UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUMBES

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

ESCUELA ACADEMICO - PROFESIONAL DE INGENIERA FORESTAL Y MEDIO AMBIENTE

ANTEPROYECTO DE TESIS
MICROPROPAGACION DE CATTLEYA MAXIMA POR CULTIVO DE PROTOPLASTOS

Para Optar el Titulo Profesional de

Ingeniero Forestal y Medio ambiente

Ejecutores: Bach. Estuardo Alexander Celi Izquierdo Bach. John Henrry Rimaycuna Ramrez

Asesor:

Tumbes 2011

MICROPROPAGACION DE CATTLEYA MAXIMA POR CULTIVO DE PROTOPLASTOS PROYECTO DE TESIS

PRESENTADA A LA ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE INGENIERA FORESTAL Y MEDIO AMBIENTE DE LA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUMBES PARA OPTAR EL TITULO PROFESIONAL DE INGENIERO FORESTAL Y MEDIO AMBIENTE

___________________________________________ Bach. Estuardo Alexander Celi Izquierdo Ejecutor

___________________________________________ Bach. John Henrry Rimaycuna Ramrez Ejecutor

___________________________________________

Ing. Luis Bermejo Requena

Asesor

Tumbes - 2011 2

1.

Titulo de Proyecto: MICROPROPAGACION DE CATTLEYA MAXIMA POR CULTIVO DE PROTOPLASTOS

2.

Facultad: Ciencias Agrarias Escuela: Ingeniera Forestal y Medio Ambiente Personal Investigador 2.1. Autores : Bach. Estuardo Alexander Celi Izquierdo Bach. John Henrry Rimaycuna Ramrez 2.2. Asesor Nombre Dpto. Acadmico Categora : : :

3.

4. Tipo de Investigacin 4.1. De acuerdo al objetivo que persigue: - Bsica 4.2. De acuerdo a la tcnica de contrastacin que utiliza: - Descriptiva 5. Lugar de Ejecucin del proyecto 5.1. Departamento : Tumbes Provincia 5.2. Lugar 6. Duracin del Proyecto 6.1. Fecha de Inicio : Tumbes :

6.2. Fecha de Terminacin : 6.3. Total meses : 7. Costo Total Presupuesto Total del Proyecto S/. 8. Financiamiento: Recursos Propios de los ejecutores del Proyecto

Cronograma de Ejecucin:
Etapas Recoleccin de material vegetal, y desinfeccin de los explantes Aislamiento y purificacin de Protoplastos Cultivo de protoplastos Regeneracin de Plantas Aclimatacin de Plantas Diciembre Enero Febrero Marzo Abril Mayo Junio Julio

1.- Titulo Micropropagacion de Cattleya maxima por Cultivo de Protoplastos 2.- Planteamiento del Problema 2.1.- Situacin problemtica En la actualidad los Bosques de Tumbes en especial el bosque tropical de Tumbes poseen una gran diversidad de orqudeas como Oncidium onustum, Trichocentrum tigrinum, Lockhartia schunkei, Cycnoches lehmannii entre otras las cuales crecen en un ambiente rido, pero la orqudea de mayor representatividad de la regin de Tumbes es sin duda alguna la Cattleya maxima por su aspecto colorido y vistoso, es una de las orqudeas que viene siendo aprovechada de forma irracional por los comercializadores ilegales de orqudeas que vienen depredando este lindo recurso que se une junto con la explotacin y destruccin de los bosques, consecuencia de la actividad

