ENFERMAGEM E NUTRIO -

ROTEIRO AULA PRTICA

ACADMICO(A): __________________________________________ MATRCULA:________________ TURMA: _______________ DISCIPLINA: BIOQUMICA PROFESSORES: Fabiano Souza e Guilherme Nascimento

AULA PRTICA CURVA PADRO DE GLICOSE

Determinao de acares redutores totais (MILLER, 1959)

Princpio: As aldoses e cetoses com hidroxilas heterocclicas livres so capazes de reduzir solues alcalinas de determinados compostos como por exemplo 3,5 dinitro saliclico a 3-amino 5-nitro salicilato e cido aldnico (figura 8), conferindo colorao amarela, cuja intensidade de cor aumenta

proporcionalmente ao aumento da concentrao de acares.

Acar redutor cido 3,5-dinitrossaliclico cido 3-amino-,5-nitrossaliclico

cido aldnico

Esquema da reao de oxido-reduo de acares redutores e DNS.

Compoentes/caractersticas: Sal Rochelle: No permite ao reagente dissolver O2; estabiliza a cor. Fenol: Aumenta a intensidade da cor (sensibilidade) Bissulfito: Estabiliza a cor obtida na presena de fenol.

NaOH: O poder redutor dos acares s atua em meio alcalino

Preparo da soluo: O reagente de DNS ser preparado seguindo-se as concentraes apresentadas na tabela 1. O cido 3,5-dinitrosaliclico e o NaOH sero previamente dissolvidos, posteriormente o sal e, soluo originada, ser adicionada os demais componentes.

Tabela 1. Composio do reagente de DNS Componentes cido 3,5-dinitrosaliclico NaOH Sal de Rochele (tartarato duplo de sdio e potssio) Fenol Metabissulfito de sdio gua destilada Quantidade 10,6 g 19,8 g 306,0 g 7,6 mL 8,3 g 1416 mL

Procedimento: Preparar curva padro com soluo de glicose 2g/L em concentraes entre 0,1 e 1,4 g/L como indicado na tabela 2. Em microtubo Eppendorf (ou tubos de ensaio) adicionar 100 L de amostra ou padro, 300 L de DNS e aquecer em banho-maria a 100C por 5 minutos. Resfriar e adicionar 1,5 mL de gua, homogeneizar e ler em espectrofotmetro a 540 nm. Fazer um branco nas mesmas condies, substituindo a amostra por gua destilada.

Tabela 2. Proporo de solues para construo de curva de calibrao com glicose Concentrao (g/L) 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,4 0,20 0,10 Volume de sln.2 g/L L 70 60 50 40 30 20 10 5 Volume de gua L 30 40 50 60 70 80 90 95

Observao: realizar cada medida por triplicata

Determinao de Glicose por mtodos enzimticos Glicose Oxidase Princpio:

A glicose determinada aps oxidao enzimtica na presena de glicose oxidase (GOD). O perxido de hidrognio formado reage sob catlise de peroxidase (POD) com fenol e 4-aminofenazona originando a quinoneimina que um cromgeno vermelho-violeta.

Reaes:
GOD

Glicose + O2 + H2O

cido glucnico + H2O2

POD

2 H2O2 + 4-aminofenazona + Fenol

Quinoneimina + 4H2O

Procedimento:

Preparar curva padro com soluo de glicose 2g/L em concentraes entre 0,1 e 1,4 g/L como indicado na tabela 2. Em microtubo Eppendorf (ou tubos de ensaio) adicionar 100 L de amostra ou padro, 1000 mL de G.O.D e aquecer em banho-maria a 37C por 5 minutos. Resfriar e adicionar 900 L de gua, homogeneizar e ler em espectrofotmetro a 510 nm. Fazer um branco nas mesmas condies, substituindo a amostra por gua destilada.

ESTUDO DIRIGIDO

1. Pesquisar outras metodologias para quantificao de acares. 2. Ler o artigo Comparao de Mtodos para Determinao de Acares Redutores e Totais em Mel, disponvel no link: http://www.scielo.br/pdf/cta/v23n3/18834.pdf 3. Quais as possveis fontes de erro nas metodologias do artigo em questo? a. Qual a finalidade e o fundamento da tcnica

espectrofotomtrica? b. O que significa a linearidade dos mtodos colorimtricos e como ela determinada? c. Que critrio deve ser usado para selecionar determinado comprimento de onda para uma tcnica colorimtrica? d. Qual o contedo e a finalidade do tubo branco?