Qualitativo: + ou Semi-quantitativo: amostra testada foi diluda a maior diluio que apresentar reao o seu ttulo (ex.

ex. + ate a diluio 1:320) Quantitativo: informa quantidade absoluta do material detectado.

IMPORTANTE : Finalidade do teste 1.Triagem 2.Diagnstico

Afinidade Avidez Taxas Ag-Ac Reaes Cruzadas

Anticorpos: Monoclonais Policlonais

Afinidade
Fora de ligao do Ag com o Ac, em um nico stio. Quanto maior a afinidade entre Ac e Ag, menos Ac ser necessrio

Avidez: fora total de ligao, em dois ou mais

stios.

Todos os testes baseados nas reaes Ag\ Ac,devero depender da formao de malha ou tero que utilizar formas de detectar complexos imunes pequenos. Todos os testes baseados nas reaes Ag\Ac podem ser utilizados para detectar tanto Ag quanto Ac.

Tcnicas sem uso de marcadores

Reaes de Precipitao Reaes de Aglutinao Dependem de formao de malhas

Tcnicas com uso de marcadores

ELISA Citometria de fluxo Imunofluorescncia Radioimunoensaio No dependem da formao do latex

 PRECIPITAO - Imunodifuso dupla - Imunodifuso radial - Imunoeletroforese AGLUTINAO - Aglutinao direta e indireta - Inibio da aglutinao - Teste de Coombs IMUNOENSAIOS - Radioimunoensaio - ELISA - Imunofluorescncia - Citometria de Fluxo

PRECIPITAO X AGLUTINAO

ZONA DE EQUIVALNCIA

EFEITO PR - ZONA

EFEITO PS - ZONA

IMUNODIFUSO DUPLA
Utiliza uma matriz de gar Ag + Ac = linha de precipitao visvel

Possui baixa sensibilidade ; demorado (18-24 hrs)

 Coloca-se agarose sobre uma lmina: Faz-se em seguida, pequenos orifcios no gel e so adicionadas as solues testes de Ag e Ac, como por exemplo, mostrado abaixo:

Ac

As solues sofrem difuso e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalncia, se observa a reao pela formao de uma linha de precipitao Pode ser visualizada ps lavagem do gel , para remoo das protenas solveis, por colorao dos arcos de precipitao com corante
Ag Ag

Ac Ag Ag Ag Ag

Ac

Ac

Utilizao da tcnica : caracterizar antigenos em processos infecciosos ou anticorpos em doenas auto-imunes

 Mtodo de Mancini
Anticorpo no gel

Ac no gel
Ag Ag Ag Ag

Antgeno no poo Vice-versa

Interpretao
Diameter2

Dimetro do anel proporcional concentrao do Ag

Ag Concentrao

Fcil, baixo custo Utiliza uma matriz de gar quantitativa

Utilizao: dosagem de IgG, IgA e IgM e protenas sricas

Pode-se fazer comparao de misturas complexas de Ag que so separados em gel de agarose, pela aplicao de uma corrente eltrica. As molculas migram para o plo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas eltricas. Uma canaleta recortada entre os poos e preenchida com Ac, que se difunde. Ag e Ac formam arcos de precipitao. qualitativo Utiliza lminas recobertas com gar
1- Separao de antgenos
Ag

2na coluna 2-Anti-soro Anti-soro na canaleta

canaleta

+
Ag

3- Difuso e precipitao

til para detectar gamopatias monoclonais, como mieloma mltiplo e a macroglobulinemia

 Pode ser direta ou indireta + sensveis qtidade de Ac 500 vezes menorpartculas amplificam a reao Ttulo: maior diluio que ainda causa aglutinao (semiquantitativo)
Eritrcitos Bactrias Fungos ltex

Agregao visvel de partculas

USO: Tipagem ABO

Testes confirmatrios para sfilis, FR

AGLUTINAO DIRETA
Partculas que apresentam determinantes antignicos naturais na sua superfcie
Hemcias Bactrias Protozorios

Ac

= Aglutinao

Exemplo: tipagem sangunea em lminas (sistema ABO)

1) Amostra de sangue na placa teste: 3) Controle negativo:

2) Reagente (anticorpo anti A, B):

4) Mistura-se:

AGLUTINAO DIRETA
5) Leitura do resultado:

Um resultado positivo indicado por uma aglutinao visvel (aglomerao dos eritrcitos na
negativo positivo

placa teste);

AGLUTINAO INDIRETA (PASSIVA)

Ags solveis associados a outras superfcies (Partculas de ltex ou superfcie de hemcias)

Exemplo: Hemaglutinao Passiva para a Doena de Chagas:

As hemcias so revestidas com Ag do T. cruzi (ligao covalente) e ento distribudas nos poos da placa. O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente diludos, so adicionados aos poos da referida placa. Se houver Ac especfico contra o Ag, as hemcias se aglutinam e formam uma camada no fundo do poo. Quando no existe Ac especfico, as clulas formam um boto no fundo do poo.