extractiva de madera, la ampliacin de la frontera agrcola y la ganadera problemas actuales de la regin de Tumbes. Es por eso que la IUCN (Unin Internacional para La Conservacin de la Naturaleza) la tiene considerada como una de las especies de orqudeas que se encuentra en estado de Amenaza. A pesar que existen muchas formas de proteger y manejar las reas Naturales Protegidas donde la prioridad es la conservacin de la diversidad biolgica; y estas a su vez nos brindan diversos beneficios; siendo uno de estos beneficios la produccin de esta especie la cual es muy valorada comercialmente en los mercados internacionales, es por eso que hoy en da debido a la existencia de proyectos de comercializacin de orqudeas silvestres este proyecto es de gran inters. Y junto con el peligro en la que se encuentra esta especie Cattleya maxima por encontrarse en estado de Amenaza, el presente proyecto brinda una ayuda a la conservacin sostenible y aprovechamiento de la orqudea Cattleya mxima mediante tcnicas de rpida propagacin que aseguren la conservacin de la especie, brindando al Per una oportunidad para la elaboracin y aplicacin de proyectos que contribuyan al desarrollo sostenible, solo basados en las oportunidades para el desarrollo de exportaciones innovadoras.

2.2.- Limitaciones Escasos recursos econmicos tanto para la adquisicin de materiales, equipos y financiamiento para la ejecucin del proyecto.

Falta de personal docente capacitado en el tema para que brinde la asesora correspondiente.

Falta de informacin sobre el tema en la especie citada para que sirva de referencia.

3.- Objetivos 3.1.- Objetivos Generales Desarrollar un manejo sostenible de la orqudea Cattleya maxima a travs de una micropropagacion por cultivo de protoplastos. Desarrollar un protocolo de micropropagacion de Cattleya maxima por cultivo de protoplastos.

3.2.- Objetivos Especficos Determinar la eficiencia de produccin de nuevos individuos en un medio de cultivo lquido. Determinar la eficiencia de produccin de nuevos individuos en un medio de cultivo semislido.

4.- Marco Terico Protoplastos Se refiere a componentes vivos de las clulas vegetales que estn rodeadas solo por la membrana plasmtica; en realidad, constituyen clulas desnudas de una planta. Muchos protoplastos pueden resintetizar la pared celular, dividirse, formar colonias e incluso regenerar plantas, la capacidad para producir un organismo altamente diferenciado, a partir de una sola clula somtica es una caracterstica nica de los protoplastos de las plantas superiores. (Szabados, 2004). Aislamiento de Protoplastos Existen diversos mtodos para aislar protoplastos, el mtodo enzimtico y el mtodo mecnico. El mtodo mecnico su rendimiento es bajo, su procedimiento tedioso y su aplicabilidad limitada dicho mtodo consiste en aplicar un choque osmtico para producir plasmlisis en las clulas, las cuales se rompen luego mediante un corte, luego se pueden liberar los protoplastos de las clulas rotas mediante el restablecimiento de su nivel osmtico. El mtodo enzimtico para el aislamiento de los protoplastos consiste en incubar las clulas en una mezcla de enzimas que degradan la pared celular. (Szabados, 2004).

Aislar

protoplastos

proporciona

material

experimental

para

manipular

genticamente las plantas por hibridacin somtica y cibridacin, y algunos procedimientos de transformacin. Estos experimentos consisten en tres etapas, a saber, el aislamiento de protoplastos, el caso de la manipulacin gentica que involucra la fusin de protoplastos o la absorcin de los genes y, por ltimo, el cultivo de protoplastos y la regeneracin de plantas frtiles. (Davey et al, 2010). Cultivo de protoplastos Los protoplastos se cultivan en cajas de Petri en medio lquido o semislido, rico en compuestos orgnicos e inorgnicos, suplementado con reguladores del crecimiento, y en presencia de un estabilizador osmtico.

