TUGAS TEKNIK ANALISA BIOMOLEKULER RESUME PCR ( POLIMERASE CHAIN REACTION )

Min Rahmatillah (115130100111056) 2011 C

PROGRAM KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2013

Polymerase Chain Reaction ( PCR) adalah proses penggandaan DNA secara in vitro dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target. Reaksi PCR dibantu oleh enzim polimerase dan oligonukleotida yang berperan sebagai primer dan terjadi dalam thermocycler. Primer terbagi dua yaitu primer forward ( primer yang berada sebelum target ) dan primer reverse (primer yang berada setelah target). Antar primer terdapat puluhan hingga ribuan nukleotida yang menandakan panjang target DNA. Selain enzim polimerase, dibutuhkan dNTPs yang terbagi dATP (nukleotida berbasis Adenin), dCTP (nukleotida berbasis Sitosin) dan dTTP (nukleotida berbasis Timin). Tujuan PCR adalah untuk mempercepat isolasi DNA spesifik tanpa membuat dan melakukan pustaka genom. Penggunaan PCR dilakukan pada pengidentifikasian hasil forensik, pengidentifikasian orang tua anak, dan perbanyakan molekul DNA dalam jumlah yang banyak dan waktu yang singkat. Tipe dan Modifikasi dari PCR adalah sebagai berikut : A. Nested PCR 1. Pengertian Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan ( replikasi ) sampel DNA menggunakan bantuan enzim DNA polymerase yang menggunakan dua pasang primer untuk mengamplifikasi fragmen. Pasangan primer yang pertama akan mengamplifikasi fragmen yang cara kerjanya mirip dengan PCR pada umumnya. Sedangkan, pasangan primer yang kedua biasanya disebut nested primers ( sepasang primer tersebut terletak didalam fragmen pertama ) yang berikatan didalam fragmen produk PCR yang pertama untuk memungkinkan terjadinya amplifikasi produk PCR yang kedua dimana hasilnya lebih pendek dari yang pertama. Dengan menggunakan nested PCR, jika ada fragmen yang salah diamplifikasi maka kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya oleh primer yang kedua sangat rendah. Dengan demikian, nested PCR adalah PCR yang sangat spesifik dalam melakukan amplifikasi. 2. Mekanisme Kerja Prinsip kerja nested PCR tidak jauh berbeda dengan PCR biasa, namun nested PCR akan bekerja menggunakan dua pasang primer untuk mengamplifikasi fragmen DNA melalui dua proses PCR secara terpisah. Pertama-tama DNA mengalami denaturasi lalu memasuki fase penempelan, di mana sepasang primer pertama melekat di kedua utas tunggal DNA dan mengamplifikasi DNA di antara kedua primer tersebut dan terbentuklah produk PCR pertama. Kemudian produk PCR pertama tersebut dijalankan pada proses PCR kedua di mana

pasangan primer kedua (nested primer) akan mengenali sekuen DNA spesifik yang berada di dalam fragmen produk PCR pertama dan memulai amplifikasi bagian di antara kedua primer tersebut. Hasilnya adalah sekuens DNA yang lebih pendek daripada sekuens DNA hasil PCR pertama. B. Real Time PCR 1. Pengertian Berbeda dengan PCR nested, pada real-time PCR tahap deteksi dan tahap penggandaan materi genetik dilakukan secara bersamaan (simultan). Hal ini menawarkan beberapa keunggulan yaitu: deteksi produk PCR dilakukan pada fase eksponensial sehingga hasil yang diperoleh berada pada rentang daerah dengan presisi hasil tinggi. Selain itu, deteksi dilakukan menggunakan pelacak bertanda fluoresense. Pelacak adalah reagen yang menentukan kespesifikan hasil. Penggunaan fluoresense dalam tahap deteksi menawarkan sensitivitas yang tinggi. Dengan demikian, real time PCR menawarkan sensitivitas yang tinggi dan rentang linearitas yang cukup luas sehingga hasil penentuan kandungan DNA atau RNA di dalam spesimen menjadi sangat akurat. Contoh produk komersial yang menggunakan real time PCR yaitu Cobas Taqman. 2. Real-time PCR dalam diagnosa klinik Real-time PCR atau RT-PCR (jika materi genetik berupa RNA) dapat digunakan untuk penentuan kandungan DNA virus (misalnya virus hepatitis B) dan RNA virus (misalnya virus hepatitis C). Penentuan kandungan DNA atau RNA virus sangat dibutuhkan untuk pemantauan dan penentuan waktu yang tepat memulai pengobatan. Pemantauan pengobatan diperlukan untuk mengetahui apakah obat telah bekerja dengan baik atau tidak. C. Reverse Transcriptase PCR Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) adalah varian dariPolymerase Chain Reaction (PCR), teknik laboratorium yang biasa digunakan dalam molekuler biologi untuk menghasilkan banyak salinan sekuen DNA, suatu proses yang disebut amplifikasi. Pada RT-PCR, untai RNA ditranskripsi balik ke dalam DNA komplemen (DNA komplementer, atau cDNA) menggunakan enzim reverse transkriptase, dan cDNA yang dihasilkan diperkuat menggunakan input atau real-time PCR.

