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BIOTECNOLOGA

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TP N2 ANLISIS BACTERIOLGICO DE AGUAS

Basil Garaventa Ghirardelli Cukjati Varela

Natalia Paula Ignacio Paula Pablo

Jefe de TP: Ing. Ricardo Mateucci Profesor: Lic. Jorge Pascual. 2010

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1. OBJETIVO
El objetivo de la prctica es cuantificar la carga microbiana en aguas cloacales.
Y as determinar el grado de contaminacin a travs de la bsqueda de bacterias coliformes en la muestra de agua en estudio.

Se realizarn los siguientes recuentos: A - Recuento de coliformes totales (CT). B - Confirmacin de Escheriquia Coli (Coliformes Fecales). C - Confirmacin de Bacterias Intermedias Aerogeneses Cloacae (IAC).

2. METODOLOGA.
Sembrado en profundidad de una muestra de agua en dos medios de cultivo diferentes: Sembrado en PCA: Se siembra 1 ml de muestra en tres concentraciones diferentes (con la Conc. Original=10, 10-1 y 10-2 de la conc. Inicial.), junto con 15 ml de solucin de PCA. Incubacin: PCA, incubacin durante 48 hs. a 37 C Sembrado en Caldos de Cultivo. a) Mc Conckey doble y simple, incubacin durante 48 hs. a 44 C. b) Citrato de Koser, incubacin durante 24 hs, 37 C. Pruebas IMYIC. a) INDOL. b) VOGES PROSKAUER. c) ROJO DE METILO. d) CITRATO DE SIMON.

3. OBSERVACIONES

RESULTADOS

1- Tanto la muestra de partida como la solucin 1/10, presentan muchas unidades formadoras que superan ampliamente las 300 UFC (1280x8) lo que hace difcil el recuento debido a que se comete mucho error. 2- Se procedi al recuento de colonias de las placas de la ya que en la diluciones ms concentradas se superaban las 300 UFC. Datos de incubacin y resultados de recuento. (Entramos a Tabla NMP con 3/3/3 en todos). Recuento Coliformes Totales Mc Conckey (UFC/100ml) Recuento Coliformes Fecales Mc Conckey (UFC/100 ml) >110000 >110000

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Resultados de Pruebas IMVIC. Grupos Escheriquia Coli (CF) IAC INDOL ROJO DE METILO VOGES PROSKAUER CITRATO SIMON

+ -

+ -

+ +

INDOL: La muestra se colore de amarillo. ROJO DE METILO: sigui la va de 2,3 butanodiol, virando al amarillo. VOGES PROSKAUER: vir al verde. CITRATO DE SIMON: Qued mitad verde y Mitad Azul, por lo que asumimos la presencia de ambos tipos de bacterias.

4. CONCLUSIONES
En el caso de Siembra en profundidad nuestra muestra dio fuera del rango estipulado de 30-300 UFC/ml, habra que haber hecho una o dos ms diluciones, es decir solucin 1/1000 y solucin 1/10000. Tambin present un recuento de aerobios que super las 500 UFC/ml establecidas por la ley por lo que debera considerarse no satisfactoria. Las aguas afectadas al presente anlisis bacteriolgico se encontraran contaminadas, y por lo tanto, de acuerdo a los resultados obtenidos, no son aptas para el consumo humano. S, result ser satisfactoria con respecto a la cantidad de bacterias permitidas en el agua potable ya que el recuento de coliformes no supera el mximo permitido, por lo que, nuestra agua es apta.

