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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA MANUAL DE PRACTICAS DE TOXICOLOGIA DE ALIMENTO

Clave: 2332087 Dr. Mendoza Martinez Eduardo

CUANTIFICACIÓN DE UN TÓXICO VOLÁTIL (CIANURO DE HIDRÓGENO) EN GLUCÓSIDOS CIANOGÉNICOS.

ASIGNATURA: Toxicología de Alimentos DEPARTAMENTO: Ciencias Biológicas de la Salud

OBJETIVO ACADÉMICO: Que el alumno determine la cantidad de cianuro de hidrógeno liberado a partir de glucósidos cianogénicos presentes en muestras de plantas y semillas que forman parte de la dieta de humanos y animales, y relacione la concentración con su potencial toxicológico.

PROBLEMA: Que el alumno cuantifique la concentración de cianuro de hidrógeno presente en una serie de 3 muestras de semillas o plantas. Una de estas será proporcionada por el profesor y se deberá reportar al menos el 80% de la concentración real. Al final de la práctica el alumno indicará cual semilla podría presentar mayor riesgo de toxicidad para el humano, en base a la cantidad de HCN que estaría presente en el consumo de 50 g de muestra.

INTRODUCCIÓN:

Existe en la naturaleza una amplia gama de vegetales, alrededor de 1000 especies, que contienen glucósidos cianogénicos. Algunos de éstos están constituidos por alfa- hidroxinitrilos (aglucón), unidos a través de un enlace beta a un carbohidrato, que puede ser un monosacárido o un disacárido. Al hidrolizar estos compuestos, se obtiene, entre otros productos, ácido cianhídrico. Dicho proceso requiere de la presencia de la enzima β- glucosidasa, que rompe el enlace glucosídico, y de la enzima hidroxinitriliasa, que libera el ácido cianhídrico. Estas enzimas se encuentran presentes en la misma planta y actúan sobre los glucósidos, cuando la planta sufre ruptura del tejido debido a daños mecánicos( 2,3 ). La importancia de estos compuestos desde el punto de vista toxicológico radica en que se encuentran presentes a diferentes concentraciones, en vegetales que forman parte de la dieta de humanos y animales. Los estudios realizados en algunos alimentos, han permitido detectar glucósidos cianogénicos tales como: faseoliona, amigdalina, durrina y linamarina entre otros( 2 ). Entre dichos alimentos se encuentran leguminosas (varios tipos de frijol incluyendo el colorin); tubérculos como la casava; cereales como el sorgo; y semillas de algunas frutas como limón, lima, manzana, pera, cereza, durazno, albericoque y ciruela( 1, 4, 5 ).

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FUNDAMENTO:

Clave: 2332087 Dr. Mendoza Martinez Eduardo

El método en el presente guión aprovecha la reacción, sensible y específica de Guignard, la cual es ampliamente utilizada en pruebas cualitativas para la detección de HCN como de glucósidos cianogénicos; sin embargo, con el uso de una curva estándar de cianuro alcalino, se podrá realizar dicha prueba en forma cuantitativa, expresándose en base al ácido cianhídrico liberado ( 4, 6, 7 ).

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA MANUAL DE PRACTICAS DE TOXICOLOGIA DE ALIMENTO FUNDAMENTO : Clave: 2332087 Dr. Mendoza

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MATERIAL DE LABORATORIO

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MATERIAL

 

CANTIDAD

Tubos de ensaye ( 20*150) con tapón de hule.

 

10

Cajas petri

1

Papel filtro cualitativo( filtración rápida ) 2 x10 cm.

 

2x10cm

Tijeras,

pinzas

de

disección

y

regla

o

1

juego por equipo

escuadra graduada.

   

Matraz erlenmeyer de 250ml. con tapón de hule.

 

10

Mortero con pistilo

 

1

Navaja

1

por equipo

Pipeta de 1ml. graduada.

 

3

Probeta de 50ml.

 

1

Matraces volumétricos de 10 ml

 

6

Embudo de cola corta.

 

5

Vaso de precipitado de 100ml.

 

3

Tubo de ensaye( 13*150 mm )

 

2

Celdas de 1 cm de diámetro

 

2

Guantes de hule 1 par

 

1

por equipo

Hielo

Espectrofotómetro

 

Balanza analítica

 

Estufa

MATERIAL BIOLOGICO

  • Traer por equipo aproximadamente 1g de muestras de plantas o semillas de: durazno, manzana roja, ciruela pasa, sorgo, bambú, colorín, lima, almendra de capulín, germen de soya.

