Programa de Doctorado

"Gestin y Salud Ambiental Curso 2010-11

Tcnicas de Laboratorio para la

Investigacin de los Efectos

Ambientales en los Seres Vivos

III PARTE: Introduccin a la Microscopa Electrnica.

III PARTE: Introduccin a la Microscopa Electrnica. Sesiones Tericas:
1. Introduccin a la Microscopa Electrnica. 1.1. Fundamentos de la Microscopa ptica y Electrnica. 1.2. Tipos de microscopios electrnicos. 1.3. Breve historia de la Microscopa Electrnica. 1.4. Aplicaciones. 1.5. Ejemplos. 2. Tratamiento de muestra para Microscopa Electrnica. 3. Tcnicas avanzadas de fijacin, inclusin y deteccin en Microscopa Electrnica de Transmisin.

Sesiones Prcticas:
1. Pre-tratamiento de muestra. 2. Obtencin de cortes ultrafinos para Microscopa Electrnica de Transmisin. 3. Observacin de muestras a Microscopio Electrnico de Transmisin.

1.1. Fundamentos de la microscopa ptica y electrnica.

Sistema de alto vaco

Esquema de una Bomba Rotatoria

Esquema de una Bomba Difusora

Analogas y diferencias entre microscopio ptico y electrnico

OPTICO
Fotones
220 voltios

ELECTRNICO
Electrones
20.000 voltios

Lentes de vidrio
Imagen por absorcin de luz

Lentes electromagnticas
Imagen por dispersin y prdida de e-

Lentes distancia focal fija: x4, x10, x20, x40, x60, x100
Visin directa por ojo humano Posibilidad de color Imagen mejor que foto Aprox 1.000 aumentos

Lentes con distancia focal variable

Visin por impresin en pantalla fluorescente Blanco y negro Foto mejor que imagen Hasta 450.000 aumentos

1.2. Tipos de microscopios electrnicos.

Pared celular

nucleolo
citosol TRANSMISIN Membrana nuclear ncleo

BARRIDO

Esquema y foto de un MET

Esquema y foto de un MEB

1.3. Breve historia de la Microscopa Electrnica.

1897 J. J. Thompson (P. N. Fisica 1906) anuncia la existencia de partculas cargadas negativamente, denominadas luego electrones. 1924 Louis-Victor de Broglie (P.N. Fisica 1930) propone que los electrones en movimiento tienen propiedades ondulatorias. 1926 Busch prueba que es posible enfocar un haz de electrones con una lente magntica cilndrica, estableciendo las bases de la ptica electrnica. 1931 Ernst Ruska (P.N. Fisica 1986) y colegas construyen el primer microscopio electrnico de transmisin. 1932 A.C. Van Dorsten (Philips Research Laboratories) comienza a estudiar las lentes magnticas. 1935 Max Knoll demuestra la factibilidad del microscopio electrnico de barrido; tres aos despus Von Ardenne construye un instrumento prototipo. 1939 Siemens produce el primer microscopio electrnico de transmisin comercial. 1942 Microscopio Electrnico de Transmisin de 400 kV desarrollado por Philips Research Laboratories. 1944 William and Wyckoff introducen la tcnica de sombreado metalico. 1945 Porter (P.N. Fisiologia y Medicina 1972), Claude (P.N. Fisiologia y Medicina 1974) y Fullam utilizaron el microscopio electrnico para examinar clulas en cultivo de tejidos luego de fijarlas y teirlas con tetrxido de osmio. 1946 Philips introduce su primer prototipo de microscopio electrnico comercial en Oxford. 1948 Pease y Baker preparan confiablemente secciones finas (0,1 a 0,2 mm de grosor) de material biolgico.