Una tcnica muy eficiente que combina medio slido y lquido es la de cultivo en perlas de agarosa, donde los bloquecitos con los protoplastos inmovilizados en agarosa son cortados en cuatro mitades y colocados en medio lquido, donde se cultivan en continua agitacin. Los protoplastos regeneran la pared celular luego de uno a cuatro das en cultivo. La presencia de pared es esencial para lograr una divisin regular. Luego de dos a tres semanas, producto de mitosis sucesivas, se forman microcolonias derivadas cada una de una clula, que dos semanas despus se pueden ver a simple vista. Estos callos son transferidos a un medio de cultivo y a condiciones apropiadas para regenerar plantas. (Polci et al, 2007) Los principales factores a tener en cuenta para el cultivo de protoplastos son: Los requerimientos nutricionales: se han utilizado en muchos casos los mismos medios de cultivo que se utilizan en el cultivo de clulas y tejidos, pero en general son enriquecidos con vitaminas, azcares, aminocidos,

reguladores de crecimiento y tambin con aditivos inespecficos como leche de coco, hidrolizado de casena, extracto de levadura, etc. El potencial osmtico del medio de cultivo: los protoplastos requieren de proteccin osmtica antes de regenerar la pared celular. Normalmente se ajusta con el agregado al medio de cultivo de manitol o sorbitol. La densidad celular: la densidad inicial de protoplastos vara de 104 105 protoplastos/ml de medio de cultivo. Los cultivos con altas densidades producirn, a partir de cada protoplasto, colonias que debern separarse tempranamente para evitar quimeras. Si deseamos colonias bien separadas para asegurar que provengan de un solo protoplasto, la densidad inicial debe ser baja, de 100 500 protoplastos/ml. Hay protoplastos de varias especies y tipos que no logran dividirse a bajas densidades de cultivo. Otra tcnica utilizada es el cultivo en microgota, donde se puede cultivar hasta un solo protoplasto. Cada microgota contiene entre 0,25 - 25 l de medio de 8

cultivo, logrando densidades de 2 4 x 103 protoplastos/ml. Con ayuda de un micromanipulador se coloca la clula y se la cubre con aceite mineral para evitar la deshidratacin del medio. Los tratamientos fsicos: tratamientos de choque elctrico y trmico estimulan la divisin de los protoplastos. Las condiciones de cultivo: en general los protoplastos son sensibles a la luz, por lo cual durante el cultivo se los mantiene en oscuridad o bajo luz muy tenue. El origen de los protoplastos: el estado fisiolgico del tejido del cual provienen y la calidad de los protoplastos son muy importantes para obtener una elevada eficiencia en la respuesta al cultivo. (Polci et al, 2007). Micropropagacin de orqudeas Las orqudeas se pueden multiplicar tanto de forma vegetativa como sexual. Si se utiliza la propagacin vegetativa, la descendencia es idntica a la planta madre. Sin embargo, si se emplea la propagacin generativa, slo raras veces se obtiene una descendencia semejante a los padres, y esto solo en caso de especies silvestres. La propagacin tradicional de orqudeas es un proceso muy lento. La micropropagacin de las orqudeas se puede dividir en dos grupos importantes, basados principalmente en el objetivo de trabajo y la fuente del explante: micropropagacin sexual y micropropagacin asexual. La

micropropagacin sexual consiste bsicamente en la propagacin por medio de semilla, con lo cual se asegura la variabilidad del material gentico. Su aplicacin se justifica cuando se producen hbridos de gran valor cuya semilla de otra forma no germinara, adems de que en condiciones naturales la germinacin de orqudeas es muy baja (alrededor del 5% del total producido en una cpsula). La germinacin de semillas in vitro fortifica los esfuerzos de conservacin de orqudeas al ofrecer una mayor cantidad de plantas a un menor precio, evitndose as el saqueo de individuos silvestres. (Alvarado, 2000)