REACTIVOS

  • Acido clorhídrico concentrado.

  • Acido pícrico.

  • Carbonato de sodio.

  • Cloroformo.

  • Cianuro de potasio

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PRECAUCIÓN: ALTAMENTE TÓXICO, PREPARAR Y MANEJAR CON GUANTES ( SOLUCIÓN ESTÁNDAR II).

SEGURIDAD: A pesar de que la concentración utilizada de KCN en este guión es de aproximadamente 0.24 mg/mL y esta concentración está por debajo de la DL50 en ratones, no deberá descuidar las medidas de seguridad para su trabajo.

MANEJO DE RESIDUOS: Los residuos de las soluciones que contienen KCN no deberán ser tiradas al drenaje directamente, recolectarlas en frascos y etiquetarlas. Tratamiento de residuos de soluciones que contienen KCN: colocarlas en hielo y adicionar lentamente una solución de hipoclorito de sodio, se dejan reposar por 24 horas y posteriormente podrán ser desechadas por la tarja con abundante agua.

PROCEDIMIENTO:

El alumno trabajará 3 muestras problema de plantas o semillas según la lista mencionada.

Una de las cuales será proporcionada por el profesor.

  • A) PREPARACIÓN DE LA TIRA REACTIVA

Cortar papel filtro en tiras exactamente de 2x10 cm (preparar 1 tira por muestra), se sumergen en el reactivo de Guignard, dejándose escurrir. Introducirlas en una estufa que se encuentre estable a una temperatura entre 50-55oC, donde se dejan por aproximadamente

10 min (las tiras reactivas preparadas deben quedar ligeramente humedecidas al ser utilizadas en el procedimiento).

  • B) PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS DE SEMILLAS O PLANTAS.

Pesar 1 g de muestra de y colocarla por separado en el mortero, y con la ayuda de las pinzas de disección y navaja cortarlas y macerarlas lo más rápido posible. A cada una de las muestras se le realizará el siguiente procedimiento:

Colocar la muestra fragmentada en un matraz erlenmeyer de 250 mL, medir 25 mL de agua destilada con pipeta volumétrica y agregarlos al matraz. A continuación añadir 2 gotas de cloroformo y 1 mL de HCl 0.5 N. Colocar con cuidado la tira de papel reactivo humedecida como se ilustra en la figura (1).

PRECAUCIÓN: No mojar la tira reactiva con los reactivos anteriores y tapar inmediatamente cada uno de los matraces erlenmeyer con su tapón después de concluir este procedimiento. Colocar el matraz Erlenmeyer en la estufa a 40oC por espacio de 1 h, agitando suavemente a intervalos de 15 min, teniendo precaución de que el contenido del matraz no tenga contacto con la tira reactiva de papel filtro, meter simultáneamente a la estufa los matraces con las diferentes concentraciones de la curva estándar de HCN. (El gas de HCN 29 liberado reacciona con el reactivo de Guignard de la tira reactiva, formando un complejo NO TÓXICO).

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FIGURA 1. Preparación de la muestra en el matraz y colocación de la tira reactiva.

C) PREPARACIÓN DE LA CURVA ESTÁNDAR La curva estándar de HCN se prepara colocando en matraces volumétricos de 25 mL los volúmenes de la solución patrón indicados en la siguiente tabla y llevando a volumen con agua destilada:

CURVA ESTÁNDAR DE HCN.

Alícuota de la solución patrón (mL)

Concentración (μg/mL)

]

0.0

Blanco

0.1

0.4

0.2

0.8

0.3

1.2

0.4

1.6

0.5

2

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Tratamiento de la curva estándar:

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1) Una vez preparadas las soluciones de la curva patrón, pasarlas inmediatamente a matraces erlenmeyer de 250 ml, debidamente etiquetados.

2) Colocar la tira reactiva en el matraz como se indica en la figura 1 y agregar a cada matraz 1 ml de la solución de HCl 0.5 N y dos gotas de cloroformo. PRECAUCIÓN: No mojar la tira reactiva con los reactivos anteriores y tapar inmediatamente cada uno de los matraces erlenmeyer con su tapón después de concluir este procedimiento.

3)Incubar por una hora con agitación cada 15 minutos.

  • D) TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS PROBLEMA, CURVA ESTÁNDAR Y

BLANCO.