1950 H. Latta y J. F. Hartman introducen la cuchilla de vidrio para ultramicrotoma.

1952 Palade (P. N. Fisiologa y Medicina 1975) , Porter (P.N. Fisiologa y Medicina 1972), y Sjstrand desarrollan mtodos de fijacin y seccionamiento fino que permitieron ver por vez primera muchas estructuras intracelulares. En una de las primeras aplicaciones de estas tcnicas, H. E. Huxley demostr que los msculos esquelticos contienen un arreglo solapado de filamentos protenicos, apoyando la hiptesis de los filamentos deslizantes de la contraccin muscular. 1956 Glauert y asociados demuestran que la resina epxica Araldita era un agente de embebimiento altamente efectivo para microscopa electrnica. 1959 Singer utiliza anticuerpos acoplados a ferritina para detectar molculas en las clulas utilizando el microscopio electrnico. 1959 Brenner y Horne ampliaron la tcnica de tincin negativa, inventada cuatro aos antes por Hall, a una tcnica de uso general para la visualizacin de virus, bacterias y filamentos protenicos.

1961 Luft introdujo la resina de embebimiento Epn.

1963 Sabatini, Bensch y Barrnett introducen el glutaraldehido (usualmente seguido por tetrxido de osmio) como un fijador para la microscopa electrnica. 1965 Cambridge Instruments produce el primer microscopio electrnico de barrido comercial. 1966 Branton demuestra que la crio-fractura permite visualizar el interior de las membranas. 1968 de Rosier y Aaron Klug (P.N. Qumica 1982) describen las tcnicas para la reconstruccin tridimensional de estructuras a partir de micrografas electrnicas. 1975 Henderson y Unwin determinan la primera estructura de una protena de membrana mediante reconstruccin computacional de micrografas electrnicas de muestras no teidas. 1993 Se logra la resolucin de 1 en un Philips CM-200/300 en la Universidad de Tbingen.

1.4. Aplicaciones.
Microscopio electrnico de barrido:
- Geologa: Investigaciones geomineras, cristalogrficas, mineralgicas y petrolgicas. Estudio morfolgico y estructural de las muestras. - Estudio de materiales: Caracterizacin microestructural de materiales. Anlisis cristalino. Valoracin del deterioro. Tipo de degradacin. - Metalurgia: Control de calidad y estudio de fatiga de materiales. - Odontologa: estructura del esmalte y deterioro. - Paleontologa y Arqueologa: Caracterizacin de aspectos morfolgicos. - Control de Calidad: Fibras, curtidos, etc. - Peritajes: Estudios de muestras de cualquiera de las reas antes mencionadas. - Medicina Forense: Anlisis morfolgico de pruebas. - Biologa (botnica), Biomedicina y Medicina: Estudio morfolgico. - Estudio qumico y estructural de obras de arte, alteracin de monumentos, calidad, identificacin de pigmentos (restauracin, autentificacin)

Control de calidad: lana o fibras especiales (mohair o Kashmir)

Imagen de la rotura de una varilla de acero obtenida mediante un Microscopio Electrnico de Barrido.

Ejemplos

Diatomea

Torno de dentista

Velcro

Cristal de nieve

1.4. Aplicaciones.
Microscopio electrnico de transmisin:
- Investigacin en Ciencias Biolgicas. (Tamao del objeto) - Diagnstico de enfermedades de origen microbiano. Ejemplo: diagnstico

rpido de enfermedades vricas que proporciona la respuesta mucho antes que los
mtodos de cultivo tradicionales. - Ciencia de los materiales y metalurgia.

1.5. Ejemplos:

Microscopio Electrnico de Barrido y ptico Lavandula latifolia (alhucema o espliego)

1.5. Ejemplos:

Microscopio Electrnico de Transmisin y Barrido Biologa Celular

2. Tratamiento de muestra para Microscopa electrnica.

Microscopa Electrnica de Barrido

1.- Fijacin.

2.- Deshidratacin (punto crtico).

3.- Metalizacin (ion sputtering).

2. Tratamiento de muestra para Microscopa electrnica.

Microscopa Electrnica de Transmisin

1.- Fijacin.

2.- Post-fijacin.
3.- Deshidratacin 4.- Inclusin en resina (polimerizacin) 5.- Corte (ultramicrotomo) 6.- Tincin con metales.