5.- Justificacin El aprovechamiento irracional de los bosques de Tumbes ha permitido que muchas especies de flora silvestre se encuentren en estado de amenaza en nuestra regin, siendo muchas de ellas especies de mucha importancia por su valor biolgico y comercial. Este es el caso de la orqudea Cattleya mxima una de las ms hermosas orqudeas que existen en nuestro pas y que se desarrolla solo en la parte norte del pas por ser especies que se desarrollan en lugares ridos y adems es una especie epifita. A esto se une la problemtica del aprovechamiento de este recurso el cual actualmente se encuentra en estado de Amenaza, esto debido tambin a la poca viabilidad que posee esta especie para su regeneracin de manera natural ya que es muy necesario la simbiosis con hongos microscpicos los cuales le proporcionan protenas y sustancias de reserva por lo que las semillas al caer a un sitio en el que no se encuentran estos hongos no podran llegar a la creacin de nuevas plantas. Y siendo de gran valor comercial en el mundo existe una gran explotacin incontrolada de esta especie. Es por ello que en el presente proyecto Micropropagacion de la Especie Cattleya maxima por cultivo de Protoplastos buscamos una forma de

rpida regeneracin de la especie lo que hara posible un manejo sostenible de esta especie las cuales estn siendo afectadas y dara una gran produccin de esta especie para su aprovechamiento. Siendo de mucha importancia la realizacin del presente proyecto en torno a la proteccin de esta especie la cual se encuentra en estado de amenaza. Contribuyendo oportunidades y a formular una estrategia propia para afrontar las los retos asociados con los problemas de

aprovechamiento irracional de especies silvestre de la flora de nuestra regin, a travs de la Micropropagacin por Protoplastos que es una

tcnica novedosa y muy eficiente para la multiplicacin de nuevos individuos.

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6.- Antecedentes Est. Carlos Alvarado Ulloa (2000), en su Informe de Proyecto de Graduacin "Micropropagacin de Cattleya skinneri y Cattleya skinneri x Cattleya maxima por cultivo de pices" para optar por el grado de Bachiller en Ingeniera en Biotecnologa presentado a la Escuela de Biologa del Instituto Tecnolgico de Costa Rica, sustenta que en la Etapa de introduccin los explantes sobrevivientes al proceso de desinfeccin y a los efectos de la oxidacin, 60% form cuerpos protocrmicos en C. skinneri y 50% en C. skinneri x C. maxima. Los explantes que no formaron estas estructuras presentaron al final de este proceso secciones de tejido daado y otras partes con coloracin verdosa. De los explantes que formaron cuerpos protocrmicos en C. skinneri, el 66,67 % fue inoculado en medio MS (1962) modificado y el 33,33% en el medio Knudson C (1946) modificado. Un comportamiento opuesto ocurri en el cultivo in vitro del hbrido, pues el 66,67% se dio en medio MS (1962) modificado y el 33,33% en medio de cultivo Knudson C (1946) modificado. en su publicacin Biotecnologa y

Polci Pablo; Friedrich, Pablo

Mejoramiento Vegetal, sustenta que los protoplastos se cultivan en cajas de Petri en medio lquido o semislido, rico en compuestos orgnicos e inorgnicos, suplementado con reguladores del crecimiento, y en presencia de un estabilizador osmtico. Sin embargo, el medio lquido da mejores resultados por varias razones: (a) los protoplastos de varias especies slo pueden dividirse en medio lquido, (b) la presin osmtica del medio puede ser fcilmente reducida a los pocos das en cultivo, (c) la densidad celular puede ser modificada agregando medio de cultivo o las clulas con especial inters pueden ser aisladas y cultivadas a alta densidad, (d) la degradacin de algunos componentes del medio por la poblacin de protoplastos puede producir algunas sustancias citotxicas, cuya concentracin alrededor de las clulas ser menor en el medio lquido.

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7.- Hiptesis

8.- Variable 9.- Conceptualizacin de la Variable 9.1

10.- Operacionalizacin de las Variables

Problema
Existe

Objetivo General
Determinar la Reserva Total de

Variables

Indicador

Instrumento
Manual de determinacin de las reservas totales de carbono en los diferentes sistemas de uso de la tierra en Per, propuesta por Arvalo et al. (2003)

inters por las Reservas de Carbono almacenado en la Reserva Nacional de Tumbes?