RT-PCR menggunakan sepasang primer, yang melengkapi urutan yang ditetapkan pada masing-masing dari kedua untai cDNA. Primer ini kemudian diperpanjang oleh enzim DNA polimerase dan salinan dari rantai tersebut dibuat setelah setiap siklus, menuju logaritmik amplifikasi. RT-PCR mencakup tiga langkah utama, dapat dijelaskan sebagai berikut:
1. Transkripsi balik (RT), di mana RNA ditranskripsi balik untuk cDNA menggunakan

enzim reverse transcriptase dan primer. Langkah ini sangat penting dalam rangka untuk melakukan polimerisasi DNA. Langkah RT dapat dilakukan baik dalam tabung yang sama dengan PCR (one step PCR) atau dengan memisahkan satu (two step PCR) menggunakan suhu antara 40 C dan 50 C, tergantung pada sifat-sifat reverse transcriptase digunakan. One Step PCR yaitu enzim reverse transcriptasedigabung dalam satu tube bersama reagen-reagen PCR, sedangkan untuk two stepPCR , proses transkipsi balik dan amplifikasi dilakukan secara terpisah. 2. Langkah selanjutnya melibatkan denaturasi dari dsDNA pada 95 C, sehingga kedua untai primer terpisah dan dapat mengikat lagi pada suhu yang lebih rendah dan memulai reaksi berantai baru. Kemudian, suhu menurun hingga mencapai temperatur anil yang dapat bervariasi tergantung pada set primer yang digunakan, konsentrasi sampel, dan konsentrasi kation. Pertimbangan utama, tentu saja, ketika memilih temperatur anil optimal adalah temperatur leleh (Tm) dari primer dan probe (jika digunakan). Anil suhu yang dipilih untuk PCR langsung tergantung pada panjang dan komposisi primer. Ini adalah hasil dari perbedaan ikatan hidrogen antara AT (2 obligasi) dan GC (3 obligasi). Anil temperatur sekitar 5 derajat di bawah temperatur terendah dari sepasang primer biasanya digunakan. 3. Langkah akhir amplifikasi PCR DNA perpanjangan dari primer. Hal ini dilakukan dengan DNA polimerase Taq tahan panas, biasanya pada suhu 72 C, suhu di mana enzim bekerja secara optimal. Panjang inkubasi pada setiap suhu, perubahan suhu, dan jumlah siklus dikendalikan oleh pengendara sepeda diprogram termal. Analisis produk PCR tergantung pada jenis PCR diterapkan. Jika PCR konvensional digunakan, produk PCR dideteksi dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa dan ethidium bromida (atau lainnya menodai asam nukleat). D. Multiplex PCR

Multiplex PCR merupakan beberapa set primer dalam campuranPCR tunggal untuk menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yangspesifik untuk sekuens DNA yang berbeda. Dengan penargetan gensekaligus, informasi tambahan dapat diperoleh dari lari-tes tunggal yangtidak akan membutuhkan beberapa kali reagen dan lebih banyak waktuuntuk melakukan. temperatur Annealing untuk masing-masing set primerharus dioptimalkan untuk bekerja dengan benar dalam reaksi tunggal, danukuran amplikon. Artinya, panjangnya pasangan basa harus berbeda cukup untuk membentuk band yang berbeda ketika divisualisasikan dengan elektroforesis gel. E. PCR ELISA PCR-ELISA merupakan metode yang digunakan untuk menangkapasam nukleat yang meniru prinsip dari enzim linked immunosorbant yangterkait. Dimana dalam sebuah pengujian hibridisasi hasil produk dari PCRakan terdeteksi dengan metode ini. Dengan metode inilah dapat dilakukanpengukuran sequen internal pada produk PCR. Metode ini lebih dipilihkarena lebih murah dibandingkan metode Real Time PCR.PCR-ELISA telah digunakan sejak akhir 1980-an dan telahberkembang untuk mendeteksi sequen tertentu dalam produk PCR. Meskipun banyak metode yang tersedia untuk mendeteksi sequentersebut, ELISA PCR berguna untuk mendeteksi dan membedakan antarabeberapa sasaran dari sequen yang diinginkan. ELISA PCR ini jugaberguna untuk screening beberapa sampel, terutama bila jumlah sampeltidak menjamin. Salah satu aspek yang paling berguna dari PCR-ELISAadalah kemampuannya dalam membedakan antara produk reaksi perubahan polimerase yang dihasilkan dari seperangkat primer yang mengandung variasi sequen, yaitu sequen yang bervariasi antar primer.

