Resumo do seminrio

Improving lipase production from Candida rugosa by a bichemical engeneering approach

Fundamentos da Engenharia Bioqumica

Alunos: Natlia Azeredo Victor Antunes

1 Introduo
sabido que as lipases tm grande importncia na produo industrial de vrios produtos. E as lipases produzidas a partir de microorganismos so bastante usadas na produo de frmacos, compostos agroqumicos e biodiesel. Os gneros mais comuns de microorganismos que produzem lipases so:

Pseudomonas, Mucor, Geotrichum, Rhizopus e Candida spp. A espcie mais utilizada

industrialmente a Candida rugosa. Apesar de ser a mais usada, no se tem muita informao na literatura de como essa espcie produz a enzima de interesse. No entanto, uma caracterstica comum na produo de lipase o uso de uma substncia lipdica ou similar (triglicerdeos, cidos graxos, detergentes...). Esta substancia pode ser empregada individual ou conjuntamente com acares, como fonte de carbono e indutor da produo em condies aerbicas. No entanto, o verdadeiro papel do indutor no claramente compreendido. A presena de substancias insolvel poderia explicar o aumento da produo, mas o efeito dos cidos graxos como indutores no poderia entrar nessa hiptese. Assim, a produo da lipase pode ser ativada por outros mecanismos diferentes para o seu prprio desempenho cataltico, por exemplo, reconhecimento de reas interfacial no caldo de cultura. Independemente do mecanismo, por causa da insolubilidade do substrato em gua, o monitoramente de parmetros importantes para o bioprocesso fica debilitado devido a natureza tetrafsica do mosto. A C. rugosa tem um cdigo gentico no universal e por causa disso, nenhuma enzima ativa foi obtida at agora expressando os genes da lipase desse microorganismo em outros micrbios padres como S. cerevisiae. A utilizao de lipases vem se intensificando nos ltimos anos, devido versatilidade dessas enzimas. Esta caracterstica vem do fato de que as lipases so capazes de catalisar inmeras reaes, no apenas a hidrlise de triacilgliceris, mas tambm reaes de sntese reversa (esterificao, transesterificao e

interesterificao), gerando assim uma gama muito grande de aplicaes em diversos setores industriais. Na indstria de alimentos, por exemplo, a lipase utilizada

principalmente para a produo de cidos graxos, responsveis pelo desenvolvimento do aroma e sabor, principalmente em queijos, e na modificao de lipdeos, aumentando seu valor comercial e nutritivo.

As lipases tm aplicaes promissoras na indstria de detergentes, removendo resduos gordurosos ou at mesmo na sntese de biosurfactantes, substituindo parcial ou totalmente os surfactantes, que causam grandes danos ao meio ambiente. Uma das aplicaes mais antigas das lipases na indstria farmacutica, que foi um dos setores que mais beneficiou o avano dos estudos da utilizao de lipases. A capacidade dessa enzima de catalisar reaes de sntese ou hidrlise de steres, gerando produtos em excesso enanciomrico, pode ser til na sntese de compostos opticamente ativos de interesse farmacutico. Uma promissora aplicao das lipases reside na produo de Biodiesel. O Biodiesel (steres metlicos de cidos graxos) um combustvel biodegradvel, notxico, de combusto limpa, produzido a partir de fontes renovveis e, portanto, tem se tornado cada vez mais importante devido reduo das reservas de petrleo e a poluio causada por combustveis fsseis . A utilizao de lipase como catalisador para a produo de biodiesel vantajosa, principalmente, do ponto de vista ambiental e em relao s condies operacionais em comparao com os catalisadores qumicos (cidos e bsicos). No entanto, o alto custo das lipases e os efeitos negativos para a enzima, de reagentes (metanol) e produtos (glicerol) da reao de transesterificao ainda mantm essa tecnologia desvantajosa economicamente. Novas tecnologias vm sendo

desenvolvidas para contornar tais empecilhos. Esta enzima tambm encontra aplicaes em vrios outros setores industriais, como cosmticos e oleoqumica. At mesmo no tratamento de efluentes a atividade lipoltica tem sido aplicada com sucesso. Dada a importncia das lipases, mais de 1000 artigos que enfocam assuntos relacionados a esta enzima so produzidos a cada ano e atualmente, a literatura ainda reporta muitos estudos direcionados para a

alterao do meio de produo de modo a otimizar a obteno e a excreo de lipases. Antes de focalizar a ateno para investigaes como estas, o prximo item ir abordar as caractersticas das lipases para, posteriormente, serem detalhados os parmetros que influenciam a produo desta enzima. As lipases podem ser encontradas em animais (pncreas, plasma de sangue, saliva, suco pancretico), no leite, em vegetais (soja, amendoim, etc.), bactrias e fungo. Nos eucariotas, as lipases esto envolvidas em vrios estgios do

