de medio fundido y templado. El periodo de tiempo transcurrido entre la realizacin de las diluciones y el vertido del medio no debe superar los 20 minutos y es preferible que sea inferior a 10 minutos. 4. Acto seguido, mezclar el inocuo con el medio fundido, inclinando y girando las placas. La forma adecuada de llevar a cabo esta operacin sera la siguiente: (a) imprimir a la placa movimiento de vaivn 5 veces con una direccin, (b) hacerla girar 5 veces en sentido de las agujas del reloj, (c) volver a imprimir movimientos de vaivn en una direccin que forme ngulo recto con la primera y (d) hacerla girar 5 veces en sentido contrario a las agujas del reloj. 5. Con el fin de controlar la esterilidad, preparar una o varias placas conteniendo medio y el diluyente sin inocular. Transcurrido el periodo de

incubacin, el numero de colonias presentes en estas placas no debe modificar el recuento en ms de una unidad en la segunda cifra significativa (vase el apartado 8). 6. Una vez solidificado el agar, invertir las placas e incubarlas a 29-31C por 48+3 horas. 7. Calcular el recuento estndar en placa o el recuento estndar en placa estimado de acuerdo con las directrices recogidas en las apartados 8 y 9.Tener en consideracin todas las instrucciones relativas al clculo, a los datos que deben anotarse a la presencia de inhibidores y de colonias de crecimiento difusivo en superficie, a los informes e interpretacin y a la reproductibilidad y error personal, que se presenta en los puntos 10 a 14. 8. Calculo del recuento estndar en placa (a) Elegir las dos placas, correspondientes a una dilucin, que presenten

entre 30 y 300 colonias. Contar todas las colonias de cada placa utilizando el contador de colonias y el dispositivo de registro automtico. Hallar la media aritmtica de los dos valores y multiplicarla por el factor de dilucin (la inversa de la dilucin cuyas placas han sido seleccionadas). Dar el valor obtenido como el recuento estndar en placa (vase el apartado 10, ms adelante).

Ejemplo: Dilucin 10-2 Placa 1 : 72 colonias x 102 = 7.200 Placa 2 : 76 colonias x 102 = 7.600 Se promedia: 7.200 + 7.600 = 7.400 colonias 2 Se reporta: 74 x 102 u.f.c./g. o mL.

(b)

Si una de las placas de la dilucin elegida presenta algo menos de 30

colonias o algo ms de 300, deben contarse tambin todas las colonias de ambas y como en el caso anterior, hallar la media aritmtica y multiplicarla por el factor de dilucin. El valor obtenido se dar como el recuento estndar en placa.

Ejemplo: Dilucin 10-2 Placa 1 : 22 colonias x 102 = 2.200 Placa 2 : 46 colonias x 102 = 4.600 Se promedia: 2.200 + 4.600 = 3,400 colonias 2 Se reporta: 34 x 102 u.f.c./g. o mL.

(c) Cuando las placas de dos diluciones consecutivas presentan entre 30 y 300 colonias, deben hallarse los recuentos estndar en placa de cada dilucin tal como se ha sealado anteriormente y se dar como resultado la media de los dos valores obtenidos, a no ser que uno de ellos sea superior al doble del otro, en cuyo caso se dar como recuento estndar en placa el valor ms bajo.

Ejemplo 1: Dilucin 10-1 = N promedio de colonias contadas : 290 Dilucin 10-2 = N promedio de colonias contadas: 35 Se relaciona el cmputo de los 2 recuentos : 3.500 2.900 En este caso se reporta el promedio: 2,900 + 3,500 = 3,200 col. 2 Se reporta: 32 x 102 u.f.c./g. o mL. = 1.2

Ejemplo 2: Dilucin 10-2 = N promedio de colonias contadas : 170 Dilucin 10-3 = N promedio de colonias contadas : 45 Se relaciona el cmputo de los 2 recuentos: 45.000 = 2.2

17.000 En este caso se reporta el recuento menor es decir: 17.000 col. Se reporta: 17 x 103 u.f.c./g. o mL. 9. Clculo del recuento estndar en placa estimado (R.E.P.E.) (a) Si ninguna de las placas tiene entre 30 y 300 colonias, el valor calculado se da como el recuento estndar en placa estimado y el clculo del nmero de grmenes presentes en el alimento se lleva a cabo en los distintos casos en la forma en la que se indica en los apartados (b), (c) y (d), a continuacin. (b) Si todas las placas presentan ms de 300 colonias, dividir las dos placas, correspondientes a la dilucin ms elevada, en secciones radiales (2,4 u 8) y contar todas las colonias que se hallan en una o ms secciones. Multiplicar el conseguir una estimacin del nmero total de colonias presentes en la placa. Hallar la media de valor estimado por las dos placas y multiplicar por el factor de dilucin correspondiente. El valor obtenido se da como el recuento estndar en placa estimado. (c)Si en las placas inoculadas con la dilucin menos concentrada se encuentran ms de 200 colonias en una seccin correspondiente a la octava parte de la placa, multiplicar 1.600 (procedente de 200 x 8) por el factor de dilucin y expresar el recuento estndar en placa estimado con superior (>) al valor obtenido. Ejemplo: 1,600 x (103) = > 1600,000 u.f.c./g. o mL. En estos casos resulta aconsejable sealar entre parntesis la dilucin utilizada.

(d) Cuando no se encuentran colonias en las placas correspondientes a la dilucin ms concentrada, expresar el recuento estndar en placa estimada como inferior a (<) 1 multiplicado por el factor de la dilucin ms concentrada. Ejemplo: 10-1 = 0 colonias. Se reporta como <10 u.f.c./g. o mL. 10. Calculo y representacin de los resultados Cuando se dan los valores del recuento estndar en placa o recuento estndar en placa estimado, deben utilizarse nicamente dos cifras significativas. Estas dos cifras corresponden a los dgitos primera y segunda (empezando por la izquierda) de la media de la colonias halladas o estimadas. Los dgitos restantes tienen que ser sustituidos por ceros. Por ejemplo, si el valor calculado fue de 523.000, este a de darse como 520.000 (52 x 104). Si el tercer digito empezando por la izquierda es 5 o superior, se le aade una unidad al segundo digito (se redondea). Por ejemplo, si el valor calculado es 83.600, este debe hacerse como 84.000 (84 x 103).

11. Presencia de colonias de crecimiento difusivo en superficie (a) Cuando las placas elegidas aparezca estas colonias y siempre que el rea ocupada por ellas no supere la mitad de la placa, contar las colonias de otro tipo que se encuentran fuera de esta zona. Corregir la cifra obtenida teniendo en cuenta el rea en que no se a podido contar las colonias.

(b) Siempre que la zona ocupada por este tipo de colonias supere la cuarta parte de la superficie de la placa hay que anotar su presencia. Si este problema lo presenta ms que una placa de cada veinte hay que tomar las medidas necesarias para evitar su aparicin (como, por ejemplo reducir la humedad de la estufa de

incubacin o mezclar el inculo con el medio fundido y templado de forma mas completa). 12. Presencia de inhibidores En algunos casos se puede sospechar la presencia de inhibidores. Las sospechas surge cuando el numero de grmenes en la dilucin ms concentrada es notablemente menor de los que cabria esperar. Para la deteccin de los posibles inhibidores pueden utilizarse diversas pruebas, recomendndose las descritas por la International Dairy Federation (IDF, 1970b). 13. Presentacin e interpretacin de los resultados (a) Los resultados obtenidos deben darse como recuento estndar en placa o como recuento estndar en placa estimada por gramo o por mililitro de alimento, segn corresponda. (b) Siempre que se utilice el mtodo de recuento en placa para decidir si una partida de alimentos se acepta o se rechaza, debe tenerse en consideracin nicamente de recuento estndar en placa y nunca en recuento estndar en placa estimada. Desde el punto de vista de un organismo oficial, el

recuento estndar en placa estimado es solo til como una aproximacin inicial para valorar la calidad bacteriolgica de un alimento. (c)En el caso de que se utilice el recuento en placa para establecer si un alimento determinado (por ejemplo, leche) se cumple una norma microbiolgica, vase la obra de la comisin sobre planes de muestreo (ICMSF, 1974).

3.2.4. Mtodo de Recuento de Levaduras y Mohos por siembra en placa en todo el medio (Mtodo ICMSF). 3.2.4.1. Material y Aparatos 1. Lo necesario para la preparacin y dilucin de los homogeneizados de alimentos (Primera prctica). 2. Placas de Petri, de vidrio (100 15mm) o de plstico (90 15mm). 3. Pipetas bacteriolgicas de 1,5 y 10 ml. 4. Bao de agua o estufa de aire forzado para templar el agar fundido, 4446C. 5. Estufa de incubacin, 20 - 24 C. 6. Contador de colonias (tipo Quebec de campo oscuro o similar). 7. Dispositivo de recuento con registro automtico. 8. Agar Oxitetraciclina Gentamicina extracto de levadura glucosa OGY1.

