Termodinmica y Cintica Qumica rea de Qumica Fsica

Prctica 5 ESTUDIO NUMRICO DE LA CINTICA DE UNA REACCIN ENZIMTICA

1. Objetivo Se emplear un programa informtico de clculo que permite obtener la variacin de las concentraciones de reactivos, intermedios y productos de una reaccin enzimtica con el tiempo. A partir de esos datos se obtendr la velocidad de reaccin, se verificar la ecuacin de Michaelis-Menten y se extraer la correspondiente constante de Michaelis. 2. Fundamento terico 2.1. Actividad enzimtica Los enzimas son protenas altamente especializadas que catalizan numerosas reacciones en los sistemas biolgicos. Una propiedad importante es su especificidad a la hora de reaccionar con sustratos, acelerando determinadas reacciones qumicas en disolucin. En general, un enzima proporciona el ambiente en que una reaccin determinada es, energticamente, ms favorable. El rasgo distintivo de una reaccin catalizada enzimticamente es que ocurre en un lugar especfico del enzima, el sitio activo. La molcula fijada en el sitio activo y sobre la que acta el enzima se denomina sustrato. El complejo enzima-sustrato formado es de vital importancia para definir el comportamiento cintico de las reacciones catalizadas. Una reaccin enzimtica sencilla puede formularse como sigue: E+S

k1 k-1

ES

k2

E+P

[1]

donde E, S y P representan enzima, sustrato y producto, respectivamente. ES y EP son complejos del enzima con el sustrato y con el producto. La funcin del catalizador es aumentar la velocidad de una reaccin reduciendo la energa de activacin de la misma, Ea. Los catalizadores no modifican los equilibrios de la reaccin ni se consumen durante el proceso.

2.2. Velocidad de reaccin. Mecanismo de Michaelis-Menten La velocidad de una reaccin cualquiera viene determinada por la concentracin de reactivo/s y por una constante de velocidad, k, y expresada por una ley de velocidad. Por ejemplo para una reaccin unimolecular o de primer orden, S P, la cantidad de S que ha reaccionado por unidad de tiempo viene dado por la siguiente expresin:

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V =

d [S ] d [P ] = = k [S ] dt dt

[2]

donde k, tiene unidades de s-1 y S de moll-1. As pues, la concentracin de sustrato, [S], afecta a la velocidad de una reaccin catalizada por un enzima. No obstante, el estudio del efecto de [S] en una reaccin enzimtica no es simple. Este tipo de comportamiento cintico es explicado por la teora de Michaelis y Menten, que postula que el enzima se combina con el sustrato en un paso reversible rpido, para dar el complejo ES, segn se muestra en la reaccin [4]. E + S

k1 k-1

ES E + P

k2

[4]

La reaccin de esta forma alcanza rpidamente un estado estacionario en el que [ES] permanece aproximadamente constante con el tiempo. El complejo ES se descompone seguidamente en un segundo paso ms lento que limita la velocidad de la reaccin global dando el enzima libre E y el producto de reaccin P. Por tanto la ley de velocidad para la reaccin global viene determinada por la etapa ms lenta, segn indica la ecuacin [5]:

V = k 2 [ES ]

[5]

donde V se determina por la descomposicin de ES. Bajo las condiciones de estado estacionario ([ES]=cte) la velocidad del proceso se mantiene constante en los primeros estadios de la reaccin y coincide con la velocidad inicial, Vo. Experimentalmente Vo puede determinarse calculando la pendiente de la representacin de [P] frente al tiempo (ecuacin [2]). Adems, a medida que la concentracin inicial de S aumenta, desplazando el equilibrio hacia la formacin de ES, tambin lo hace Vo hasta alcanzar un valor constante. Este valor final se denomina velocidad mxima, Vmax. Esto se observar cuando prcticamente todo el enzima est formando complejo ES y la concentracin de E libre sea extremadamente pequea ([ES]=[Et], donde Et es la concentracin total de enzima utilizada). En estas condiciones, el enzima est saturado por el sustrato, de forma que un aumento adicional en la [S] ya no tiene efecto sobre la velocidad inicial del proceso. De esta manera, se puede definir que Vmax = k2[Et], la cual vara de un enzima a otro, y donde k2 se define de manera general como kcat, una constante de velocidad de primer orden que se denomina nmero de recambio. Utilizando la aproximacin del estado estacionario, se obtiene la Ecuacin de Michaelis-Menten:

Vo =
donde

Vmax [ S ] Km + [S ]

[6]

Km =

k 1 + k 2 k1

[7]

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es la constante de Michaelis. Esta constante depende de las velocidades relativas de las dos etapas en las que se divide el mecanismo de Michaelis-Mente. Valores pequeos de Km implican que el complejo enzima-sustrato es muy estable y no se disocia fcilmente para formar el producto final. La recoleccin de datos de velocidades iniciales frente a concentraciones variables de substrato permite extraer la velocidad mxima y la constante de Michaelis. Tradicionalmente esto se hace mediante una grfica de Lineweaver-Burk, en el que se representan los inversos de las velocidades iniciales frente al inverso de la concentracin de sustrato. Sin embargo, resulta ms preciso utilizar una grfica de EadieHofstee. Este anlisis est basado en la siguiente ecuacin1:

V0 = K m

V0 +V [S ] max

[7]

De esta forma, representando las velocidades iniciales frente al cociente de esas mismas velocidades obtiene una lnea recta cuya pendiente es la constante de Michaelis cambiada de signo. Los parmetros cinticos kcat y Km son tiles para el estudio y comparacin de los diversos enzimas a travs de su eficiencia cataltica. La eficiencia cataltica se define como la relacin entre ambos (kcat/Km). 3. Procedimiento de clculo Para resolver la cintica de la reaccin enzimtica [1] y mecanismos afines, se emplear el programa Kintecus2. Este programa realiza una integracin numrica de las ecuaciones de velocidad a partir de un determinado mecanismo de reaccin. A partir de una serie de datos de entrada (concentraciones iniciales, constantes de velocidad, temperatura) obtiene las concentraciones de todas las especies involucradas en funcin del tiempo. 3.1. Ejecucin del programa Kintecus Sigue los siguientes pasos (debes tener un ordenador en Windows con el programa Excel en condiciones de funcionamiento) 1) Descrgate de la pgina web de la asignatura el fichero comprimido ENZIMA.zip. Descomprmelo en una carpeta abierta al efecto. Comprueba que tienes dos ficheros: Kintecus.exe y CineticaEnzimatica.xls 2) Comprueba en la configuracin regional de tu ordenador (Panel de control) que est seleccionado el punto como separador de decimales y la coma como separador de miles. 3) Abre el fichero de Excell CineticaEnzimatica.xls. Si pregunta por habilitar macros? contestar SI. Si no permite habilitar los macros por cuestiones de seguridad ve en el men de Excell a Herramientas Macros y selecciona el nivel bajo de Seguridad. 4) Una vez est el fichero CineticaEnzimatica.xls abierto y con los macros habilitados dispones ya del banco de trabajo donde realizar tus clculos. El fichero de Excell consta de las siguientes hojas de clculo (comprueba en lneas generales lo que hay en ellas): Una hoja o pgina de CONTROL desde donde se controla el programa y que es la primera que aparece.

Para obtener esta ecuacin a partir de la frmula de Michaelis-Menten [6], invirtela y multiplica por Vmax. Reordenando y despejando V0 llegas a [7] 2 Consulta la pgina www.kintecus.com Prcticas de Termodinmica y Cintica-2 curso Licenciatura de Biotecnologa

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Una hoja MODEL en el que se especifican todas las reacciones del mecanismo de tu reaccin, incluyendo las constantes de velocidad. Una hoja SPECIES en el que se especifican las concentraciones iniciales de las especies qumicas involucradas Una hoja PARM en el que se especifican parmetros numricos del clculo tales como el tiempo total del clculo y el paso de tiempo. Una hoja HELP con instrucciones de ayuda.