Reservas Totales de Reserva Nacional de Carbono Carbono, en la Tumbes.

tC.ha

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11.- Materiales, Equipos y Reactivos 11.1.- Materiales 11.1.1.- Material Vegetal Hojas de Cattleya maxima provenientes del Orquidiario ubicado en Cruz Blanca, situada en el distrito San Juan, Departamento de Tumbes. 11.1.1.- Material de Vidrio y plstico - Pipetas Pasteur - Micro pipetas - Placas petri - Tubos Pyrex - Probetas - Pipetas - Matraz - Bistur 11.2.- Equipos Centrfuga con capacidad de 500-4000 rpm Cabina de flujo laminar Autoclave Refrigeradora pHmetro Agitador magntico Autoclave Balanza Analtica Estereoscopio Timer (Regulador de Fotoperiodo) Termmetro de maxima y mnima 11.3 Reactivos Reactivos para la desinfeccin del Explante Detergente Alcohol de 95 Hipoclorito de Sodio (NaOCl) al 3% y 1% 13

Physan 20 Detergente lquido Agua destilada Reactivos para el Aislamiento y Purificacin

CPW solucin madre de sales 1: 25 g/l MgSO4.7 H2O, 10 g/l KNO3, 2,72 g/l de KH2PO4, 0,016 g/l KI, 0.025 ng/l CuSO4.5 H2O, se disuelven en H2O y se almacena a 4 C.

CPW solucin madre de sales 2: 15 g/l CaCl2.2 H2O, se disuelven en H2O y se almacena a 4 C.

13% (w/v) solucin de manitol con sales CPW (CPW 13M): disolver 13 g de manitol en 80 ml de H2O, aadir 1 ml de cada una de las soluciones de sales CPW 1 y 2; alcanzar un volumen de 100 ml con H2O, un pH de 5.8, filtrar, esterilizar y almacenar a temperatura ambiente.

El 25% (w/v) de solucin de sacarosa con sales CPW (CPW de 25 S): disolver 25 g de sacarosa en 80 ml de H2O, aadir 1 ml de cada una de las soluciones de sales CPW 1 y 2, llevar a 100 ml con H2O, pH a 5.8, filtrar, esterilizar y almacenar a temperatura ambiente.

0,6 M BH3 medio lquido Reactivos para el Cultivo y Regeneracin de Plantas

MT de macronutrientes, micronutrientes, vitaminas, calcio y hierro. Cumarnicos (Sigma; solucin de reserva, 1.46 mg/ml): disolver el polvo en agua tibia, se almacena a 4 C.

NAA solucin madre (1 mg/10 ml) cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D, Sigma; solucin de reserva, 1 mg/10 ml): disolver el polvo en unas pocas gotas de un 95% (v/v) de etanol, llevar a volumen final con H2O, almacenar a 4 C.

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6-bencilaminopurina (BAP, Sigma; solucin madre de 1 mg/ml): disolver el polvo en unas gotas de NaOH 5 M, llevar a volumen final con H2O, se almacena a 4 C.

El cido giberlico (GA3, Sigma; solucin madre de 1 mg/ml): disolver el polvo en unas pocas gotas de un 95% (v/v) de etanol llevar a volumen final con H2O, filtrar, esterilizar, almacenar en pequeas alcuotas a 4 C, aadir al medio despus de la esterilizacin en autoclave y enfriar el medio a 55 C en un bao de agua.

0,6 M BH3 medio lquido 0,15 M EME medio lquido: los ingredientes y el pH son los mismos que en medio de 0,15 M EME semislidos, slo omiten agar, filtrar, esterilizar, almacenar a temperatura ambiente.

