Analiza cromozomilor umani

Citogenetica
Studiul cromozomilor si a anomaliilor

cromozomiale: - in metafaza /interfaz (FISH) - Normal 46 cromozomi: 22 perechi cromozomi somatici +2 cromozomi sexuali XX sau XY

Citogenetica
1/3 din sarcini sunt avortate spontan

50% din avorturile de trim I au ca etiologie o

anomalie cromozomial 1% din n.n. vii sunt purttori ai unei aberaii cromozomiale

Prezena a 3 sau mai multe avorturi spontane

analiza cromozomilor la genitori

Cariotip ordonarea cromozomilor metafazici n funcie de mrime, poziia centromerului , prezena constriciilor secundare i a sateliilor i a altor caracteristici morfologice

Metode de cariotipare
Tipuri de esuturi utilizate
ft/embrion: amniocentesis biopsia de viloziti coriale

Adult : snge periferic (limfocite) celule din mucoasa bucal fibroblaste celule din mduva osoas

Metode de cariotipare
5 ml of snge recoltat pe heparin.
/10ml lichid amniotic obinut prin amniocentez. Etap de centrifugare n vederea obinerii unui sedimrnt celular Cultivarea celulelor pe medii de cultur speciale n prezena antibioticelor i a unor stimulente mitotice (fitohemaglutinina). Oprirea diviziunilor celulare n metafaza prin adugarea colchicinei (distruge fusul de diviziune). Etape de fixare i hipotonizare. Colorarea preparatelor metafazice i vizualizarea lor la microscopul optic.

Prepararea cariotipului

Metode de cariotipare
cultivarea celulelor pt.48-72h zile oprirea diviziunilor in metafaz cu colchicin ; distrugerea celulelor cu soluii fixator.

metaphase

 Cromozomii metafazici sunt numerotai de

la 1-22 n ordinea descresctoare a taliei
Braul scurt p Centromer

q (braul lung)

Centromerul
Centromerul conine o secvena de 171pb repetat de 100000 ori denumit secven alpha satelit

 Telomere :
Extremitile cromozomilor Repetiii TTAGGG Subtelomerele conin secvene repetate variabile

Metode de bandare
Se folosesc preparatele cromozomiale obinute prin tehnica
clasic Cromozomii sun supui unor tratamente termice,cu acizi/baze/tratamente enzimatice i colorai cu diferii colorani.

Metode citogenetice clasice Metoda de bandare G Soluie Giemsa; evideniaz

heterocromatina, regiunile de ADN bogate n G-C Bandarea Q subsane fluorescente (Fluoresceina) Bandarea R benzi de reversie benzilor G; evideniaz telomerele i eucromatina Bandarea C-pt zona centromeric Bandarea NOR pt regiunile organizator nucleolar de la nivelul constriciilor secundare ale cromozomilor acrocentrici.

Cariotipare molecular Fluorescence In Situ Hybridization (FISH)

Bandarea G a cromozomilor

Modelul de benzi este cromozomspecific

10

11

12

13

14

15 16

17 18 19

20

21

22

Aranjarea cromozomilor in cariotip

Clasificarea cromozomilor n funcie de poziia centromerului

Submet acent ric Met acent ric

Acroc ent ric

Se vizualizeaz 350-400 benzi dac se folosesc cromozomi metafazici i respectiv 800 benzi dac se folosesc cromozomi n prometafaz

Metode de bandare
Clasificarea
cromozomilor n funcie de: 1. talie 2. pattern de bandare 3. poziia centromerului

Clasificarea cromozomilor

02_15.jpg

Metode de bandare
Numerotarea cromozomilor de la 122+X/Y Fiecare bra este mprit n regiuni a cror numerotare se face de la centromer ctre extremiti Fiecare regiune n benzi a cror numerotare se face de la centromer ctre extremitile regiunii

Examplu-1q24.

cromozomul 1, braul q, regiunea 2, banda 4

Heterochromatin vs Euchromatin

Stabilirea poziiei unor gene pe cromozomi

Gena intoleranei la

glucoz se afl pe 3q26

FISH

Proba locus-specific hibridizeaz cu o secven unic de pe un anumit cromozom. Proba este marcat prin ncorporarea n structura unui anumit nucleotid (Ex: timina) a unei subsrane flurescente (fluorescein, Texas-red, rodaminetc.). Numrul punctelor fluorescente dintr-o metafaz indic indic numrul punctelor de hibridizare.

Etapa 1: denaturarea dublului helix al ADN-ului probei i al cromozomilor metafazici /interfazici n vederea obinerii de monocatene prin nclzire la temperaturi ridicate ntr-o soluie de formamid.

Etapa 2- se adug proba peste lama cu cromozomii metafazici obinui prin tehnica clasic. Lama se acoper cu o lamel pentru a mpiedica evaporarea i se introduce la incubator la 37C n vederea obinerii unei reacii de hibridizare prob-secven monocatenar cromozomial .

FISH Probes
telomere

centromere whole chromosome paint locus

FISH

Cromozomii metafazici sunt colorai cu DAPI, o substan fluorescent ce se leag de ambele catene de ADN

Sindroame de Microdeleie: probe locus Specifice

-diagnosticul microduplicaiilor /translocaiilor

Test FISH pt. a stabili rapid prezena unei aberaii numerice

Cei 3 cromozomi 21 sunt vizualizai cu probe marcate cu rou iar cromozomii 13 cu verde.

Identificarea sindromelor de microdeleie utiliznd probe-control.

William's Syndrome

Normal Karyotype

Williams del(7q11)

normal

Prader-Willi del(15q12)

Diagnosticul sindroamelor de microdeleie

Aneuploidy
Wolf Hurshorn Cri du Chat Williams Retinoblastoma Angelman Prader-Willi Miller-Dieker Smith-Magenis DiGeorge/VCF STS SRY Kallmans Sex Subtelomeres M-FISH

13, 18, 21, X and Y

4p5p7q2213q1415q1215q1217p13- Probe pt sdr. De Microdeletie 17p1122q11Xp22.3Xp22.3Xp22.3X and Y (46 probes) 23 chromosomes paints

Centromere for X chromosome 48,XXXX

FISH: Fluorescent IN SITU hybridization

green = probe for end of chromosome 4

red = control probe for centromere of the X chromosome & another probe for end of chromosome X

 Translocatii

Figure 8.23Bx

Metoda FISH pe nuclei interfazici

Se folosesc probe oligonucleodidice marcate fluorecent pt. diagnosticul aneuplidiilor cromozomilor 13, 18, 21, X, si Y

Nuclei de la acelasi produs de conceptie verde = cromozomul 13 rosu= cromozomul 21 bleu = cromozomul 18 verde = X rosu = Y

FISH cu probe marcate coresumztoare cromozomului Y Cromozomi metafazici i interfazici

FISH pe nuclei interfazici cu probe pt X marcate cu verde i pt Y marcate cu rou. Prezena de mozaicisme

Diagnosticul genetic prenatal prin metoda FISH

M-FISH (SKY)

Cromozomul"Philadelphia " Translocatie 9:22

CML

Philadelphia translocation

Relatively good prognosis in CML Relatively poor prognosis in ALL Additional chromosome changes: +8, iso(17q), +19,+Ph1, - blast crisis = poor prognosis

Indicatii clinice pentru analiza cromozomilor

Deficitul cresterii pre-/postnatale Avort spontan/n.n. mort Sterilitate/infertilitate Istoric familial de rearanjament

cromozomial Valori anormale ale markerilor serici materni/anomalii fetale depistate ecografic Neoplazii