Una vez transcurrido el tiempo de incubación, los matraces se sacan de la estufa y se dejan enfriar. Se observan las tiras reactivas de las muestras problema y aquellas que no muestren ni siquiera una leve coloración café-rojiza se considerarán como prueba negativa; en tanto que aquellas que sí lo presenten son positivas y se introducen en un tubo de ensaye al cual se le adiciona 20 ml de agua destilada, se tapa y se agita vigorosamente con el fin de extraer el pigmento colorido; se procede a filtrar (con papel Whatman No. 40) para eliminar residuos de la tira de papel. Se determina la absorbancia de las muestras y de la curva patrón en el espectrofotómetro a 520nm, utilizando como blanco el primer punto de la curva.

NOTAS:

  • a) Las soluciones II, III y agua destilada deben de estar en baño de hielo antes de usarse.

  • b) No olvidar poner 2 gotas de cloroformo a los matraces de la curva patrón.

  • c) Antes de meter a la estufa los matraces de la curva patrón, colocar las tiras reactivas a

cada uno de ellos (como se indica en la figura 1).

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES:

Reactivo de Guignard: Se disuelve en agua destilada 2.5 g de ácido pícrico y a continuación 12.5 g de carbonato de sodio, llevándose a un volumen de 500 ml con agua destilada. MANEJAR CON CUIDADO EL ÁCIDO PÍCRICO, YA QUE ESTAS SUSTANCIA ES CANCERÍGENA Y SE ABSORBE FÁCILMENTE POR PIEL.

Solución patrón de cianuro de potasio: se pesa exactamente 12.05 mg de KCN y se lleva a 50 ml de agua destilada. MANEJAR CON CUIDADO Y CON GUANTES LA SOLUCIÓN DE CIANURO ALCALINO YA QUE ES ALTAMENTE TÓXICO COLOCAR LA SOLUCIÓN EN BAÑO DE HIELO DESPUÉS DE PREPARARLA.

Ácido clorhídrico 0.5 N.

COLOCAR LA SOLUCIÓN EN BAÑO DE HIELO DESPUÉS DE PREPARARL

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CUESTIONARIO:

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1.-¿Qué importancia tiene durante la práctica que la trituración de la muestra se realice rápidamente?

2.-¿Por qué la tira reactiva de papel no debe tocar la solución y por qué se da una reacción positiva sin que la tira reactiva esté en contacto con la muestra?

3.-¿Por qué considera necesario colocar la solución patrón de cianuro de potasio y el HCl 0.5N en baño de hielo?

4.- Por qué es necesario calentar la muestra?

5.-¿Cómo

podría

eliminar

la

presencia

de

glucósidos

cianogénicos

de

una planta

comestible?

6.- Grafíque los valores de absorbancia vs concentración obtenidos e interpole las absorbancias de las muestras.

7.- Reportar los resultados obtenidos en mg/50g de muestra, tomando en cuenta que la solución patrón es equivalente a 100 μg HCN/ml y llenar la siguiente tabla:.

Muestra de semilla

Concentración de

mg HCN/50 g de

Riesgo de

HCN (μg/mL)

muestra

Toxicidad

(marque con

 

cruces)

       
       
       

8.- Con base a los resulta dos obtenidos ¿cuál muestra considera que representa un mayor riesgo potencial en su consumo?

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

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  • 1. Linder, E.; Toxicología de los alimentos; Acribia, pg. 15-19, Zaragoza ( 1978 ).

  • 2. Conn, E.E.; Cyanogenic glucosides. In: Toxicants ocurring naturally in foods; National

Academy of Sciences; 2th Edition, pp. 290-308, Washington, D.C.( 1973 ).

  • 3. Montgomery, R.D.; Cyanogens: AToxic constituyent of plant food stuffs; Liener, I.E;

Academic Press, pp. 143-160, N.Y.( 1980 ).

  • 4. Conn, E.E.; Cyanogenic glucosides; Agr. Food Chem. 17, 519-526 (1969).

  • 5. Eyjolfsson, R.; Recent Advances in chemistry of cyanogenic glucosides; Fortsch. Chem.

Orgn. Naurist. 28, 74-108 (1970).

  • 6. Fabre, R. Y Truhaht, R.; Tratado de toxicología; Paraninfo, S.A., Vol. I, pág. 311-332,

Madrid (1976).

  • 7. Lucas, B. and Sotelo, A.; A simplified test for the quantitation of cianogenic glucosides

in wild and cultivated seeds; Nutr. Rep. Int. 29 ( 3 ), 711-719( 1984 ).