0,15 M EME-malta medio semislido: lo mismo que 0,15 M EME medio semislido, pero sustituir 50 g/l de maltosa por los 50 g/l de sacarosa; medio de autoclave y se vierte 35 ml/placa en placas de Petri de 100 20 mm

0,15 M EME-malta medio lquido: los ingredientes y el pH son los mismos que en 0,15 M EME-malta medio semislido, pero se omite el agar; filtrar, esterilizar y almacenar a temperatura ambiente.

0,6 M EME medio lquido EME 1500 medio semislido: 20 ml/l MT solucin de macronutrientes, 10 ml/l MT solucin de micronutrientes, 10 ml/l MT solucin de vitamina, 15 ml/l MT solucin de calcio, 5 ml/l MT de solucin de hierro, 50 g/l de sacarosa, 1.5 g/l de extracto de malta, 8 g/l de agar, pH 5.8; medio de autoclave y en placas de petri de 100 20 mm, se vierte de 35 ml/ placa.

Medio B + semislidos: 20 ml/l MT solucin de macronutrientes, 10 ml/l MT solucin de micronutrientes, 10 ml/l MT solucin de vitamina, 15 ml/l MT solucin de calcio, 5 ml/l MT solucin de hierro, 25 g/l de sacarosa, 20 ml/l de agua de coco, 14.6 mg/l cumarina (10 ml de solucin de cumarina), 0,02 mg/l de NAA (200 l de solucin de NAA), 1mg/l GA3 15

(aadir 1 ml GA3 despus el medio se esteriliza en autoclave y se enfra a 55 C en un bao de agua), 8 g/l de agar, pH 5.8), el medio se esteriliza en autoclave y en placas petri 100 20 mm, se vierte 35 ml/ placa. DBA3 medio semislido: 20 ml/l MT solucin de macronutrientes, 10 ml/l MT solucin de micronutrientes, 10 ml/l MT solucin de vitamina, 15 ml/l MT de solucin de calcio, 5 ml/l MT de solucin de hierro, 25 g/l de sacarosa, 1.5 g/l de extracto de malta, 20 ml/l de agua de coco, 0.01 mg/l 2,4-D (100 l de solucin de 2,4-D), 3 mg/l de BAP (3 ml de solucin BAP), 8 g/l agar, pH 5.8; esterilizar el medio en autoclave y en placas de petri 100 20 mm, se vierte de 35 ml / placa Medio RMAN de Induccin de races y propagacin

12.- Metodologa El proceso de investigacin del presente trabajo contempla desde la desinfeccin del explante hasta la regeneracin de plantas.

Los Protocolos de trabajo han sido seleccionados de la publicacin Mtodos Esenciales para el cultivo de clulas de plantas, de Michael R. Davey et al. (2010); en el cual se establece un protocolo para el aislamiento y purificacin de protoplastos; y tambin para el cultivo y regeneracin de plantas.

12.1.- Lugar de Ejecucin El presente estudio se realizara en los ambientes del Laboratorio de Tejidos Vegetales. Departamento de Produccin Agrcola. Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Tumbes. 12.2.- Seleccin de material vegetal Se utilizara plantas de la especie Cattleya maxima, mantenidos en condiciones de invernadero. Los explantes que se utilizaran son las hojas

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jvenes las cual sern cortadas desde la base con un bistur previamente desinfectado con alcohol, protoplastos obtenidos mediante aislamiento.