RESUME JURNAL : PENEGUHAN DIAGNOSIS PENYAKIT NEWCASTLE DISEASE LAPANG PADA AYAM BURAS DI BALI MENGGUNAKAN TEKNIK RT-PCR Penelitian ini bertujuan untuk mendiagnosis kasus Newcastle disease ( ND ) lapangan pada ayam bukan ras yang bersifat akut melalui hasil pemeriksaan di Laboratorium Patologi dan Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana tahun 2008-2009. Sampel diambil dari organ yang mengalami perubahan patognomonis seperti pada proventrikulus, ventrikulus, seka tonsil, paru-paru dan otak. Perbanyakan virus menggunakan telur ayam bertunas (TAB) umur 10 hari melalui ruang alantois dan diinkubasikan pada inkubator telur suhu 37 C selama 3 hari. Koleksi cairan alantois dilakukan pada hari ke-3, selanjutnya diidentifikasi dengan uji serologi hemaglutinasi (Haemaglutination-Inhibition Test/HA/HI) dengan teknik mikrotiter baku dan dikonfirmasi dengan uji reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) menggunakan primer FNDIFP (5-CCCCGTTGGAGGCATAC-3) dan FNDIBP (5-TGTTGGCAGCATTTTGATTG-3). Hasil penelitian menunjukkan bahwa semua sampel kasus ayam bukan ras yang diperiksa positif terinfeksi oleh virus penyakit ND akut. Kajian ini mengindikasikan bahwa penyakit ND di Bali masih bersifat endemis. A. Materi dan Metode

1. Koleksi dan Perlakuan Sampel

Digunakan sepuluh ekor ayam buras umur 1,5 4 bulan Diagnosis sementara penyakit ND didasarkan atas gejala klinis dan perubahan patologi anatomi yang bersifat patognomonis. Sampel diambil dari organ-organ yang mengalami perubahan meliputi: proventrikulus, ventrikulus, usus, seka tonsil, paru-paru, dan otak. Semua sampel digerus untuk dijadikan suspensi dengan konsentrasi 10% dalam larutan phosphat buffered saline (PBS) steril, ditambah antibiotik dan disuntikkan pada ruang alantois telur ayam bertunas (TAB) umur 9 hari. Telur diinkubasikan pada inkubator suhu 37 C selama 2-3 hari. Cairan alantois dikoleksi dan digunakan sebagai sumber antigen. 2. Uji Hambatan Hemagliutinasi Uji HI bertujuan untuk mengkonfirmasi virus ND menggunakan plat mikro berbentuk U dengan 96 sumuran. Proses tersebut dilakukan dengan 2 kali ulangan berdasarkan prosedur baku (OIE, 2009). Sebanyak 0,025 ml PBS diteteskan ke dalam sumuran ke2 sampai ke-12. Sumuran pertama dan kedua diisi dengan serum standar ND kemudian diencerkan secara berseri kelipatan dua mulai dari sumuran ke-2 sampai ke-11 dengan pengencer mikro. Masing-masing sumuran plat mikro ditambahkan dengan 0,025 ml suspensi antigen ND 4 unit HA mulai dari sumuran nomor 1 sampai nomor 11. Sumuran nomor 12 hanya diisi dengan PBS sebanyak 0,025 ml. Tahapan berikutnya adalah dilakukan pengayakan selama 30 detik, selanjutnya plat mikro ditempatkan pada suhu kamar selama 30 menit. Suspensi sel darah merah konsentrasi 0,5% ditambahkan ke dalam sumuran ke-1 sampai ke-12 sebanyak 0,05 ml lalu diayak kembali selama 30 detik. Plat mikro ditempatkan pada suhu kamar dan diamati setiap 15 menit. 3. Uji RT PCR Amplifikasi RT-PCR dilakukan dengan menggunakan enzim SuperScript TM III onestep RT-PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen). Siklus RT-PCR dilakukan dengan kondisi 50 C selama 1 jam, 95 C selama 7 menit, 94 C selama 45 detik, 52 C selama 45 detik, dan elongasi pada suhu72 C selama 1 menit 30 detik disebut satu siklus. Sikluspertama diulang kembali sebanyak 44 kali. Tahap