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5. CUESTIONARIO
1- Cmo pueden clasificarse los medios de cultivo empleados? Explicar la clasificacin segn la funcin de los componentes. Para la Siembra en Profundidad por Volcado usamos: Plate Count Agar (PCA): La productividad de este medio, est basada en el alto contenido nutricional de sus componentes, que permite el desarrollo de las todas las bacterias presentes en la muestra. Busco entonces todo tipo de colonias con l. Para la Siembra por Filtracin: Busco un tipo especfico de bacterias, por lo que necesitamos un medio de cultivo selectivo, o sea que inhiba todo lo que no quiero que crezca, favoreciendo el desarrollo de un Microorganismo especfico. Caldo Mac Conkey Doble y Simple concentracin: (Inhibidor y diferencial) Los medios selectivos y diferenciados distinguan en medio Gramm - negativa bacterias mientras que inhibe el crecimiento de Gramm - positivo bacterias. Entonces detecto Enterobacterias. Est diseando para detectar la fermentacin de lactosa mediante cambio de color de incoloro a rojo/rosa. La Peptona es la fuente de aminocidos y de otros factores de crecimiento, La lactosa es el hidrato de carbono fermentable, La bilis de buey estimula el crecimiento de las bacterias coliformes e inhibe a gran parte de la flora gram positiva, El prpura de bromocresol es el indicador de pH. Los coliformes, son microorganismos que fermentan la lactosa, con produccin de cido y gas, entonces permite distinguir los grmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. Al acidificar el medio, se produce un viraje del indicador de pH del color prpura al amarillo. Agar Cetrimida: El agar de Cetrimida es un tipo de agar usado para el aislamiento selectivo de las bacterias gramnegative, Aeruginosa de los Pseudomonas y de otras especies del gnero. La frmula de este medio est desarrollada para favorecer la seleccin de P. aeruginosa y estimular la formacin de pigmentos. La cetrimida es un detergente catinico que acta como agente inhibidor, libera el nitrgeno y el fsforo de las clulas de casi toda la flora acompaante. La formacin de Amonio cuaternario inhibe el crecimiento del resto de Microorganismos. Si es prueba positiva, se presencia fluorescencia verde bajo luz U.V y pigmentacin verde plida espontnea de los Microorganismos. Citrato de Koser: Medio liquido utilizado en la clasificacin de enterobacterias. Es un medio para detectar aquellos microorganismos que utilizan el citrato como nica fuente de carbono y las sales de amonio como nica fuente de nitrgeno. Lo usamos para identificar presencia de IAC. Si es prueba IAC positiva, la solucin pasa de Verde a Azul. 2- Si espera un recuento total a 37C de 10000 ufc/mL cmo procedera?. Qu diluyentes se pueden emplear?, justifique esta respuesta. Hay que tener en cuenta que cada bacteria va a dar lugar a una colonia.

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El recuento de colonias en muy grande por lo que conteo estimativamente dividiendo las placas de Petri que correspondan a la mayor dilucin, y as entonces solamente contaremos aquellas placas en las cuales el nmero de colonias se encuentre comprendido entre 30-300 unidades. Empleamos una dilucin de 1/100.

Supongamos que tenemos una muestra en la cual hay 10.000 bacterias en 1mL. Como se formaran 10.000 colonias y stas no se pueden contar en 1 placa, se tiene que diluir. Entonces realizamos una dilucin 10-2, diluimos a 1/10: tomamos 1mL de la muestra y 9ml de disolvente. Ahora tendramos 1.000 bacterias en 1ml por lo que ser necesario diluir otra vez a 1/10 con lo que nos quedaramos con 100 bacterias en 1mL que ya podemos contar en la placa. Es importante usar un lquido de dilucin desprovisto de accin bactericida. En la mayora de los casos puede utilizarse agua corriente, agua destilada o solucin fisiolgica o agua peptonada 0,1 % con pH ajustado a 7. Una vez realizada la dilucin seriada pertinente hay que llevarlo a un medio de cultivo. Para hidratar el medio de cultivo se debe agregar una pequea cantidad de agua destilada PH=7, agitar y luego agregarle el resto de agua. 3-Cmo procedera si desconoce los recuentos esperados de aerobios mesfilos y de coliformes totales? Si de aerobios mesfilos espero alta concentracin, siembro en profundidad. Para coliformes totales, ya que estos son parte de la clasificacin anterior y si se trata de aguas no muy contaminadas (no de cloacas, p ej.) realizara una dilucin de 10 en 100. O sea realizara varias diluciones pero en cada una sembrara una muestra con su medio. Luego elegira las placas con recuento ptimo. En el caso de Coliformes totales, fecales y E. coli: NMP MTODO DE N.M.P. (Nmero ms Frecuente): basado en un mtodo estadstico. Dependiendo del nmero de m.o que sospechamos que puede tener la muestra existen distintas tablas de trabajo de nmeros ms probables), llevar a la tabla los valores obtenidos en tres diluciones consecutivas, donde por lo menos la dilucin menor tenga tres (3) tubos positivos y la dilucin mayor tenga cero (o) tubos positivos y reportar segn lo establecido. 4- En qu situaciones son adecuadas la siembra en profundidad y la siembra por filtracin?

A) Filtracin: Si espero bajo recuento, de sembrado de grandes cantidades de muestra, siembro

por filtracin. Aguas embotelladas Aguas de red Aguas de bebida desinfectadas Aguas de bebida con bajo contenido bacteriano

Se pueden examinar grandes volmenes de agua; tericamente casi cualquier volumen de agua se puede filtrar a travs del disco y los microorganismos de cualquier volumen quedarn en el disco.