3.2.4.2. Tcnica 1. Preparar la muestra de alimento por uno de los tres procedimientos recomendados en el captulo sobre preparacin y dilucin de los homogeneizados de alimentos. 2. Pipetear en placas de Petri alcuotas de 1 ml de las diluciones 10-1, 10-2,

10-3, 10-4, 10-5, utilizando dos placas por cada dilucin. Se propone esta serie de diluciones para los casos en que no se conozca el nmero aproximado de unidades formadoras de colonias presentes en la muestra. Por supuesto, las diluciones que han de prepararse y sembrarse siempre sern funcin del recuento esperado. 3. Rpidamente, verter en las placas de Petri 10 -15 ml del agar oxitetraciclina gentamicina extracto de levadura glucosa, fundido y templado a 44-46 C. 4. Mezclar inmediatamente el inculo con el agar balanceando la placa de izquierda a derecha cinco veces, rotndola en el sentido de las agujas del

reloj otras cinco veces, realizando otras cinco veces el movimiento de vaivn en sentido perpendicular al primero y rotndola, finalmente cinco veces en sentido contrario a la agujas del reloj. 5. Invertir las placas cuando se haya solidificado el agar e incubarlas a 2024C durante 3-5 das. 6. Con ayuda del contador de colonias y del dispositivo de recuento con registro automtico, contar las colonias en aquellas placas que

contengan entre 30 y 300, llevando a cabo un examen microscpico cuando sea necesario para identificar las colonias de levaduras. 7. Calcular el nmero de levaduras y mohos por gramo o mililitro de alimento.

3.2.4.3. Lectura y Expresin de Resultados 1. Proceder la lectura, como en la Numeracin de Microorganismos Aerobios Mesofilos Viables. 2. Elegir para el reporte las placas que contengan entre 30-300 UFC/ g. o ml. Se cuentan todas las colonias de Mohos y de Levaduras por separado 3. Reportar como Levaduras / gr o ml de muestra. 4. Reportar como Mohos / gr o ml de muestra.

Preparar 900 ml de Agar base extracto de levadura-glucosa, luego distribuir en volmenes de 90 ml y esterilizar por autoclavado.; luego al momento de su utilizacin adicionar 10 ml. de Oxitetraciclina (10 mg por cada 100

ml de medio). La oxitetraciclina se prepara en condiciones estriles, en la proporcin de 100 mg de oxitetraciclina por cada litro de medio.

3.2.5. RECUENTO DE COLIFORMES: TCNICA DEL NMERO MS PROBABLE (NMP) MTODO ICMSF 11 (Norteamericano)

3.2.5.1. Material y Aparatos

1. Lo necesario para la preparacin y dilucin de los homogeneizados de alimentos, (Primera prctica). 2. Estufa de incubacin, 35-37C. 3. Pipetas bacteriolgicas de 1ml. 4. Asa de inoculacin, con alambre de nicrom o de platino-iridio. 5. Caldo lactosa bilis (2%) verde brillante, volmenes de 10ml en tubos de 150 x 15mmm, conteniendo tubos de fermentacin de Durham invertidos (75x 10mm). 6. Caldo lauril sulfato triptosa, volmenes de 10ml en tubos de 150 x 15mm, conteniendo tubos de fermentacin de Durham invertidos o viales similares de vidrio( 75 x 10 mm) 7. Agar eosina azul de metileno (EMB) o agar de ENDO, para placas.

3.2.5.2. TCNICA

1. Preparar las muestras de alimentos por uno de los procedimientos recomendados en la seccin sobre preparacin y dilucin de los homogeneizados de alimentos. Para hacer las diluciones pueden utilizarse los blancos de dilucin o frascos de diluyentes sobrantes del mtodo de recuento en placa. (Importante: una vez hechas las diluciones del alimento, debe procurarse que transcurra el menor tiempo posible hasta que se

realizan las siembras, pues as se evitan la multiplicacin o la muerte de los microorganismos suspendidos en el diluyente).

2. Pipetear 1 ml de cada una de las diluciones del homogeneizado del alimento en tubos de caldo lauril sulfato triptosa, utilizando tres tubos por cada dilucin. 3. Incubar los tubos a 35-37C durante 24 y 48 horas. 4. Pasadas las 24 primeras horas, anotar los tubos que muestren produccin de gas2 Volver a la estufa los tubos negativos para su incubacin durante 24 horas ms. 5. Pasadas las 48 horas, anotar los tubos que muestren produccin de gas2. 6. Elegir la dilucin ms alta en la que sean positivos de formacin de gas los tres tubos y las dos diluciones superiores ms prximas. Por ejemplo, si la dilucin ms alta en la que aparecen los tres tubos positivos es la 1:100 y en la 1:1.000 hay un tubo positivo y en la 1:10.000 ninguno, el resultado se anotara del siguiente modo: dilucin 1:100=3, dilucin 1:1000=1 y dilucin 1:10.000=0. Estos resultados corresponden en la tabla del NMP para series de tres tubos a un NMP de 400. Si no hubiera ninguna dilucin que presentase los tres tubos positivos, seleccionar las tres diluciones ms altas con algn tubo positivo fueran 1:10, 1:100, 1:1.000 y 1:10.000 con 2, 2, 1 y 1 tubos positivos , respectivamente , los resultados se anotan como 1:100=2, 1:1.000=1 y 1:10 .000=1. Este resultado corresponde en la tabla del NMP a 200. Cuando no se hayan hechos diluciones ms altas, de forma que la ultima presente tambin los tres tubos positivos , seleccionar las tres ltimas diluciones realizadas. Por ejemplo, si las tres ltimas diluciones realizadas fueran 1:100, 1:1.000 y 1:10.000, y el nmero de tubos positivos fuera 3, 3 y 3, respectivamente, los resultados se anotaran como 1:100=3, 1:1.000=3 y 1:10.000=3. En este caso el NMP es igual o mayor de 11.000. 7. Confirmar que los tubos de caldo lauril sulfato triptosa seleccionados en el paso 6 son positivos de organismos coliformes, transfiriendo un asa de cada tubo a otro tubo de caldo lactosa bilis (2%) verde brillante o sembrando por estra en placas de Agar eosina azul de metileno o de Agar de Endo. Incubar

los tubos de confirmacin durante 24-48 horas a 35-37C y observar la produccin de gas. La formacin de las confirma la presencia de organismos coliformes. Observar los medios slidos de confirmacin para ver si existen colonias tpicas de coliformes despus de 24 y 48 horas de incubacin a 3537C. La formacin en el Agar eosina azul de metileno de colonias negras o con el centro negro, o bien de colonias de colonias mucoides de color rosa naranja confirma la presencia de organismos coliformes .De modo semejante, en Agar de Endo las colonias de coliformes son rojas y estn rodeadas tambin de halos rojos. 8. Anotar el nmero de tubos confirmados como positivos de organismos

coliformes en cada dilucin. 9. Para obtener el NMP, proceder de la forma siguiente. Ver en cada una de las tres diluciones seleccionadas el nmero de tubos en los que se confirmo la presencia de coliformes. Buscar en la tabla del NMP (tabla 6) y anotar el NMP que corresponda al nmero de tubos positivos de cada dilucin. As, si en el primer ejemplo dado en el punto 6 anterior todos los tubos positivos en las tres diluciones seleccionadas (1:100, 1:1.000 y 1:10.000) resultasen

confirmados de presencia de coliformes, los valores de cada dilucin serian 3, 1 y 0, respectivamente. Para calcular el NMP de organismos coliformes por gramo de alimento, se multiplica el valor que figura en la tabla por 10(en este ejemplo 40 x 100 = 400 por gramo).

Este mtodo sigue el recomendado para el agua (APHA y col., 1976) y los alimentos (APHA, 1966; Lewis y Angelotti, 1964; AFDOUS, 1966; USFDA, 1972; AOAC, 1975).