12.2.- Desinfeccin del material vegetal El tratamiento de desinfeccin para las hojas de Cattleya maxima, ser el siguiente: Se lavara inicialmente las hojas con agua y detergente por 10 minutos, seguido de una inmersin en alcohol de 95 por 5 minutos. Posteriormente se aplicara una doble desinfeccin con NaOCl (al 3% y 1%, por 10 y 20 minutos, respectivamente) conteniendo cada una 0,5% de Physan 20 y 3 gotas de detergente lquido. Despus de cada desinfeccin con NaOCl se aplicaran lavados con agua estril (3 lavados despus de la primera desinfeccin y 2 despus de la segunda, todos con una duracin de 2 minutos). Despus de desinfeccin se proceder al aislamiento y purificacin de los protoplastos. 12.3.- Aislamiento y Purificacin de Protoplastos 1.- Despus de la incubacin durante la noche, pasar la preparacin enzimtica a partir de las dos fuentes de los padres (ver Protocolos 10.2 y / o 10.3, ver figuras 10.1 y 10.2) a travs de una gasa estril 45 micras de malla de nylon para eliminar los tejidos no digeridos y otros restos celulares, recoger el filtrado en 40 ml Pyrex tubos. 2.- Transferir el protoplasma que contienen filtrado a un tubo de 15 ml calibrar la centrfuga con tapn de rosca y se centrifuga a 900 rpm durante 5-8 min. 3.- Eliminar el sobrenadante con una pipeta Pasteur y resuspender el precipitado de protoplastos suavemente en 5 ml de solucin de CPW 25 S. 17

4. Poco a poco pipetea 2 ml de solucin de CPW 13M directamente en la parte superior de la capa de sacarosa. Evitar la mezcla de las capas 5.- Se centrifuga a 900 rpm durante 80-10 min. 6. Slo protoplastos viables formar una banda en la interfaz entre la sacarosa y las capas de manitol. Eliminar los protoplastos de esta interfaz con una pipeta Pasteur y resuspender en 10-13 ml de 0,6 M BH3 medio lquido (Use una nueva centrfuga con tapn de rosca). 7.- Se centrifuga a 900 rpm durante 80-10 min. 8.- Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado suavemente en 10-13 ml de medio de 0,6 M BH3 9.- Se centrifuga a 900 rpm durante 80-10 min. 10.- Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado con 0,6 M BH3 de medio en un volumen que es aproximadamente 10 veces superior al tamao de la pastilla. 12.3.- Cultivo y Regeneracin de Plantas 1.- Despus de 4-6 semanas de incubacin, suplemento de cultivo de protoplastos fusionados, o protoplastos con microprotoplastos, con nuevo medio que contiene potencial osmtico reducido. Lograr esto mediante la adicin de 10-12 gotas de 1:1:1 (por volumen) de la mezcla de 0.6 M BH3, 0.6 M EME y 0.15 M EME de medios lquidos. 2.- Incubar los cultivos durante otras 2 semanas en condiciones de poca luz (20 E/m2/s intensidad) con unas 16 h fotoperodo a 28 2 C. 3.- Lograr una nueva reduccin del potencial osmtico de los cultivos con siguientes pasos: - Aadir 2 ml de 1:2 (v:v) de 0,6 M y 0,15 M BH3 EME-malta medios lquidos para cada placa de fusin tratada con protoplastos. 18

- Inmediatamente verter todo el contenido en placas de petri con medio agar solidificado 0,15 M EME-malta y agitar cada plato con el fin de extender el lquido que contiene colonias de protoplastos derivados de manera uniforme sobre toda la superficie del agar semislido. 4.- Incubar los cultivos con un fotoperodo de 16 h (70 mol/m2/s Intensidad) a 28 2 C y, desde este punto hasta hbridos somticos se plantan en compost, mantener los cultivos bajo las mismas condiciones de crecimiento. 5.- Transferencia de embriones somticos regenerados tan pronto como aparecen de las colonias de callo de nuevo medio de agar solidificado 0.15 M EME-malta. 6.- Despus de 3-4 semanas, se mueven pequeos embriones somticos a un medio semislido EME 1500 para la ampliacin y la germinacin y en relacin con medio semislidos B+ para el alargamiento del eje. 7.- Diseccionar embriones anormales que no germinan en secciones grandes y el lugar en DBA3 medio para la induccin de disparar. 8.- La transferencia de todos los brotes resultantes en medio de RMAN para inducir el enraizamiento. 9.- Transfiera las plantas con races en compost en el invernadero y cubra con plstico rgido transparente durante 3-4 semanas manteniendo una alta humedad. Retire las tapas de plstico despus de este perodo de aclimatacin.