B) Profundidad: Si espero alto recuento de bacterias, siembro en profundidad.

Recuento en placa. Recuento de Microorganismos Aerobios Mesfilos (RAM) en agua sigue siendo el mtodo ms utilizado en la mayora de los laboratorios de anlisis microbiolgicos. Se obtienen resultados no tan rpidamente, pero es adecuado a bajos volmenes de agua a analizarse. 5- Qu significado tienen las bacterias coliformes en un agua de bebida?

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La presencia de bacterias coliformes en el suministro de agua es un indicio de que el suministro de agua puede estar contaminado con aguas negras u otro tipo de desechos en descomposicin. Generalmente, las bacterias coliformes se encuentran en mayor abundancia en la capa superficial del agua o en los sedimentos del fondo. Los coliformes fecales, que se encuentran en los intestinos de los humanos y otros animales de sangre caliente, son un tipo de bacterias coliformes. La presencia de coliformes fecales en un suministro de agua es un buen indicador de que las aguas negras han contaminado el agua. Se pueden hacer pruebas especficamente para coliformes fecales o para el total de bacterias coliformes que incluye todos los tipos de bacterias coliformes y que puede indicar contaminacin fecal. 6- Existen otras bacterias normalmente en el intestino humano? Cules recuerda? En cada intestino humano habitan ms de 100 billones (con b) de bacterias, que pertenecen a entre 500 y 1.000 especies distintas. Entre muchas otras, existen las siguientes bacterias: Campylobacter: Origina la enfermedad campilobacteriosis., que es la causa ms comn de diarrea. Se encuentra su origen en carnes y pollos crudos o mal cocinados, leche no pasteurizada. Escherichia Coli: cusa la diarrea de viajero, calambres, dolor de estmago, se encuentra en carnes mal cocidas, leche cruda, productos agrcolas. Listeria Monocitogenes: Produce listeriosis, que es una enfermedad relacionada con el consumo de alimentos lcteos y crnicos que fueron congelados durante mucho tiempo. Tiene sntomas similares a los de una gripe. Salmonella: produce salmonelosis, es la ms temida en los meses de calor. Los productos potenciales de presentarla son las carnes, pescado, huevos, lcteos y sus derivados. Si se cuecen bien a altas temperaturas esta bacteria desaparece, mientras que si se comen crudos, es fuente potencial de contaminacin. Da diarrea, fiebre y dolor abdominal. Shigella: produce Shigelosis. Son las malas condiciones higinicas las que dan la presencia de esta bacteria. Se transmite en alimentos como ensaladas, leche y agua sucia. Staphylococus Aureus: El nombre corresponde a una bacteria que produce una toxina que provoca vmitos al poco tiempo de ingerir alimentos contaminados con ella. Alimentos del tipo de fiambres, productos de pastelera y productos lcteos (todos de alto contenido proteico).

7- Qu bacterias patgenas pueden transmitirse por el agua y ocasionar infecciones intestinales? Sus agentes patgenos son biolgicos, ms que qumicos, y los males que provocan casi siempre son contagiosos. Por lo general, los agentes patgenos pertenecen al grupo de los microorganismos, que se transmiten en las heces excretadas por individuos infectados o por ciertos animales. De forma que estas enfermedades se suelen contraer al ingerirlos en forma de agua o de alimentos, contaminados por esas heces (va fecal-oral). Los patgenos humanos transmitidos por el agua incluyen muchos tipos de microorganismos tales como: bacterias, virus, protozoos y, en ocasiones, helmintos (lombrices), todos ellos muy diferentes en tamao, estructura y composicin.

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8-

8- Qu caractersticas definen al grupo coliforme? Son Bacilos Cortos, Gram Negativos, que fermentan la lactosa y forman cido y gas. Son Anaerobios facultativos, se multiplican a mayor rapidez a temperaturas entre 30 C y 37 C. Crecen abundantemente en medios corrientes como Agar y Caldos. Las coliformes son una familia de bacterias que se encuentran comnmente en las plantas, el suelo y los animales, incluyendo a los humanos.