TABLA 01. Numero Ms Probable (NMP) de bacterias; tres tubos por cada dilucin. Numero de tubos positivos en cada Limites de confianza dilucin Dilucin Dilucin Dilucin NMP/ 99% 95% -1 -2 -3 10 10 10 gramo 0 1 0 3 <1 23 <1 1 1 0 0 4 <1 28 1 2 1 0 1 7 1 35 2 2 1 1 0 7 1 36 2 2 1 2 0 11 2 44 4 3 2 0 0 9 1 50 2 3 2 0 1 14 3 62 5 4 2 1 0 15 3 65 5 5 2 1 1 20 5 77 8 6 2 2 0 21 5 80 8 6 3 0 0 23 4 177 7 12 3 0 1 40 10 230 10 18 3 1 0 40 10 290 20 21 3 1 1 70 20 370 20 28 3 2 0 90 20 520 30 39 3 2 1 150 30 660 50 51 3 2 2 210 50 820 80 64 3 3 0 200 <100 1.900 100 1.400 3 3 1 500 100 3.200 200 2.400 3 3 2 1.100 200 6.400 300 4.800

a b

Calculada a partir de los datos de Man De cada dilucin se inoculan tres tubos de medio, cada uno con 1ml. Para calcular el NMP de diluciones mayores que las figuran en la tabla, multiplicar el NMP por el factor adecuado: 10,100,1.000,etc. Por ejemplo, si los tubos seleccionados corresponden a las diluciones 10-2,10-3 y 10-4, multiplicar por 10; si las diluciones son 10-3,10-4 y 10-5, multiplicar por 100.

3.2.6. Recuento de presuntos Bacillus cereus (Metodo ICMSF). 3.2.6.1. Material y Aparatos 1. Los sealados anteriormente en la prctica, para la preparacin y dilucin de los homogenizados de alimentos. 2. Placas petri de vidrio (100 x 15 mm) o plstico (90 x 15 mm). 3. Pipetas, 1, 5 y 10 ml, graduada en unidades de 0,1 ml 4. Difusor de varillas de vidrio (por ejemplo, palo de hockey) 3-4 mm de dimetro con un rea mm 45-55 difusin 5. 6. 7. 8. Incubadoras, 30 2 C y 35 2 C Cuenta Colonia Mechero Bunsen Asas de alambre, N 24 de nicrom o alambre de platino, 2 mm y 3 mm de dimetro 9. Vortex mezclador

10. Microscopio, portaobjetos y cubreobjetos 11. Tubos de cultivo, 13 x 100 mm, estril 12. Tubos de ensayo, 16 mm x 125, o la placa de punto 13. Botellas, 3 onzas, estril 14. Recipiente de anaerobios, BBL GasPak, con H catalizador 15. Bao de agua, 48 a 50 C 16. Bastidores tubo de cultivo 17. Bao de agua o estufa de aire forzado para mantener el agar fundido, 4446 C. 18. Estufa de incubacin, 35-37 C. 19. Agar yema de huevo polimixina rojo fenol (MYP), agar yema de huevo sal polimixina cloruro de trifeniltetrazolio o agar sangre de caballo, para placas.
2

+ CO

sobres generador y

3.2.6.2. Tcnicas 1. Preparar las muestras de alimento por el mtodo propuesto en la presente gua para la preparacin de los homogeneizados de alimentos. Preparar las diluciones de 10 -1 a 10-4, o ms altas si fuera preciso. 2. Sembrar uniformemente por estra 0,1 ml de cada una de las diluciones decimales en la superficie seca de placas de agar yema de huevo polimixina rojo fenol (MYP), agar yema de huevo sal polimixina cloruro de trifeniltetrazolio o de agar sangre de caballo (previamente secados), utilizando dos placas para cada dilucin. 3. Si se observase el crecimiento de microorganismos del gnero Proteus, con su caracterstico crecimiento extendido por la placa, o se sospechase su existencia en el alimento en estudio, inhibir su difusin aadiendo sobre la superficie de cada placa de medio 1 ml de alcohol etlico del 96 % y dejar que se evapore dentro de la estufa, o bien aumentar la concentracin de cloruro sdico en los medios hasta aproximadamente el 1,5 %. 4. Incubar las placas de agar yema de huevo polimixina rojo fenol o de agar yema de huevo sal polimixina cloruro de trifeniltetrazolio durante 24 horas, y la placa de agar sangre de caballo durante 24-48 horas. Frecuentemente, los microorganismos contaminantes enmascaran las colonias de B.cereus despus de las 24 horas de cultivo en estos medios (Kim y Goepfert, 1971 a,b). 5. Dar como recuento de presunto B. cereus las colonias con las reacciones caracterticas siguientes : (a) en agar yema de huevo polimixina rojo fenol amplias zonas de precipitado sobre un fondo rojo-violeta, (b) en agar yema de huevo sal polimixina cloruro de trifeniltetrazolio colonias de color rojo-prpura brillante, con una amplia zona de precipitado, (c) en agar sangre de caballo hemlisis alfa o beta. 6. Prepare diluciones seriadas de 10
-2 -6

a 10

mediante la transferencia de 10 ml
-6

de muestra homogeneizada (dilucin 1:10) a 90 ml de dilucin en blanco, mezclando bien con agitacin vigorosa, y continuando hasta 10 dilucin se

alcanza.

Inocular las placas duplicadas PAI agar con cada dilucin de la

muestra (incluyendo 1:10) mediante la difusin de 0,1 ml de manera uniforme sobre la superficie de cada plato con una varilla de vidrio estril difusin. Incubar las placas 24 horas a 30 C y observar las colonias de la zona rodeada por precipitado, lo que indica que se produce lecitinasa. B. cereus Colonias son normalmente de color rosa que se vuelve ms intenso despus de una incubacin adicional. Si las reacciones no son claras, las placas se incuban durante 24 h adicionales antes del recuento de colonias. Seleccionar las placas que contienen un

estimado de 15 a 150 eosina rosa, lecitinasa productores de las colonias. Parte inferior de las placas de la marca en zonas con rotulador negro para facilitar el conteo y recuento de colonias que son tpicos de B. Cereus. Este es el recuento en placa de presuncin de B. Cereus. Pick 5 o ms colonias presuntamente positivo de las placas de agar del PAI y la transferencia de inclinaciones de agar nutritivo para su confirmacin como B. Cereus. Confirmar los aislamientos como B. cereus como se describe en F y G, a continuacin. Calcular el nmero de B. Cereus clulas / g de la muestra,

basada en el porcentaje de las colonias de prueba que se confirman como B. Cereus. Por ejemplo, si el recuento de media obtenida con 10 -4 dilucin de la muestra fue de 65 y 4 de 5 colonias de prueba fueron confirmados como B. Cereus, el nmero de B. Cereus clulas / g de alimento es de 65 x 5.4 x 10.000 x 10 = 5.200.000. (NOTA: El factor de dilucin es diez veces mayor que la dilucin de la muestra, ya que slo 0,1 ml fue probado).

3.2.6.3. Confirmacin de B. cereus Adems de B. cereus, otras especies dan reacciones positivas o dbilmente positivas en medios con yema de huevo (Gordon y col., 1973). Tanto el cido formado a partir del manitolcomo las enzimas reductores del cloruro de

trifeniltetrazolio pueden difundir en el medio hasta colonias negativas. Finalmente, la actividad hemoltica no es exclusiva de B. cereus. Por estas

razones,

deben

someterse

confirmacin

colonias

representativas

procedentes de estos medios. Sin embargo, en las pruebas de rutina son suficientes frecuentemente los recuentos, en particular si las reacciones tpicas aparecen bien marcadas. Si ests no fuesen completamente tpicas, llevar a cabo pruebas confirmatorias. Por ejemplo, confirmar las colonias que son yema de huevo y manitol positivas, e inversamente aqullas que son yema de huevo y manitol negativas. Siguiendo el esquema de identificacin de Gordon y col. (1973), confirmar todas las colonias que producen hemlisis alfa en agar sangre.

3.2.7. AISLAMIENTO DE SALMONELAS (Metodo ICMSF). Los mtodos para el aislamiento e identificacin de salmonelas a partir de los alimentos pueden considerarse divididos en seis etapas sucesivas: 1. Enriquecimiento no selectivo. 2. Enriquecimiento selectivo. 3. Siembra en placa de medios slidos selectivos y diferenciales. 4. Estudio de las caractersticas bioqumicas de las colonias sospechosas, en los medios adecuados. 5. Anlisis antignico, en dos fases: (a) empleo del antisuero polivalente O y del antisuero polivalente H, y (b) utilizacin de los antisueros especficos de grupo O y H. 6. Tipificacin por medio de bacterifagos. Los pasos 1 al 3 se refieren al aislamiento y los 4 al 6 a la identificacin. El paso 1 tiene como fin la revitalizacin de las salmonelas daadas por las diferentes condiciones de tratamientos industriales o de almacenamiento. El paso 2 es de enriquecimiento selectivo y sirve para favorecer el crecimiento de las salmonelas en un ambiente que puede contener gran nmero de bacterias diferentes de ellas mismas. El paso 3 permite la visualizacin de las colonias sospechosas, por su aspecto caracterstico. El paso 4 se refiere a la identificacin bioqumica. El paso 5 conduce, por medio de pruebas serolgicas, la identificacin definitiva de las cepas sospechosas como miembros del gnero Salmonella. El paso 6 logra an ms exacta identificacin de los grmenes aislados, identificacin que es de particular inters para propsitos epidemiolgicos, ya que los tipos serolgicos de un grupo fgico comn suelen tener el mismo origen y, a la inversa, las cepas que presentan igual estructura antignica, pero diferente grupo fgico, son probablemente de diferente origen. Antes, el enriquecimiento no selectivo se utilizaba solamente cuando se crea que un tratamiento como el calentamiento, la deshidratacin, la irradiacin o la congelacin, o ciertas condiciones como el bajo pH, haban lesionado las salmonelas en los alimentos. Recientemente, Edel y Kampelmacher (1973) y Gabis y Silliker (1974a) han sealado que incluso en muestras de alimentos tales como carnes crudas y huevo lquido, el preenriquecimiento de la muestra en un