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13.- Referencias Bibliogrficas Alvarado C., (2000). Micropropagacin de Cattleya skinneri y Cattleya skinneri x Cattleya maxima por cultivo de pices. Instituto Tecnolgico de Costa Rica - Escuela de biologa. Cartago - Costa Rica. Arciga M. (2011). Germinacin in vitro de Guarianthe aurantica Bateman (Orchidaceae). Universidad Michoacana de San Nicolas de Hidalgo Facultad de Biologa. Morelia, Mich. Briceo I., (2004). Propagacin Vegetativa, Fenologa y Comercio de Seis Especies del Genero Cattleya Lindl. (Orchidaceae). Universidad Nacional Mayor de San Marcos - Facultad de Ciencias Biolgicas, Unidad de Post Grado. Lima - Per. Cavero M., Collantes B., Patroni C., (2005). Orqudeas del Per. Centro de Datos para la Conservacin del Per. Universidad Nacional Agraria la Molina - Facultad de Ciencias Forestales. Primera Parte. pp 49 - 50. Davey M., Paul A., (2010). Cultivo de clulas de Plantas: Mtodos Esenciales. Universidad de Notthingham - Escuela de Biociencias. Echegaray T., (2008). Propagacin in vitro de orqudeas para exportacin. Universidad Nacional Agraria la Molina. Ginderdeuren V., (2009). Aclimatacin de plntulas de Chloraea virescens (Willd.) Lindl. cultivadas in vitro. Universidad Austral de Chile Escuela de Agronoma. Valdivia - Chile. Murguia J., (2007). Produccin de Orqudea, Anturio, Gardenia y Ave del Paraso. Curso de Capacitacin, 18 al 19 de mayo del 2007.

Universidad Veracruzana - Fundacin Produce Veracruz A.C. Polci P., Friedrich P., (2007). Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal Hibridacin somtica. Captulo II. pp 105 107.

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 Szabados L., (2004). Protoplastos: aislamiento, cultivo y regeneracin de plantas. Capitulo X. Unidad de Investigacin en Biotecnologa - Centro Experimental de Agricultura Tropical. Cali - Colombia.

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14.- Presupuesto Especificaciones Material de Muestreo - Bolsas de Polietileno 2 Kg. - Bolsas de Papel Kg. - Bolsas de Polietileno de 2 Kg. - Bolsas de Polietileno de 10 Kg. - Frascos plsticos - Botas de jebe - Impermeables - Guantes de caucho - Engrapador - Cinta mtrica - machetes - Botiqun de primeros auxl. - Linterna Material de Escritorio - Papel bond 80 g. - Papel formato A4 - Papel bulky. - Libretas de apuntes. - Lapiceros. - Lpiz - Saca puntas - Cinta scoth. - CD ROOM RW - Plumones indelebles. Recursos Humanos -Personal investigador Otros Servicios de Terceros. - Fotocopias - Impresiones y Espiralados - Pasajes - Alimentos - Alquiler de GPS - Servicios de Anlisis - Sustentacin de tesis Total Cantidad 02 cientos 01 ciento 01 cientos 02 cientos 05 unidades 02 pares 10.00 02 unidades 02 pares 01 unidad 02 unidades 02 unidades 01 unidad 02 unidades P. Unitario 5 7 8 15 5 30 20 8 20 5 30 20 25 Total 10 7 8 30 25 60 40 16 20 10 60 20 50

1 millar 1 millar 1 millar 04 unidades 06 unidades 04 unidades 02 unidades 02 rollos 02 unidades 04 unidades 2

35 30 25 4 1 1 1 3.5 5 5 300

35 30 25 16 6 4 2 7 10 20 600

100 100 400 300 100 2000 450

100 100 400 300 100 2000 900 5011

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