9- Qu lmite de bacterias coliformes se ha adoptado como mximo para una agua de bebida? Lmites permisibles para aguas de consumo

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Bacterias mesfilas viables: en agar Plate Count 24 hs. a 37C, no mas de 500 UFC/ml Bacterias coliformes: NMP a 37C 48 hs. (Caldo Mc Conckey o Lauril Sulfato), en100 ml; igual o menor a 3, (0 colonias en 100 ml de muestra). Ausencia de Escherichia coli: en 100 ml de muestra. Ausencia de Pseudomona aeruginosa: por 100 ml de muestra Natacin: menos de 200 colonias por 100 ml de la muestra de agua Navegar/Pescar: menos de 1,000 colonias por 100 ml de la muestra de agua 10- Qu volumen tienen las porciones que se acostumbra sembrar cuando se trata de agua de bebida Envase: Se deben utilizar frascos esterilizados y con envoltura externa. La capacidad debe ser de 200 cm3 a 250 cm3. Se siembran cantidades de a 1-10 ml. Envo de muestras: Debe transcurrir el menor tiempo entre la extraccin y la llegada al laboratorio, y que durante ese tiempo se mantenga entre 4 y 10 C. De lo contrario se producen modificaciones cuali -cuantitativas de la flora bacteriana. 11- Describa el mtodo utilizado para el exmen bacteriolgico de Aguas. Para el exmen Bacteriolgico de aguas se utiliz el Mtodo de NMP o Wilson junto con las Pruebas IMYIC.
Determinacin de bacterias aerobias totales Se efectan tres diluciones a partir de una muestra de agua contaminada empleando agua destilada estril. Deben utilizarse tubos de ensayo y pipetas estriles. Si se trata de aguas poco contaminadas, se utilizar la muestra original y dos diluciones de 1/5 y 1/10. Si se trata de aguas muy contaminadas, se realizarn 3 diluciones sucesivas de 1/10 cada una, para obtener tres muestras cuyas concentraciones finales sean 1/10, 1/100 y 1/1000. Se funde el medio y se enfra a 45 50 C. Se coloca aspticamente 1 ml de cada dilucin en cada una de las cajas de Petri, previamente marcadas con las diluciones a sembrar. Se vierte en cada una de las cajas de Petri (X DUPLICADO) el medio fundido. Se mezcla con suaves movimientos de rotacin y se deja solidificar. Las cajas se incuban invertidas en estufa a 37 C durante 48 Hs. El tiempo transcurrido desde que se efecta la dilucin hasta el agregado del medio de cultivo no debe ser superior a los 30 minutos. Despus de la incubacin se procede al recuento de colonias. Determinacin del nmero ms probable de microorganismos coliformes totales: METODO DE WILSON.

Segn el origen de la muestra se realizar la dilucin correspondiente. En tres tubos con 10 ml de caldo Mac Conkey doble concentracin sembrar 10 ml de agua muestra. En tres tubos con 5 ml de caldo Mac Conkey simple concentracin sembrar 1 ml de agua muestra. En tres tubos con 5 ml de caldo Mac Conkey simple concentracin sembrar 0,1 ml de agua muestra. Llevar todos los tubos a incubar a 37 C 24 48 Hs.

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Se considera positivo todo tubo que presenta cido y gas, lo que indica que el agua posee bacterias coliformes. El nmero ms probable (NMP) de bacterias coliformes por 100 ml se calcula mediante una tabla estadstica teniendo en cuenta la combinacin de tubos sembrados con 10, 1 y 0,1 ml de agua y la combinacin de tubos positivos. Diferenciacin de las bacterias coliformes Determinacin del NMP de bacterias colifecales De cada uno de los tubos Mac Conkey positivo, se repica con ansa rulo a tubos con 5 ml de caldo Mac Conkey concentracin simple. Se incuba a 44 C durante 48 Hs. A esta temperatura dan cido y gas las bacterias colifecales. Mediante el empleo de esta tabla y usando la combinacin original sembrada y la combinacin de tubos positivos, tendremos un valor *a que mediante la aplicacin de una frmula convencional permitir determinar el NMP de bacterias colifecales por 100 ml. Determinacin del NMP de bacterias intermedias aerogenes cloacae (IAC). De todos los tubos positivos del caldo Mac Conkey incubado a 37 C hacer repiques con ansa recta a tubos con medio Citrato de Koser e incubar a 37 C durante 48 Hs. Se utiliza ansa recta con el objeto de no llevar a los tubos con citrato, material nutritivo del cultivo original. Esto es importante, pues pequeas cantidades de peptona son suficientes para permitir el desarrollo de E. coli fecal y modificar por lo tanto los resultados del ensayo. Se consideran como positivos los tubos que presenten coloracin azul. Si el medio permanece verde, el ensayo se considera negativo. Si la coloracin es dudosa, pueden agregarse unas gotas de solucin de azul de bromotimol. El citrato es utilizado por las bacterias como nica fuente de carbono produciendo amonaco; esto hace que el pH aumente junto con el desarrollo microbiano y produce el viraje del indicador, lo que es originado nicamente por las bacterias del grupo IAC. Mediante el empleo de la tabla y usando la combinacin original sembrada y la combinacin de tubos positivos obtendremos un valor **b que mediante la aplicacin de una frmula convencional permite determinar el NMP de las bacterias del grupo IAC por 100 ml. Determinacin de Pseudomonas aeruginosa (NO LO HICIMOS). Pasar 100 ml de muestra por filtro Millipore y colocar sobre Agar Cetrimida. Utilizar otra placa como control de esterilidad del medio. Incubar a 37 por 24 horas. Para confirmar, observar las placas de Agar Cetrimida con exposicin a lmpara de luz UV (longitud de onda larga). Las colonias de Pseudomonas aeruginoasa se ven fluorescentes. Informar como Presencia o Ausencia. Luego realizamos las pruebas IMVIC. Son cuatro pruebas bioqumicas: Indol, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer y Citratos. Se emplean fundamentalmente para la identificacin de las Enterobacterias (bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos con metabolismo fermentador). Dependiendo de las condiciones, las enterobacterias, pueden realizar: Un metabolismo aerobio (si disponen de oxgeno), Una respiracin anaerobia (si hay nitratos u otro aceptor de electrones) Y distintas fermentaciones. El resultado de este test se expresa mediante cuatro smbolos de suma o resta (+ o -) segn el resultado de cada prueba, siguiendo siempre el orden establecido por las iniciales del mtodo.