Microscopios disponibles en la Universidad de Huelva

Microscopio electrnico de barrido (SEM-EDS). JEOL JSM 5410. El microscopio electrnico de barrido con detector de energa
dispersiva (SEM-EDS) permite obtener imgenes microscpicas de minerales, polen, y tejido vegetal y animal. A travs del detector EDS adems se puede realizar microanlisis (en un punto de 2 m de tamao) de elementos mayoritarios. Adems de imgenes de electrones secundarios (SEI) se puede obtener imgenes de electrones retrodispersados (BSEI) los cuales informan sobre las variaciones composicionales internas de la muestra.

Microscopios disponibles en la Universidad de Huelva

Microscopio electrnico ambiental (ESEM): FEI modelo Quanta 200.
Voltaje de aceleracin de 0,2 Kv. a 30 Kv. Tres modos de operacin:Alto vaco (modo convencional), bajo vaco (< 1.3 mbar) y ultra alto vaco (<26 mbar). Resolucin de 3,5 nm (en los tres modos de operacin). Sistema de Microanlisis por Dispersin de Energa de Rayos-X EDAX. Resolucin de 135 ev (Ka del Mn). Elementos analizables desde el B al U. Aplicaciones

En el campo de ciencias de los materiales.

En el Sector Agroalimentario. En geologa, minera, metalografa,... En ciencias biolgicas. Control de procesos industriales - Control de calidad.

Microscopios disponibles en la Universidad de Huelva

Microscopio electrnico de transmisin (TEM):
Voltaje de aceleracin de 40 Kv a 100 Kv. Resolucin en imagen puntual de 0,4 nm. Resolucin en imagen estructural de 0,2 nm. Rango de aumentos hasta 600.000 X. Equipado con cmara digital MEGAVIEW III y software de anlisis de imagen. Aplicaciones Ciencias Biolgicas y en el campo de la Cristalografa. Ciencias de los Materiales. TEM JEOL modelo JEM 1011.

Diseo de un experimento con microscopa electrnica

MTODO CIENTFICO: -Observacin. - Formulacin de Hiptesis. - Experimentacin. - Emisin de Conclusiones. Observacin: Los cientficos se caracterizan por una gran curiosidad y el deseo de conocer. Cuando un cientfico encuentra un hecho o fenmeno interesante lo primero que hace es observarlo con atencin. La Observacin consiste en examinar atentamente los hechos y fenmenos que tienen lugar en la naturaleza y que pueden ser percibidos por los sentidos.

Formulacin de hiptesis: Despus de las observaciones, el cientfico se plantea el cmo y el porqu de lo que ha ocurrido y formula una hiptesis. Formular una hiptesis consiste en elaborar una explicacin provisional de los hechos observados y de sus posibles causas. Experimentacin: Una vez formulada la hiptesis, el cientfico debe comprobar si es cierta. Para ello realizar mltiples experimentos modificando las variables que intervienen en el proceso y comprobar si se cumple su hiptesis. Experimentar consiste en reproducir y observar varias veces el hecho o fenmeno que se quiere estudiar, modificando las circunstancias que se consideren convenientes. Durante la experimentacin, los cientficos acostumbran a realizar mltiples medidas de diferentes magnitudes fsicas. De esta manera pueden estudiar qu relacin existe entre una magnitud y la otra. Emisin de conclusiones: El anlisis de los datos experimentales permite al cientfico comprobar si su hiptesis era correcta y dar una explicacin cientfica al hecho o fenmeno observado. La emisin de conclusiones consiste en la interpretacin de los hechos observados de acuerdo con los datos experimentales. A veces se repiten ciertas pautas en todos los hechos y fenmenos observados. En este caso puede enunciarse una ley. Una ley cientfica es la formulacin de las regularidades observadas en un hecho o fenmeno natural. Por lo general, se expresa matemticamente. Las leyes cientficas se integran en teoras. Una teora cientfica es una explicacin global de una serie de observaciones y leyes interrelacionadas.