medio no selectivo da como resultado el que se aslen ms salmonelas que en el caso de siembra directa en un medio de enriquecimiento selectivo. Actualmente, basndose en estos descubrimientos, la Comisin recomienda que todas las muestras sean preenriquecidas en un medio no selectivo antes de pasarlas a uno de enriquecimiento selectivo. El enriquecimiento no selectivo se ha realizado tradicionalmente por cultivo de las muestras en caldo lactosado. Esta prctica fue iniciada por North (1961) en el anlisis de la clara de huevo desecada. Con posterioridad, diversos investigadores han estudiado modificaciones en la composicin del medio de preenriquecimiento y han llegado a la conclusin de que su composicin no es tan crtica como se supona. As, por ejemplo, los investigadores europeos han utilizado normalmente agua de peptona tamponada en vez de caldo lactosado (Edel y Kampelmacher, 1968). En algunos alimentos, como la levadura desecada, la composicin de la muestra slo requiere su reconstitucin en agua destilada. En el caso de la leche en polvo descremada, la muestra se reconstituye en agua destilada conteniendo el colorante verde brillante. Los caramelos y bombones se reconstituyen en leche descremada con verde brillante. Con alimentos ricos en grasas, tales como los subproductos grasos de origen animal, la inclusin de Tergitol 7 facilita la dispersin de la grasa en el medio no selectivo. En general, el caldo lactosado y el agua de peptona tamponada son intercambiables. La Tabla 8 presenta un resumen parcial de los medios utilizados para el preenriquecimiento. Un caldo de enriquecimiento selectivo estimula la multiplicacin de las salmonelas y reduce o inhibe el crecimiento de los organismos competitivos, tales como los coliformes, Proteus y Pseudomonas, cuyo crecimiento superara al de las salmonelas, en particular si estos organismos competidores estn presentes en el alimento en un nmero mucho mayor que las salmonelas. El uso de ms de un caldo selectivo, as como la temperatura de incubacin, pueden afectar de forma importante el porcentaje de recuperacin de Salmonella. Datos de Edel y Kampelmacher (1968) sealaron que fue posible recuperar un mayor nmero de Salmonella a partir de muestras de carne cuando los caldos selectivos se incubaban a 43C que cuando se incubaban a 37C, sobre todo en muestras que

contenan un alto nivel de organismos competidores. Estos resultados han sido confirmados por Silliker y Gabis (1974). Tabla 02. Mtodos de enriquecimiento previo para Salmonellas. Producto Huevos completos desecados, yemas de huevo desecadas, claras huevos y congelados, de huevo lquidos mezclas Caldo de preenriquecimiento Caldo lactosa o agua de peptona tamponada (medios 51 y 22,

desecadas, pasterizados

respectivamente).

preparadas en polvo, galletas, frmulas para nios, huevos crudos, carnes

crudas, pasta conteniendo huevo, tintes y sustancias colorantes. Levadura desecada (inactiva). Leche en polvo descremada y leche en polvo entera. Agua destilada. Agua destilada con 2 ml de solucin al 1% de verde brillante por litro3

(Reactivo 5). Caramelos y bombones. Leche en polvo reconstituida con verde brillante (Medio 95). Subproductos grasos animales fundidos, coco. Caldo lactosa con 1% de Tergitol (Medio 52) o agua de peptona tamponada con 0,22% de Tergitol (Medio 23).

Pesar aspticamente 100 gramos de la muestra en un matraz de 2 litros estril (o en un frasco de tapn de rosca

con boca ancha de una capacidad similar). Aadir 1 litro de agua destilada estril y mezclar bien. Determinar el pH mediante papel reactivo (si el pH es < 6,6, ajustar a 6,8 0,2 con NaOH 1N). Aadir solucin de verde brillante y mezclar bien. Incubar como se indica en el texto.

Debido a que es necesario restringir el nmero de variables de seleccin, la Comisin recomienda el uso de caldo selenito-cistina y de caldo tetrationato verde brillante, ambos incubados a 43C. Los agares selectivos generalmente contienen sustancias inhibidoras que hacen que los medios sean selectivos, y un sistema indicador que colorea las colonias o el medio que las rodea, lo que hace al medio diferencial, es decir, capaz de diferenciar caracteres bioqumicos de las colonias que crecen en l. Los laboratorios tienen, a veces, preferencias por determinados medios diferenciales; pruebas realizadas en colaboracin muestran que cada laboratorio obtiene los mejores resultados con aquellos medios con los que est ms familiarizado. Respetando este hecho, la Comisin recomienda que cada laboratorio utilice un medio diferencial de su eleccin, pero que adicionalmente utilice agar sulfilo de bismuto y agar verde brillante. Entre otros medios que pueden utilizarse, estn el agar verde brillante sulfadiazina, el agar verde brillante de MacConkey, el agar desoxicolato citrato, el agar Salmonella-Shigella y aun otros medios selectivos y diferenciales a gusto del propio laboratorio. El valor de los resultados, como en cualquier procedimiento analtico, depender de la adecuada eleccin de la muestra en representacin del lote y de la cantidad de alimento muestreado. La National Academy of Sciences-National Research Council de los EE UU (1969) han recomendado planes de muestreo para la deteccin de Salmonella en alimentos basados en el grado de riesgo que presenta un determinado alimento. Estos mismos planes, ligeramente modificados, han sido recomendados por la ICMSF (1974).

Investigaciones patrocinadas por la ICMSF y otros organismos han mostrado que no es necesario analizar cada una de las muchas muestras o unidades analticas obtenidas de un determinado lote de alimentos (Silliker y Gabis, 1973). Estas mltiples unidades analticas pueden ser combinadas o mezcladas, a fin de obtener unidades mayores para realizar las pruebas. Por ejemplo, 60 unidades de 25 g se-

leccionadas de un lote de producto concreto pueden ser combinadas o mezcladas para obtener tres muestras de 500 g para el anlisis. Si se encuentra que estas tres muestras de 500 g dan resultados negativos, se deduce que el nivel de Salmonella no es mayor de 1 en 500 g. De modo similar, las muestras que presenten un menor grado de riesgo para el consumidor, como son las que requieren el anlisis de 30 muestras de 25 g, pueden ser mezcladas para el anlisis en un menor nmero de unidades. Para muestras de 25 g, podrn ser analizadas dos mezclas de muestras, cada una de 375 g. Si las dos fueran negativas, habra una probabilidad del 95% de que el nivel de contaminacin en el lote analizado no fuera mayor de una Salmonella en 250 g, lo que es la misma probabilidad que existira si cada una de las 30 muestras de 25 g hubiera sido analizada y encontrada negativa. Es evidente la importancia prctica de este procedimiento por mezcla que permite un control de calidad estadstico del riesgo o defecto de presencia de Salmonella con unos costos de anlisis que son econmicamente posibles.

AISLAMIENTO DE SALMONELAS (Metodo ICMSF). Esta parte incluye tres etapas fundamentales: (i) enriquecimiento no selectivo, (ii) enriquecimiento selectivo, (iii) siembra en placa en medios de agar selectivo. 3.2.7.1. Material y Aparatos 1. Homogeneizador mecnico que trabaje a 8.000 r.p.m. como mnimo y a 45.000 r.p.m. como mximo. 2. Vasos para el homogeneizador, de 1 litro de capacidad, con tapas, resistentes a la temperatura de pasterizacin, un recipiente por cada muestra de alimento a analizar. 3. Balanza con pesas, de al menos 2.500 g de capacidad y de 0,1 g de sensibilidad.