penyempurnaan kerja enzim dilakukan pada suhu 72 Cselama 5 menit untuk memperoleh fragmen yang sempurna. Sekuens primer yang digunakan FNDIFP (5CCCCGTTGGAGGCATAC-3) dan FNDIBP (5-TGTTGGCAGCATTTTGATTG3). Pengamatan hasil PCR dilanjutkan dengan melakukan elektroforesis. Sepuluh persen dari produk PCR ditambahkan loading dye (bromphenol-blue dan cyline cyanol) sebanyak 1 l, dan selanjutnya dielektroforesis pada gel konsentrasi 1%(1 gram agarose dalam 100 ml TAE) yang ditambahkan etidium bromide sebanyak 2,5 l bersama 100-bp ladder (Invitrogen) sebagai marker. Visualisasi DNA menggunakan transluminator ultraviolet (UV) dan hasilnya didokumentasikan dengan kamera dan filmpolaroid. B. Hasil dan Pembahasan Hasil isolasi pada TAB menunjukkan adanya pertumbuhan virus yang ditandai dengan kematian embrio pada hari ketiga disertai dengan perdarahan dan gangguan pertumbuhan (embrio kerdil). Cairan alantois TAB selanjutnya diidentifikasi dengan uji serologi HA/HI, sebagian menunjukkan hasil positif. Konfirmasi lebih lanjut terhadap hasil uji HA/HI yang negatif menggunakan uji RT-PCR, ternyata hasilnya positif. Hasil sekuensing menunjukkan bahwa virus tersebut merupakan virus ND lapang yang bersifat velogenik (data tidak ditunjukkan). Virus famili Paramyxoviridae mempunyai sifat dapat mengaglutinasi sel darah merah unggas. Proses hemaglutinasi terjadi akibat aktivitas hemaglutinin yang terdapat pada amplop virus tersebut. Aktivitas hemaglutinasi berlangsung maksimal selama satu jam karena dipengaruhi oleh kerja enzim neuraminidase yang merusak ikatan pada reseptor eritrosit dengan hemaglutinin dari virus famili Paramyxoviridae. Pada uji RT-PCR, genomik RNA virus ND diisolasi dari sampel dengan digesti proteinase K, diikuti dengan ekstraksi menggunakan trizol (Invitrogen), kemudian dielektroforesis untuk mengetahui panjang produk basa dari gen yang diuji. Uji RT-PCR tidak bersifat spesifik karena dapat digunakan untuk menguji semua antigen, namun uji tersebut bersifat sangat sensitif karena hanya memerlukan sampel antigen yang sedikit. Uji

RT-PCR mempunyai sensitivitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan uji HA/HI. Diagnosis secara molekular menggunakan teknik RT-PCR dan sekuensing dapat mendeteksi virus secara cepat dan akurat. Virus ND patogen mempunyai sekuens 112R/K-R-Q-R/K-R116 dengan C terminal dari protein F2 dan F (fenilalanin) yang merupakan residu pada posisi 117, sedangkan virus yang kurang patogen mempunyai sekuens 112 G/E-K/R-Q-G/E-R116 dengan L (leusin) pada posisi 117 (OIE, 2002). Hasil sekuensing isolat kasus ND lapangan kemudian dianalisis dengan Mega 4.0, maka gambaran phylogenetic tree akan menjawab kejadian penyakit ND yang bersifat endemik di Indonesia. C. Kesimpulan Berdasarkan hasil uji serologi HA/HI yang telah dikonfirmasi dengan uji RT-PCR maka semua sampel ayam buras yang diteliti adalah positif terinfeksi oleh virus penyakit ND. Kajian ini menegaskan bahwa kejadian penyakit ND di Bali masih bersifat endemis.