metabolismo lipdico, incluindo a digesto de gorduras, o metabolismo de lipoprotenas, absoro e reconstituio. Nas plantas, as lipases so encontradas nos tecidos de reserva de gordura. Das fontes produtoras de lipases, as microbianas so as de maior interesse industrial por vrios motivos, entre eles, a grande variedade de microrganismos produtores. Existem inclusive algumas lipases de origem microbiana que j so disponveis comercialmente, como a lipase de Candida rugosa. Adicionalmente, os microrganismos destacam-se por no serem sujeitos a efeitos sazonais, por possurem pequeno tempo de gerao, por serem de fcil manipulao gentica e ainda por produzirem, na maioria dos casos, lipases extracelulares, de fcil obteno. Os microrganismos produtores de lipases tm sido encontrados em diversos habitats, como em resduos industriais, em fbricas que processam leos vegetais, em indstrias de laticnios, em solos contaminados com leo, em sementes que produzem leo, em pilhas de compostagem, em alimentos em deteriorao, entre outros. Entre os microrganismos produtores esto as bactrias, os fungos filamentosos, as leveduras e os actinomicetos. Entre os microrganismos, as leveduras apresentam uma srie de vantagens frente s outras fontes microbianas, como, por exemplo, menor tempo de gerao do que os fungos filamentosos e melhor adaptao a longos tempos de processo. Alm disso, so geneticamente mais estveis do que as bactrias e possuem GRAS status, o que permite que os produtos obtidos por estes microrganismos sejam mais aceitos nos setores alimentcios e farmacuticos.

2 Regime batelada
Estudos com C. rugosa foram feitos utilizando diversos substratos como fonte de carbono. Viu-se que cidos graxos livres, como o cido olico e azeite, eram bons indutores de produo de lipase. Comparando os custos e a produtividade de ambos, sob um ponto de vista de desenvolvimento, o cido olico teve melhor desempenho e seria um substrato mais indicado que o azeite. Foi visto tambm que produo de lipase aumenta com o aumento da cadeia do cido graxo. Em adio, estudos com diferentes cidos graxos de cadeia-curta e solveis em gua, como o cido caprlico (oito carbonos) e o cido cprico (dez carbonos), mostraram que apesar de serem melhores indutores de produo de lipase, com concentraes acima de 1g/L esses se tornam txicos para o microorganismo em questo. Sendo assim, o cido olico foi considerado o mais recomendado para ser o substrato dos experimentos. Vrios experimentos foram feitos em diferentes concentraes de cido olico para ver qual teria o melhor desempenho em induzir a produo de lipase. O grfico abaixo mostra uma fermentao feita com a concentrao de substrato inicial de 8 g/L, a taxa especfica de crescimento foi de 0,15 h-1 e YX/S=0,85 g/g.

O padro de produo de lipase extracelular se mostra parcialmente associado ao crescimento, visto pelo grfico. Nos estudos realizados viu-se que a melhor concentrao inicial de cido olico foi de 2 g/L, obtendo assim, boas taxas de produo. Foi observado tambm que um mnimo de substrato tem que ser consumido para que possa ocorrer o incio da sntese de lipase. A produtividade especfica decaiu para altas concentraes iniciais de substrato, mostrando uma inibio da clula. Pelo grfico tambm se pode observar uma atividade mxima de lipase intracelular na fase exponencial de crescimento. A sntese de lipase para no incio da fase estacionria e as enzimas remanescentes no citosol no so excretadas, provavelmente pela condio limitada de energia. Um fenmeno de adsoro relativo concentrao de lipase entre a fase aquosa e a fase orgnica foi observado. sabido que essa enzima tem uma afinidade grande por essa interface. Quando as condies de funcionamento e composio do meio so fixas, o percentual de lipase adsorvida, em uma maneira mais simples, pode ser considerado apenas dependente da concentrao do substrato. A lei de adsoro de Langmuir mostrou-se a mais confivel na descrio do processo de adsoro descrito. A lipase produzida pela C. rugosa apresentou boa estabilidade fsica na presena de foras de superfcie, tenses de cisalhamento e outras condies de operao. Como a concentrao de protenas extracelulares totais foi baixa (por volta de 100 mg/ml) e quase no se detectou proteases, podendo considerar quase nulo, o processo de extrao e purificao da lipase foi fcil e barato.

3 Regime Contnuo
Foi observada a formao de uma emulso entre uria e cido olico. Devido a essa emulso as clulas sofreram uma privao de nitrognio, no conseguindo

assimilar o mesmo e subsequentemente tendo um decrscimo na sntese de protenas, sendo suspensa a sntese de lipase. A soluo para este problema foi a mudana de uria para sulfato de amnio como fonte de nitrognio. A emulso foi desfeita e a sntese de lipase voltou ao normal. Nas culturas em batelada, essa mudana de uria para sulfato de amnio no resultou em nada.