4. Instrumentos para la preparacin de las muestras: cuchillos, pinzas, tenedores, tijeras, cucharas, esptulas, todos ellos previamente esterilizados o pasterizados. 5. Estufa a 35-37C. 6. Bao con agua circulante, a 43 0,05C. 7. Recipientes con tapa, resistentes a la temperatura de pasterizacin, o esterilizacin, con capacidad suficiente para contener el volumen del medio de enriquecimiento que se utilice, incluyendo la muestra. 8. Pipetas bacteriolgicas de 1 ml. 9. Aguja y asa de inoculacin con alambre de nicrom o de platino-iridio. 10. Placas de Petri de vidrio de 100 x 15 mm, u otras equivalentes. 11. Caldo lactosado, sin distribuir. 12. Agua de peptona tamponada. 13. Leche descremada en polvo, con verde brillante, reconstituido. 14. Caldo lactosado con 1% de Tergitol 7. 15. Caldo selenito cistina, sin distribuir y en tubos con 10 ml. 16. Caldo tetrationato verde brillante, modificacin de Kauffmann, sin distribuir y en tubos con 10 ml, segn se precise. 17. Agar verde brillante, para placas. 18. Agar bismuto sulfito, para placas. 19. Medio elegido por el propio laboratorio, para placas. 20. Agua de peptona tamponada con 0,22% de Tergitol. 21. Agar triple azcar hierro (TSI) inclinado. 22. Agar lisina hierro inclinado (LIA).

3.2.7.2. Enriquecimiento previo de Salmonelas 1. Mzclese la muestra con 9 volmenes del medio de enriquecimiento escogido de la Tabla 8, en proporcin peso/volumen. Si la muestra no es soluble en el medio de enriquecimiento o si no se produce su rpida dispersin, mzclese

la muestra con volumen apropiado de medio y adase la muestra mezclada al volumen total del medio de enriquecimiento.1 2. Incbese el medio de enriquecimiento previo durante 18-24 horas a 35-37C. 3.2.7.3. Enriquecimiento selectivo de Salmonelas

1. Pipetear 1 ml del cultivo de preenriquecimiento en 10 ml de caldo selenito cistina. Incbese en un bao de agua a 43 0,05C durante 24 horas. 2. Pasar 1 ml del cultivo de preenriquecimiento a 10 ml de caldo tetrationato verde brillante. Incbese a 43 0,05C durante 24 horas.

Esterilcese el medio de preenriquecimiento en el autoclave; en el caso de que esto sea difcil, debido a que el volumen de lquido sea demasiado grande, pasteurcese en su propio recipiente. Simplemente es necesario destruir todas las bacterias no esporuladas, lo que ocurre a, o por encima de, 80C. Diversos tipos de recipientes de plstico, de bajo precio, pueden resistir este calentamiento. Utilcese el medio pasterizado el mismo da de su preparacin. Enfrese o tmplese el medio de preenriquecimiento a 35-37C, antes de proceder a inocularlo. Si la muestra contiene una alta concentracin de azcar o de sal, u otra sustancia inhibidora, ajstese cuidadosamente el volumen del medio de preenriquecimiento para promover el crecimiento de las salmonelas. De manera similar, si el pH de la muestra es tan alto o tan bajo que pueda perjudicar el crecimiento de las salmonelas en el medio de preenriquecimiento, ajstese el pH del medio por adicin de una solucin al 1% de cido sulfrico o de hidrxido potsico. El pH del medio inoculado debera ser de 6,6 a 7,0 antes de proceder a la incubacin.

3.2.7.4. Siembra en placa en medios de agar selectivo para Salmonelas 1. Pasar un asa de 5 mm de cada uno de los dos medios de enriquecimiento selectivo a la superficie de una placa de cada uno de los tres medios de agar selectivo sealados a continuacin y extender de tal manera que se obtengan colonias aisladas. 2. Incubar las placas de agar verde brillante durante 24 horas a 35-37C. Las colonias tpicas de Salmonella son incoloras, rosa o fucsia o traslcidas a opacas, con el medio que las rodea de color rosa a rojo. 3. Incubar las placas de agar sulfito de bismuto a 35-37C durante 48 horas. Las colonias tpicas de Salmonella en agar sulfito de bismuto aparecen marrones o grises a negro, a veces con un brillo metlico. El medio que rodea las colonias es, generalmente, marrn al principio, cambiando a negro segn transcurre el tiempo de incubacin. Algunas cepas producen colonias verdes, con el medio que las rodea muy poco o nada oscurecido. 4. Incubar e interpretar las placas del medio elegido por el laboratorio segn las indicaciones del fabricante.

3.2.7.5. Identificacin de Salmonelas En esta seccin se incluyen las tres etapas seguidas en la identificacin de cultivos sospechosos de pertenecer al gnero Salmonella: (1) comprobacin de las colonias sospechosas mediante pruebas bioqumicas determinativas, (2) identificacin serolgica de las cepas sospeehosas mediante el uso del antisuero polivalente O, del antisuero polivalente H, de los antisueros O especficos de grupo y de los antisueros H de Spicer-Edwards, (3) tipificacin por bacterifagos. La identificacin de una cepa como miembro del gnero Salmonella est dentro de la capacidad de cualquier laboratorio que posea los medios y antisueros de que se dispone en el comercio. Los laboratorios que realicen la deteccin rutinaria de salmonelas en alimentos, deben utilizar pruebas bioqumicas para explorar las cepas sospechosas y posteriormente someter dichas cepas a pruebas serolgicas para determinar si son efectivamente salmonelas. La identificacin definitiva de las

salmonelas, como pertenecientes a un determinado serotipo, requiere el envo de las cepas a un centro especializado en tipificacin. 3.2.7.6. Exploracin bioqumica para la identificacin de Salmonellas 3.2.7.6.1. Material y Aparatos 1. Asa de inoculacin, preferiblemente de alambre de platino-iridio o de nicrom. 2. Bao de agua termorregulado a 35-37C. 3. Colonias sospechosas de ser salmonelas en placas de agar verde brillante, agar sulfito de bismuto o el agar escogido por el propio laboratorio. 4. Agar lisina hierro inclinado en tubos con columnas de agar de 25-30 mm. 5. Agar triple azcar hierro, inclinado en tubos con columnas de agar de 25-30 mm. 3.2.7.6.2. Mtodos 1. Tomar con una aguja de inoculacin estril dos o ms colonias de cada tipo sospechoso, del agar verde brillante, del agar sulfito de bismuto y del medio elegido por el propio laboratorio y pasar a tubos de agar triple azcar hierro y de agar lisina hierro, inclinados. Inocular los medios mediante siembra en estra atrs y adelante en la superficie inclinada y, a continuacin, por picadura en la columna de agar. Inocular primero un medio y, sin flamear la aguja, inocular el segundo medio de la misma manera. 2. Incubar los tubos de ambos medios durante 24 horas a 35-37C. Los cultivos sospechosos de ser Salmonella muestran en agar triple azcar hierro las partes inclinadas alcalinas (color rojo) y las columnas de medio acidas (color amarillo), con o sin produccin de SH2 que da lugar al ennegrecimiento del agar. Los cultivos sospechosos de ser salmonelas presentan en agar lisina hierro una reaccin alcalina (color prpura) en todo el medio, con o sin produccin de SH2 (ennegrecimiento). La reaccin sospechosa en agar triple azcar hierro indica que el organismo fermenta la glucosa (columna amarilla) pero que no fermenta la lactosa ni la sacarosa (parte inclinada roja),

reacciones tpicas de las salmonelas. Sin embargo, algunas salmonelas pueden fermentar la sacarosa o la lactosa y producir acidez (color amarillo) tanto en la parte inclinada como en la columna de medio. Por contraste, la reaccin sospechosa en agar lisina hierro es resultado de la descarboxilacin de la lisina, producindose una reaccin alcalina (prpura) en la columna de medio. Los organismos que no son capaces de descarboxilar la lisina, pero que fermentan la glucosa, producirn una reaccin acida (amarilla) en la columna de medio. Los microorganismos que ni fermentan la glucosa ni descarboxilan la lisina, darn lugar a una parte inclinada y a una columna alcalina (prpura). Los organismos que presentan esta reaccin son, generalmente, aerobios estrictos del gnero

Pseudomonas. Estas cepas pueden no presentar crecimiento en la columna de medio en razn de su metabolismo aerbico. Tales cepas pueden ser exploradas ms ampliamente por medio de la prueba de la oxidasa. Las salmonelas fermentadoras de la lactosa y de la sacarosa darn reacciones tpicas sospechosas en agar lisina hierro, ya que este medio no contiene ni lactosa ni sacarosa. Los organismos del gnero Arizona pueden dar en agar triple azcar hierro reacciones sospechosas de ser salmonelas, debido a una fermentacin tarda de la lactosa. Estos organismos pueden dar reacciones sospechosas de ser salmonelas en agar lisina hierro ya que descarboxilan la lisina y fermentan la glucosa. La mayor importancia es el que ambos gneros, Arizona y Salmonela, fermentadores de la lactosa y/o de la sacarosa pueden dar reacciones tpicas de Salmonella en agar lisina hierro, incluso aunque las mismas cepas puedan no presentar aspecto de Salmonella en los cultivos de agar triple azcar hierro inclinado. Del mismo modo, determinadas cepas de Salmonella pueden no descarboxilar la lisina y, debido a esto, mostrar la columna de medio acida y la parte inclinada alcalina, en agar lisina hierro. Estos organismos presentan reacciones tpicas de Salmonella en agar triple azcar hierro.