5) Ve a la hoja CONTROL e introduce en la casilla correspondiente (Kintecus PATH) la direccin completa de la carpeta en la que te encuentras en tu ordenador (por ejemplo: C:\Documents and Settings\Administrador\Escritorio\Practica) 6) Ve a la hoja PARM y selecciona las unidades de concentracin en Moles/litro y el tiempo total de simulacin. 7) Ve a la hoja SPECIES y fija las concentraciones iniciales de todas las especies. 8) Ve a la hoja de CONTROL y presiona el botn RUN. Se abrir entonces una pantalla de windows. Teclea entonces la tecla ENTER tres veces. El clculo se ejecutar en unos pocos segundos. Si la ejecucin ha sido exitosa, en la carpeta se habrn creado una serie de ficheros de los cuales el ms importante es uno llamado CONC.TXT. Comprueba que este fichero se ha creado. 9) Para representar los resultados presiona en la hoja de control la tecla PLOT RESULTS. Se crearn entonces dos nuevas hojas: una hoja denominada CONC en el que estn escritas todas las concentraciones en funcin del tiempo y una hoja denominada CONCENTRATIONS en el que se representan grficamente dichas concentraciones. 3.2. Ejecucin del programa para un ejemplo de referencia. Con la ayuda del profesor ejecuta el programa para los siguientes datos3 (ejemplo sin inhibidor) Mecanismo de reaccin: (E= enzima, S= substrato, I=inhibidor, P=producto) Reaccin Constantes de Velocidad Constantes de Equilibrio* E+S==>ES 5.00E+06 75 ES ==> E+S 66666.66667 E+I==>EI 8.50E+06 1000 EI==>E+I ES+I==>EIS 9.57E+06 1000 EIS==>ES+I EI+S==>EIS 5.53E+07 1000 EIS==>EI+S EI+P==>EIS 7.13E+06 1000 EIS==>EI+P ES==>E+P 1.14E+05 *Las constantes de equilibrio fijan la constante de velocidad de la reaccin inversa (Keq = KD/KI)

Muchos de esos datos pueden aparecer ya por defecto en el fichero Excel que has descargado al inicio de la prctica. En ese caso no modifiques nada. Prcticas de Termodinmica y Cintica-2 curso Licenciatura de Biotecnologa

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Concentraciones iniciales(moles/litro): E S ES 4 10-9 0.01 0 EI e I EIS P 0 0 0

Tiempo total de simulacin: 30 minutos

Representa los resultados de las concentraciones y observa qu ocurre con cada una de las especies. Cmo evoluciona la concentracin de sustrato y producto? Qu le pasa a la concentracin de enzima y a la del complejo enzima-sustrato? Es vlida la aproximacin de estado estacionario en la cual se sustenta la ecuacin de Michaelis-Menten? 3.3. Verificacin del mecanismo de Michaelis-Menten y extraccin de la constante y de la velocidad mxima. Repite el ejemplo del punto 3.2 para las siguientes concentraciones de sustrato: 0.01M (ya la tienes), 0.02M, 0.05M, 0.1M, 0.15M, 0.2M, 0.5M, 1.0M, 1.5M y 2.0 M. Anota las velocidades iniciales de formacin de producto a partir de las pendientes iniciales de las correspondiente concentracin de producto en funcin del tiempo. Representa la velocidad inicial en funcin de la concentracin de sustrato. Qu observas? Elabora la correspondiente grfica de Eadie-Hofstee, haz un ajuste lineal y extrae la constante de Michaelis, la velocidad mxima y el coeficiente de correlacin. 3.4. Anlisis del efecto de un inhibidor Repite los clculos del punto 3.3 pero para una concentracin inicial de inhibidor de 4 10-4 M. Representa conjuntamente los datos de velocidad sin y con inhibidor frente a la concentracin de substrato. Qu observas?. Elabora la grfica de Eadie-Hofstee para el caso con inhibidor y extrae de nuevo la velocidad mxima y la constante de Michaelis. Representa conjuntamente los datos sin y con inhibidor y comenta los resultados. 3.4. Anlisis del metabolismo del etanol en el hgado humano El etanol se metaboliza en el hgado a travs de la enzima alcohol deshidrogenasa heptica (NADP+). Conforme a la base de datos BRENDA4, una enzima similar humana (con el etanol como sustrato) tiene una constante de Michaelis de 0.45 mM y un nmero de recambio de 30.7 s-1. Asumiendo la misma concentracin de enzima que la que has tenido en cuenta hasta el momento, e ignorando el efecto de inhibidores, realiza simulaciones con Kintecus para estudiar este proceso. Elabora una grfica en la que se muestre la destruccin de alcohol con el tiempo en el hgado. Estima cual sera el tiempo de duracin de una resaca si suponemos que ste es el tiempo necesario para que la concentracin de alcohol se reduzca a un 10% de su valor inicial. Extiende el tiempo de simulacin si es necesario. Considera tambin otros valores alternativos de las constantes cinticas tambin asumibles en este caso a partir de la base de datos BRENDA.

http://www.brenda.uni-koeln.de Prcticas de Termodinmica y Cintica-2 curso Licenciatura de Biotecnologa