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As por ejemplo, el IMViC de la bacteria Salmonella y Citrobacter es -+-+. Para E.coli es ++-- y para Klebsiella y Enterobacter es --++. Indol (I) Consiste en cultivar la especie en estudio en un caldo rico en triptfano; despus de 24-48 horas de crecimiento, se extrae el indol producido con un disolvente orgnico, como xileno, y se determina su presencia con reactivos especficos como el reactivo de Kovacs el que adquiere un color rojo en la prueba del indol positiva y Amarillo cuando es Negativa. Rojo de Metilo (M) El rojo de metilo es un indicador de pH. (Frmula: C15H15N3O2). Acta entre pH 4,2 y 6,3 variando desde rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Por lo tanto, permite determinar la formacin de cidos que se producen durante la fermentacin de un carbohidrato. Una reaccin positiva (ms o menos) indica que el microorganismo realiza una fermentacin acidolctica de la glucosa por la va cido-mixta, mientras que un color verde indica la va de oxidacin de 2,3 butanodiol. Voges-Proskauer (VI) Permite determinar la formacin de acetil metil carbinol (AMC), el que es un producto intermediario de la fermentacin que conduce a la formacin de 2,3 butanodiol y que caracteriza a ciertas especies de las Enterobacteriaceae, por lo que indicar que la glucosa es fermentada por la va butanodilica. Citrato (C) Sirve para determinar si un microorganismo puede crecer utilizando citrato como nica fuente de carbono. Se hace crecer la bacteria en caldo citrato. Un resultado positivo es cuando se observa turbidez en el tubo, debido al crecimiento bacteriano. Un resultado negativo es

Grupos Escheriquia Coli IAC

INDOL

ROJO DE METILO

VOGES PROSKAUER

CITRATO SIMON

+ -

+ -

12- Una muestra de agua de ro dio los siguientes resultados: Anlisis cuantitativo: se realiza una dilucin 1/100 y se siembra 1,0 ml de la misma en profundidad. Se cuentan 50 colonias. Cmo informara dicha muestra? NMP por esquema de Wilson:

Tubos positivos por Mac Conkey 37C Mac Conkey 44C Citrato de Koser 37C 10 ml 3 2 1 1,0 ml 1 1 1 0,1 ml 1 0 0

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Entonces al buscar en la tabla NMP y aplicar la dilucin 1/100 tenemos: CT (UFC/100 ml) = 7500. CF (UFC/100 ml) = 1500. IAC (UFC/100 ml) = 700. Entonces calculamos: IAC+CF= 2200. 700 CF ___________ 2200 X= 2386 CF ___________ 7500 1500 IAC ___________ 2200 X= 5114 IAC ___________7500 Por lo tanto tenemos por 1 Colonia: 7500 CT/100 ml. 2386 CF/100ml. 5114 IAC/100ml. Como contamos 50 Colonias tenemos: 375000 CT/100 ml. 119300 CF/100ml. 255700 IAC/100ml. De acuerdo a los resultados obtenidos, y basndose en la legislacin (ver punto 9 del cuestionario), el agua no es apta para el consumo.