3.2.7.7. Pruebas serolgicas para la identificacin de Salmonellas (P. R. Edwards y Ewing, 1972; AOAC, 1967) 3.2.7.7.1. Material y Aparatos 1. Portaobjetos de vidrio de 5 x 7,5 cm o placas de Petri de 100 x 15 mm. 2. Agujas y asas de inoculacin, preferiblemente de alambre de platino-iridio o de nicrom. 3. Pipetas de 0,2 ml de capacidad, con divisiones de 0,01 ml; de 1,0 ml de capacidad con divisiones de 0,01 ml; y de 5 ml y 10 ml con divisiones de 0,1 ml. 4. Tubos de ensayo para reacciones serolgicas de 75 x 10 mm o de 100 x 13 mm. 5. Bao de agua termorregulado a 50 1C. 6. Cultivos de las presuntas salmonelas o Atizona en tubos de agar triple azcar hierro y de agar lisina hierro inclinados. 7. Caldo H en tubos de 100 x 13 mm con 5 ml de volumen. 8. Cloruro sdico en solucin acuosa al 0,85%. 9. Solucin salina formulada al 0,6% (Solucin salina al 0,85% conteniendo 0,6 ml de formalina por cada 100 ml). 10. Antisueros Salmonella: (a) Antisuero Salmonella polivalente O (somtico) que contenga por los menos aglutininas para los siguientes antgenos O: 1-16,19, 22, 23, 24, 25 y Vi. (b) Antisueros Salmonella individuales O (somticos) para, al menos, cada uno de los grupos: A, B, C1, C2, D, E (E1, E2, E3, E4), F, G, H, I y Vi. (c) Antisuero Salmonella polivalente H (flagelar) que contenga, por lo menos, aglutininas para los siguientes antgenos H: a, b, c, d, eh, en, enx, fg, fgt, gm, gmq, gms, gp, gpu, gq, gst, gt, i, k, lv, lw, lz 13, lz28, mt, r, y, z, z4 z23, z4 z24, z4 z32, z6, z10, z29,1, 2 ; 1, 5; 1, 6; y 1, 7. (d) Antisueros Salmonella H (flagelares) de Spicer-Edwards consistentes en 7 antisueros mezclados que reaccionan del siguiente modo:

(i)

Antisuero Salmonella H de Spicer-Edwards 1, que reacciona con los antgenos a, b, e, d, eh, fg, fgt, gm, gms, gmt, gp, gpu, gq, gst, ms, mt, i.

(ii)

Antisuero Salmonella H de Spicer-Edwards 2, que reacciona con los antgenos: a, b, c, k, r, y, Z29.

(iii)

Antisuero Salmonella H de Spicer-Edwards 3, que reacciona con los antgenos: a, d, eh, k, z, z4 z23, z4 z24, z4 z32, z29.

(iv) Antisuero Salmonella H de Spicer-Edwards 4, que reacciona con los antgenos b, d, fg, fgt, gm, gms, gmt, gp, gpu, gq, gst, ms, mt, k, r, z, z 10. (v) Antisuero Salmonella H complejo e, n, que reacciona con los antgenos enx y enz15. (vi) Antisuero Salmonella H complejo L que reacciona con los antgenos lv, lw, lz13, lz28. (vii) Antisuero Salmonella H complejo 1, que reacciona con los antgenos 1,2; 1,5; 1,6; 1,7;z 6 . 3.2.7.7.2. Tcnica para la reaccin con el antisuero polivalente O (somtico), en placa o en porta 1. Diluir y ensayar primeramente los antisueros con cultivos testigo conocidos para garantizar la eficacia de la prueba cuando se realice con los cultivos problema. 2. Marcar con un lpiz de cera dos secciones de alrededor de 1 x 2 cm sobre la cara interna de una placa de Petri de vidrio o sobre un portaobjetos de 5 x 7,5 cm.. 3. Depositar una pequea cantidad (un asa) de un cultivo en agar nutritivo o en agar triple azcar hierro inclinado de 24-48 horas, directamente sobre una placa o portaobjetos en la parte superior de cada zona marcada. 4. Depositar una gota de una solucin de NaCl al 0,85% en la parte inferior de cada seccin marcada. Emulsionar el cultivo en la solucin salina con un asa

o aguja de inoculacin limpia y estril en una seccin y repetir lo mismo en la otra seccin. 5. Aadir-una gota de antisuero Salmonella polivalente O a una de las secciones de cultivo emulsionado y mezclar con un asa o aguja estril. 6. Balancear atrs y adelante un minuto las mezclas de ambas secciones y observar a continuacin sobre fondo oscuro. En caso de reaccin positiva, se produce una aglutinacin rpida e intensa. 7. Clasificar la reaccin del siguiente modo:

Positiva, cuando hay aglutinacin en la mezcla cultivo-solucin salina-suero y no en la mezcla cultivo-solucin salina. Negativa, cuando no hay aglutinacin en la mezcla cultivo-solucin salinasuero.2 Estos cultivos debern ensayarse tambin frente al antisuero polivalente H (flagelar) (III, a continuacin). No especfica, cuando ambas mezclas presentan aglutinacin. Este resultado requiere nuevos ensayos, tal como se describe en la obra Identification of Enterobacteriaceae de P. R. Edwards y Ewing (1972).
2

Los antisueros polivalentes O no contiene aglutininas para los antgenos de algunas Salmonelas. Debido a esto, se dan reacciones negativas con determinadas cepas como S. cerro grupo K (18); S. Minnesota grupo L (21); S. alachua, grupo O (35).

3.2.7.7.3. Tcnica para la reaccin con el antisuero polivalente (flagelar) 1. Diluir y ensayar primeramente los antisueros con cultivos conocidos testigo para comprobar la eficacia de los resultados obtenidos con los cultivos problema.

2. Aadir 5 ml de solucin salina formolada al 0,6% a 5 ml de un cultivo en caldo H de 24 horas del organismo en estudio. Aguardar una hora antes de su utilizacin. Este caldo formolado puede ser almacenado a 5-8C durante algunos das, en el caso de que sea necesario. 3. Depositar en un pequeo tubo serolgico (de 75 x 10 mm o de 100 x 13 mm) 0,02 ml del antisuero Salmonella polivalente flagelar adecuadamente diluido y aadir 1 ml del caldo de cultivo formolado (antgeno), del apartado 2. 4. Preparar un control sustituyendo el antisuero por solucin salina formolada, colocando 0,02 ml de solucin salina formolada en un tubo serolgico del mismo tamao que los utilizados en la prueba anterior (apartado 3) y aadiendo 1 ml del cultivo en caldo formolizado del apartado 2. 5. Incubar la mezcla antgeno-suero (punto 3 anterior) y la correspondiente mezcla antgeno-solucin salina (punto 4 anterior) a 50C durante una hora en un bao de agua. Observar los resultados preliminares a intervalos de 15 minutos y leer los resultados finales transcurrida la hora de incubacin. 6. Clasificar la reaccin del siguiente modo: (a) Positiva, cuando hay aglutinacin de la mezcla cultivo-solucin salina formolizada-suero (apartado 3) y no hay aglutinacin en la mezcla cultivosolucin salina formolizada (apartado 4). (b) Negativa, cuando no hay aglutinacin en la mezcla cultivo-solucin salina formolizada-suero.3 (c) No especfica, cuando ambas mezclas aglutinan. Este resultado requiere pruebas adicionales como las descritas en la obra Identification of Enterobacteriaceae de P. R. Edwards y Ewing (1972). 7. Los cultivos que son inmviles o los que dan resultado negativo cuando se ensayan de nuevo con el antisuero Salmonella polivalente H (flagelar) se clasifican segn los resultados de otras pruebas como se describe en la obra Identification of Enterobacteriaceae de Edwards y Ewing (1972).
3 El antisuero polivalente H no contiene aglutininas para los antgenos de algunas salmonelas. Adems pueden esperarse resultados negativos con ciertas cepas como S. simsbury, Z27; S. Wichita ,Z37; S. Chittagong, Z35 .