Os testes em regime contnuo foram feitos com uma concentrao de substrato inicial de 2 g/L. Observou-se que a produtividade em contnuo foi ligeiramente maior do que em batelada. Pela figura acima, possvel observar que com baixas taxas de diluio a biomassa tem uma alta concentrao e a atividade lipoltica aquosa, isto , extracelular alta. medida que a taxa de diluio aumenta, a concentrao de clulas ca assim como a atividade lipoltica extracelular, enquanto que a atividade lipoltica intracelular que estava baixa aumenta. Isso pode ser explicado pela limitao de excreo da clula a altas taxas de diluio e crescimento especfico. A partir das informaes dos regimes em batelada e contnuo foi possvel desenvolver um modelo matemtico que previa corretamente o comportamento do processo. De acordo com este modelo, o crescimento celular modulado pela concentrao intracelular de substrato, descrito pela equao de Monod. O cido olico transportado para a clula onde consumido, transformado e estocado. A produo de lipase considerada induzida pelo cido olico extracelular, mas tambm

relacionada com a taxa substrato/biomassa. Mostrando assim que um mnimo de substrato deve ser consumido para que a sntese de lipase prossiga. A excreo descrita como um transporte ativo por saturao, limitado quando a taxa de crescimento especfico aumenta, consumindo uma quantidade negligencivel, porm necessria, de substrato acumulado no interior da clula.

4 Regime Batelada alimentada

A batelada alimentada trata-se de um mtodo mais produtivo que, diferentemente da batelada simples (descontinua) expe os microorganismos a menores riscos de se tornarem inativas que no processo de batelada simples. uma operao que est se tornando uma atrativa escolha em processos biotecnolgicos, devido sua simplicidade operacional, confiabilidade e flexibilidade para aplicao. Neste tipo de regime faz-se uso de quatro estratgias operacionais, que so: taxa de alimentao constante, controle de taxa especfica de crescimento, concentrao do substrato e controle de coeficiente respiratrio. Apesar das vantagens, alguns dos processos de produo de lipase ainda so realizados em batelada simples, onde as condies de operao so pouco otimizadas, enquanto que processos em batelada alimentada so pouco usados. Por exemplo, estudos mostram que a produo em batelada alimentada de lipases de Pseudomonas

fluorescens, usando alimentao simultnea de azeite e ion Fe2+ permitiu a obteno

de elevados nveis de atividade enzimtica e a produo de lipase Pseudomonas aeruginosa tambm foi aprimorada 6,6 vezes pelo desenvolvimento de uma fermentao em batelada alimentada. Dentre as quatro estratgias operacionais, duas foram estudadas com maior detalhamento. A primeira delas foi a taxa de alimentao constante de substrato. Descobriu-se que a atividade aquosa mxima lipoltica (extracelular) foi alcanado com baixa taxa de alimentao de substrato, enquanto a lipase tende a se acumular dentro da clula a taxas mais elevadas de adio de substrato. Estes resultados

sugerem que uma operao em batelada alimentada a taxa de alimentao constante no substancialmente afetam a sntese total da enzima, mas a sua excreo para o meio. A outra estratgia operacional foi o controle da taxa especfica de crescimento. Descobriu-se que baixas taxas de crescimento especfico alcanaram nveis mais elevados de atividade lipolitica aquosa e em altas taxas de crescimento especfico a enzima permaneceu acumulada dentro da clula, como tinha sido observado na estratgia de uma constante alimentao em batelada alimentada. Com isso, a produo da lipase por Candida rugosa foi reforada 10 vezes em comparao com a operao do em batelada.

5 Concluso
A produtividade mxima de enzimas foi alcanada no regime contnuo uma taxa de diluio moderada de 0,09 h-1 e concentrao inicial de substrato de 8 g/L. Viu-se tambm que a batelada alimentada permite alcanar taxas mais altas de atividade de lipase em comparao com outros regimes. A produo total de lipase teve o mesmo mximo em todos os regimes, sendo esse de 45 U/mL. E o fator de rendimento produto/substrato foi mximo quando os experimentos foram conduzidos a baixa e constante taxa de crescimento especfico.

6 Bibliografia
Gordillo, M.A., Montesinos, J.L., Casas, C., Valero, F., Lafuente, J., Sol, C., 1998. Improving lipase production from Candida rugosa by a bichemical engeneering approach. Chemistry and Physics of Lipids, 93, 131-142. Amarala, P.F.F., 2007. Produo de lpase de Yarrowia lipolytica em biorretor multifsico. Tese de doutorado.