Aglut + Aglut -

TESTE DE COOMBS (Antiglobulina)

DIRETO : Detecta Ac ligados a eritrcitos

INDIRETO: Detecta Ac anti-eritrcitos no soro

1.Permite detectar incompatibilidade Rh - DHRN (me produz IgGantiRh). 2.R. medicamentosa 3.R. transfusional

INIBIO DA AGLUTINAO
Teste baseado na inibio da aglutinao devido a competio com antgeno solvel.

Resultado negativo:(ausncia de hCG na urina): ocorre aglutinao, pois os anticorpos anti-hCG no so bloqueados na incubao inicial, porque no havia o hormnio na urina. Livres, podem aglutinar as partculas revestidas de hCG. Resultado positivo: (presena de hCG na urina): no ocorre aglutinao.

Princpio da tcnica: Anticorpos ou antgenos so conjugados a um fluorocromo, que, quando excitado por radiaes UV, emite luz no espectro visvel. A reao feita em lminas de microscopia e a observao em um microscpio de fluorescncia Principais fluorocromos: fluorescena (isotiocianato de fluorescena FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina TRICT).
IFA direta: Deteco direta de microrganismos em secrees, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Tambm utilizada na fenotipagem de clulas tumorais, e doenas imunolgicas renais e de pele. IFA indireta: pesquisa de antgenos ( plasmdio em hemcia) e de anticorpos ( sfilis, toxoplasmose, rubola, citomegalovrus, vrus herpes simples, doena de chagas, malria, etc)

IMUNOFLUORESCNCIA DIRETA

IMUNOFLUORESCNCIA INDIRETA

Treponema pallidum

Tripanosoma cruzi

Pneumocystis carinii

Giardia lamblia

 Separao de clulas marcadas por fluorescncia; Anticorpos dirigidos contra molculas de membrana ou Antgenos do Conjunto de Diferenciao (CD) Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente. um teste qualitativo e quantitativo. Ferramenta que detecta e quantifica clulas individuais passando em uma corrente atravs de um feixe de Laser.
CD 18 CD 4

CD 125
CD 147

 SISTEMA FLUIDO: INTRODUZ E ALINHA AS PARTCULAS EM UM FLUXO CONTNUO SISTEMA PTICO: GERA E COLETA OS SINAIS DE LUZ. SISTEMA ELETRNICO: CONVERTE OS SINAIS PTICOS EM SINAIS ELETRNICOS, DISPONIBILIZANDO-OS PARA ANLISE NO COMPUTADOR.

CD4

CD8

CD20

USO Determinar o tipo e no de cls. sanguneas brancas Isolar populaes celulares Quantidade, tamanho, granulosidade; Distribuio de cls de acordo com a densidade dos Ags Tamanho celular.

APLICAES CLNICAS DA CITOMETRIA DE FLUXO

- Anlise da subpopulao linfoctica - Diagnstico e acompanhamento de leucemias e linfomas, HIV - Diagnstico e acompanhamento de mieloma mltiplo - Deteco de clulas neoplsicas no-hematopoiticas - Anlise de reticulcitos - Deteco de anticorpos antiplaquetrios

- Quantificao de clulas progenitoras (Stem cells)

- Avaliao imunolgica de paciente transplantado

 O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas. O produto final ao da enzima sobre o substrato = COR Produto final corado leitura em fotocolormetro. Principais tipos de ELISA: indireto, direto e competitivo. Direto = Ag Indireto = Ac
Vantagens do ELISA: -Utiliza reagentes estveis -Teste de alta sensibilidade -Seguros e de baixo custo -No trabalha com radioistopos -pode ser adaptado tanto a testes simples quanto automao -No depende de formao de precipitado, aglutinado, etc.

Ensaio Imunoadsorvente Ligado Enzima - ELISA

Ac marcados
com Enzimas Fosfatase alcalina Peroxidase B-galactosidase

Ag

substrato

COR

Qualitativos Quantitativos

INDIRETO

DIRETO OU SANDUCHE

Ponte de corte ( cut-off) : o limiar de reatividade; define o limite entre um teste negativo e um teste positivo

Molculas marcadas com istopo ( I 125 ,I 131 ) Marcaes: I125: emite raios gama H3: raios beta Desvantagem manipulao de istopo radioativo.

RADIOIMUNOENSAIO

Aplicaes: Triagem vrus da hepatite B em doadores de sangue, Hormnios, protenas sricas, drogas (urina ou soro de atletas), etc.

Vantagens: Alta sensibilidade Permite medidas rpidas e precisas Limiar de deteco em nanogramas e picogramas. Desvantagens: Custo Vida mdia dos reagentes Risco operacional (radiao)

FIM