3.2.7.7.4. Tcnica para la reaccin con cada uno de los antisueros o de grupo Esta prueba se lleva a cabo para determinar el grupo O (somtico) al que pertenece el cultivo en estudio. 1. Diluir y ensayar previamente los antisueros con cultivos testigo conocidos, para garantizar los resultados con los cultivos problema. 2. Llevar a cabo con los cultivos la reaccin O de grupo como en el apartado II, pasos 2 a 6, utilizando todos y cada uno de los antisueros O de grupo (incluso el Vi), en vez del antisuero Salmonella polivalente O. 3. Los cultivos que dan resultados positivos con el suero Vi se suspenden en 1 ml de solucin salina fisiolgica para formar una suspensin densa, a continuacin se calientan en un bao de agua hirviendo durante 20 a 30 minutos y se dejan enfriar. Volver a ensayar la suspensin tratada por el calor utilizando los antisueros O de grupo: D, C1, y Vi. Los cultivos Vi positivos que reaccionan con el suero somtico del grupo D pertenecen probablemente a Salmonella typhi y los que lo hacen con el suero somtico del grupo C, a Salmonella paratyphi C. Los cultivos Vi positivos tratados por el calor que no dan reaccin positiva con ninguno de los sueros somticos de grupo, pero que continan reaccionando con el suero Vi, pertenecen probablemente al grupo Citrobacter y no son salmonelas. 4. Antese como pertenecientes a este grupo los cultivos que den reaccin positiva con alguno de los sueros O de grupo. Los cultivos que no reaccionan con ninguno de los antisueros O de grupo se anotan como negativos. (14)

IV. RESULTADOS De acuerdo al cronograma del proyecto de investigacin, durante todo este periodo se realizaron los Anlisis Microbiolgicos Mes de Enero: Resultado de Carrito N 01 ENSAYO Aerobios mesfilos Rcto. de mohos Rcto. de levaduras Bacillus cereus Salmonella Coliformes RESULTADO 10 UFC/g <10 UFC/g 10 UFC/g <100 UFC/g Ausencia/25g < 10 UFC /g Resultado de Carrito N 02 ENSAYO Aerobios mesfilos Rcto. de mohos Rcto. de levaduras Bacillus cereus Salmonella Coliformes RESULTADO 10 UFC/g <10 UFC/g 10 UFC/g <100 UFC/g Ausencia/25g 4 NMP/g Resultado Promedio PROMEDIO 10 UFC/g < 10 UFC/g 10 UFC/g <100 UFC/g Ausencia/25g 7 NMP/g

Mes de Febrero: Resultado de Carrito N 03 ENSAYO Aerobios mesfilos Rcto. de mohos Rcto. de levaduras Bacillus cereus Salmonella Coliformes RESULTADO 10 UFC/g <10 UFC/g 10 UFC/g <100 UFC/g Ausencia/25g 4 NMP/g Resultado de Carrito N 04 ENSAYO Aerobios mesfilos Rcto. de mohos Rcto. de levaduras Bacillus cereus Salmonella Coliformes RESULTADO 10 UFC/g <10 UFC/g 10 UFC/g <100 UFC/g Ausencia/25g 4 NMP/g Resultado Promedio PROMEDIO 10 UFC/g < 10 UFC/g 10 UFC/g <100 UFC/g Ausencia/25g 4 NMP/g

Mes de Marzo: Resultado de Carrito N 05 ENSAYO Aerobios mesfilos Rcto. mohos Rcto. de 10 UFC/g de RESULTADO 87 x 10 UFC/g 40 UFC/g Resultado de Carrito N 06 ENSAYO Aerobios mesfilos Rcto. mohos Rcto. de 10 UFC/g 10 UFC/g de RESULTADO 99 x 10 UFC/g 30 UFC/g 35 UFC/g Resultado Promedio PROMEDIO 93 x 10 UFC/g

levaduras Bacillus cereus Salmonella Coliformes Ausencia/25g <3 NMP/g <100 UFC/g

levaduras Bacillus cereus Salmonella Coliformes Ausencia/25g <3 NMP/g Ausencia/25g <3 NMP/g <100 UFC/g <100 UFC/g

Mes de Abril: Resultado de Carrito N 07 ENSAYO Aerobios mesfilos Rcto. mohos Rcto. de 30 UFC/g de <10 UFC/g RESULTADO 20 UFC/g Resultado de Carrito N 08 ENSAYO Aerobios mesfilos Rcto. mohos Rcto. de 30 UFC/g 30 UFC/g de <10 UFC/g <10 UFC/g RESULTADO 20 UFC/g Resultado Promedio PROMEDIO 20 UFC/g

levaduras Bacillus cereus Salmonella Coliformes Ausencia/25g 3 NMP/g <100 UFC/g

levaduras Bacillus cereus Salmonella Coliformes Ausencia/25g 3 NMP/g Ausencia/25g 3 NMP/g <100 UFC/g <100 UFC/g

Mes de Mayo: Resultado de Carrito N 09 ENSAYO Aerobios mesfilos Rcto. de mohos Rcto. de levaduras Bacillus cereus Salmonella Coliformes Ausencia/25g 7 NMP/g <100 UFC/g 30 UFC/g RESULTADO 40 x 10 UFC/g 20 UFC/g Resultado de Carrito N 10 ENSAYO Aerobios mesfilos Rcto. mohos Rcto. Bacillus cereus Salmonella Coliformes Ausencia/25g 7 NMP/g Ausencia/25g 7 NMP/g de 30 UFC/g <100 UFC/g 30 UFC/g <100 UFC/g levaduras de RESULTADO 40 x 10 UFC/g 20 UFC/g Resultado Promedio PROMEDIO 40 x 10 UFC/g 20 UFC/g

Mes de Junio: Resultado de Carrito N 11 ENSAYO Aerobios mesfilos Rcto. mohos Rcto. Bacillus cereus Salmonella Coliformes Ausencia/25g <3 NMP/g de <10 UFC/g <100 UFC/g levaduras de <10 UFC/g RESULTADO 60 UFC/g Resultado de Carrito N 12 ENSAYO Aerobios mesfilos Rcto. mohos Rcto. Bacillus cereus Salmonella Coliformes Ausencia/25g <3 NMP/g Ausencia/25g <3 NMP/g de <10 UFC/g <100 UFC/g <10 UFC/g <100 UFC/g levaduras de <10 UFC/g <10 UFC/g RESULTADO 90 UFC/g Resultado Promedio PROMEDIO 75 UFC/g

Mes de Julio: Resultado de Carrito N 013 ENSAYO Aerobios mesfilos Rcto. mohos Rcto. de 30 UFC/g de 10 UFC/g RESULTADO 50 UFC/g Resultado de Carrito N 14 ENSAYO Aerobios mesfilos Rcto. mohos Rcto. de 10 UFC/g 20 UFC/g de RESULTADO 38 x 10 UFC/g 30 UFC/g Resultado Promedio PROMEDIO 20 x 10 UFC/g 20 UFC/g

levaduras Bacillus cereus Salmonella Coliformes Ausencia/25g 3 NMP/g <100 UFC/g

levaduras Bacillus cereus Salmonella Coliformes Ausencia/25g 4 NMP/g Ausencia/25g 4 NMP/g <100 UFC/g <100 UFC/g

Mes de Agosto: Resultado de Carrito N 015 ENSAYO Aerobios mesfilos Rcto. mohos Rcto. de 20 UFC/g de RESULTADO 40 x 10 UFC/g 20 UFC/g Resultado de Carrito N 16 ENSAYO Aerobios mesfilos Rcto. mohos Rcto. de 40 UFC/g 30 UFC/g de RESULTADO 25 x 10 UFC/g 30 UFC/g 25 UFC/g Resultado Promedio PROMEDIO 33 x 10 UFC/g

levaduras Bacillus cereus Salmonella Coliformes Ausencia/25g 5 NMP/g <100 UFC/g

levaduras Bacillus cereus Salmonella Coliformes Ausencia/25g 3 NMP/g Ausencia/25g 4 NMP/g <100 UFC/g <100 UFC/g

Mes de Setiembre: Resultado de Carrito N 17 ENSAYO Aerobios mesfilos Rcto. de mohos Rcto. de levaduras Bacillus cereus Salmonella Coliformes Ausencia/25g 3 NMP/g <100 UFC/g 30 UFC/g 10 UFC/g RESULTADO 50 UFC/g Resultado de Carrito N 18 ENSAYO Aerobios mesfilos Rcto. mohos Rcto. de 10 UFC/g 20 UFC/g de RESULTADO 38 x 10 UFC/g 30 UFC/g Resultado Promedio PROMEDIO 22 x 10 UFC/g 20 UFC/g

levaduras Bacillus cereus Salmonella Coliformes Ausencia/25g 4 NMP/g Ausencia/25g 4 NMP/g <100 UFC/g <100 UFC/g

Mes de Octubre: Resultado de Carrito N 19 ENSAYO Aerobios mesfilos Rcto. de mohos Rcto. de levaduras Bacillus cereus Salmonella Ausencia/25g Coliformes <3 NMP/g <100 UFC/g <10 UFC/g <10 UFC/g RESULTADO 60 UFC/g Resultado de Carrito N 20 ENSAYO Aerobios mesfilos Rcto. mohos Rcto. de <10 UFC/g <10 UFC/g de <10 UFC/g <10 UFC/g RESULTADO 90 UFC/g Resultado Promedio PROMEDIO 75 UFC/g

levaduras Bacillus cereus Salmonella Coliformes Ausencia/25g <3 NMP/g Ausencia/25g <3 NMP/g <100 UFC/g <100 UFC/g

Mes de Noviembre: Resultado de Carrito N 19 ENSAYO Aerobios mesfilos Rcto. de mohos Rcto. de levaduras Bacillus cereus Salmonella Coliformes Ausencia/25g <3 NMP/g <100 UFC/g 20 UFC/g <10 UFC/g RESULTADO 80 UFC/g Resultado de Carrito N 20 ENSAYO Aerobios mesfilos Rcto. de mohos Rcto. de levaduras Bacillus cereus Salmonella Coliformes Ausencia/25g 4 NMP/g Ausencia/25g 4 NMP/g <100 UFC/g <100 UFC/g <10 UFC/g 10 UFC/g 40 UFC/g RESULTADO 14x10 UFC/g Resultado Promedio PROMEDIO 11 x 10 UFC/g 20 UFC/g

V. DISCUSION Los resultados respecto a la calidad Microbiolgica de las hojuelas de papa que se expenden en plena va pblica no presentan contaminacin microbiana, encontrndose por debajo de los limites mnimos permisibles que contempla la Norma Sanitaria que establece los criterios microbiolgicos de calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano (R.M. N 591 2008/MINSA) Protocolo para los anlisis microbiolgicos de Granos de Cereales, leguminosos, quenopodiceos y derivados (harinas y otros), segn DIGESA. Sin embargo durante encuestas a consumidores de este producto papas en hojuela, se quejaron de ciertas reacciones alrgicas o se haban indigestado, los casos no son constantes sino variables. Esta situacin constituye un factor de riesgo para la salud humanapor casos de toxiinfeccin alimentaria, ya que la falta de control y capacitacin de los expendedores en el manipuleo de estos productos debe ser ms continuo, obligar a que sus anaqueles de expendio en especial las superficies estn ms protegidos del aire y polvo del medio ambiente. Cabe destacar que la calidad microbiolgica de las hojuelas de papa que se expenden en la va publica no presentan contaminacin microbiana, pero la contaminacin se puede dar en los manipuladores de este tipo de producto alimenticio, coincidiendo con lo establecido por LARRAAGA, I.; CARBALLO, J. (1998.), quien demuestra que los puntos critico de control son manipuladores, superficies y forma de expendio; y estos no son controlados por las autoridades sanitarias y no se le da la importancia debida Por la manera como se expenden en plena va pblica, sera interesante realizar un estudio microbiolgico del aire donde se encuentran dichos carritos.

La contaminacin por el aire es importante tanto por razones higinicas y/o econmicas. La cantidad de microorganismos aadidos al alimento por sedimentacin de las partculas que presenta el aire es significante, ste puede elevar el nmero total de microbios en el alimento, ms si se usa para airear el producto. Antes de adquirir estos productos, verifique y asegrese de que los envases se encuentren bien cerrados y en perfectas condiciones. (9) Continuar apoyando pruebas de fritura con otras variedades de materia prima (camote, yuca).

VI. CONCLUSIONES En el presente trabajo realizado ninguna de las 22 muestras analizadas se detectaron microorganismos indicadores de alteracin, de higiene y patgenos que represente riesgo para la salud humana. Con relacin a los microorganismos indicadores de alteracin de alimentos como son los microorganismos Aerobios Mesofilos, Mohos y Levaduras los resultados de las 22 muestras analizadas muestran valores por debajo de m que es el lmite que separa la calidad aceptable de la rechazable; por consiguiente la contaminacin de las muestras con tales microorganismos es pequea. Con relacin a los microorganismos indicadores de higiene de alimentos como son los Coliformes, los resultados de las 22 muestras analizadas muestran valores por debajo de m que es el lmite que separa la calidad aceptable de la rechazable; por consiguiente la contaminacin de las muestras con Coliformes es mnima. Con relacin a los microorganismos patgenos que puedan contaminar los alimentos como es Bacillus cereus y la presencia de Salmonella; los resultados de las 22 muestras analizadas muestran valores para Bacillus cereus por debajo de m que es el lmite que separa la calidad aceptable de la rechazable; por

consiguiente la contaminacin de las muestras se encontraron exentas con este microorganismo. Con relacin a Salmonella los resultados obtenidos de las 22 muestras analizadas muestran ausencia para con este microorganismo. Finalmente las papas fritas en hojuela se consideran aptos para el consumo humano por que cumplen con la exigencias de los criterios microbiolgicos

establecidos en la Norma Tcnica Sanitaria (NTS N 071-MINSA/DIGESA-V-.01) para el grupo y subgrupo de alimentos al que pertenece.

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Adams, M.R Y Zaragoza 1997. Moss N.O.: Microbiologa de los alimentos. Editorial acriba S.A.

2. Aguilera J M 1997. Fritura de Alimentos. En: Aguilera JM (Editor). Temas en Tecnologa de Alimentos. Volumen 1. Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnologa para el Desarrollo (CITED). Instituto Politcnico Nacional, Mxico: 187-213. 3. lvarez, M. (2005). La Fritura de los Alimentos. http://www.monografias.com/trabajos31/frituraalimentos/frituraalimentos.shtml?mono search. 4. BANWART, George J. Microbiologa bsica de los alimentos Ediciones bellaterra S. A., Barcelona 1982. 5. Bello Gutirrez, Jos., 1998, Ciencia y tecnologa culinaria, Ediciones Daz de Santos, S.A., Juan Bravo, 3-A. 28006, MADRID- Espaa. Pp.: 107-129 6. CRUEGER W. A. 1989. Biotecnologa, 3 Edicin. Editorial Acribia S.A. Zaragoza 7. FAO 1992 Manual para el Control de Calidad de los Alimentos. 8. FRAZIER. W.C., Westhoff, D.C. 1993 Microbiologa de los Alimentos. 2 Ediccion, Editorial Acribia, Zaragoza. 9. HOBBS, ROBERTS, 1993 Higiene y Toxicologa de los Alimentos. 10. International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF), 2000 Microorganismos de los alimentos, Volumen 1 Editorial Acribia, Zaragoza. Espaa. 11. JAY. J.M. 1994. Microbiologa Moderna de los Alimentos. Edit. Acribia, S.A., 804p 12. LARRAAGA, I.; CARBALLO, J. 1998. Control e Higiene de los Alimentos, Editorial Mc. Graw Hill. Espaa, 1998. 33. 13. Norman G. Marriott, 2003, Principios de Higiene Alimentaria, Editorial Acribia S.A., Zaragoza, - 416 pginas 14. LABORATORIO PROFECO Papas fritas http://www.profeco.gob.mx/revista/pdf/est_08/56-63%20papas.pdf envasadas

15. (R.M. N 591 2008/MINSA ) Norma Sanitaria que establece los criterios microbiolgicos de calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano

VIII. APENDICE

Grafico N 01 Recuento de Aerobios mesfilos vs tiempo

Grafico N 02

Recuento de mohos vs tiempo

Grafico N 03

Numeracin de Coliformes vs tiempo

Grafico N 04

Recuento de Bacillus cereus vs tiempo

Grafico N 05

Ausencia y/o Presencia de Salmonella vs tiempo

FECHA Y FIRMA DEL RESPONSABLE DEL PROYECTO CALLAO, 20 de Marzo del 2012.

FIRMA DEL RESPONSABLE DEL PROYECTO DE INVESTIGACIN

----------------------------------------------------------------------------Blgo. Mblgo.: ARTURO MARIANO GARCA MERINO Profesor Investigador Cdigo UNAC: 1364

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

FACULTAD DE INGENIERIA PESQUERA Y DE ALIMENTOS

Bellavista, 20 de Marzo del 2012. SEOR DIRECTOR DEL INSTITUTO DE INVESTIGACIN DE LA F.I.P.A. Ing.: DOMINGO NIETO FREIRE. Presente. Asunto: LEVANTAMIENTO DE OBSERVACIONES
DE PROYECTO DE INVESTIGACION

De mi especial consideracin:

Tengo a bien dirigirme a usted para saludarlo cordialmente, a la vez hacerle llegar el informe final del Proyecto de Investigacin Titulado: Evaluacin de la calidad microbiolgica de los bocaditos fritos a base de Papa (Solanum tuberosum) que se elaboran y expenden en forma artesanal en la Urb. Ciudad del Pescador Distrito Bellavista Callao. Con el levantamiento de las respectivas observaciones. Aprobado con Resolucin de Decanato N 063-2010DFIPA Agradeciendo la atencin que le brinde al presente me despido reiterndole los sentimientos de mi especial consideracin y estima personal.

Atentamente.

____________________________________ Blgo.- Ing. : ARTURO GARCIA MERINO Responsable del Proyecto Cdigo: 001364
CC.: Arch.