TESTES DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS

Antonia Maria de Oliveira Machado

Instituto Paulista de Doenas Infecciosas e Parasitrias Laboratrios
Setor de Microbiologia do Laboratrio Central - HSP - UNIFESP
O que testar?
Como interpretar?
Reproduo da
descoberta de Fleming
Reproduo da placa de Fleming para a
prova de sensibilidade aos antibiticos
Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos
A avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos representa
uma das tarefas mais importantes do laboratrio de
microbiologia.
O constante aparecimento de novos mecanismos
bacterianos de resistncia e novos antimicrobianos tornam
os testes cada vez mais complexos
necessrio uma atualizao constante dos protocolos e a
freqente implementao de novos testes e metodologias.
Microbiologistas, patologistas clnicos mdicos
assistentes so obrigados a uma atualizao constante
Evoluo Clnica
Microrganismo
Antimicrobiano
Paciente
Teste de
sensibilidade
Imunidade Farmacologia
Helio Sader - LEMC

TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS

METODOLOGIAS
Avaliao QUALITATIVA
- DISCO DIFUSO EM GAR
Avaliao QUANTITATIVA
- DILUIO EM CALDO
Macrodiluio
Microdiluio
- DILUIO EM AGAR
- AUTOMATIZADOS
- E TEST
MACRODILUIO







MBC
g/mL
MIC
100 50 25 12.5 6.25 3.12 16 8 4 controle
MICRODILUIO
DILUIO EM GAR
gar com 6 g/mL de Vancomicina
Enterococcus spp.
S s 4 g/mL
I 8-16 g/mL
R > 32 g/mL
Princpio do mtodo

E test
Teste de sensibilidade aos antimicrobianos
Curva de regresso

100

50

25

12

6.25

3.12

1.6

0.8

0.4

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40



Dimetro de zona de inibio (mm)
MICs (g/mL)
EtestDifuso
NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS
NCCLS
Organizao internacional,
interdisciplinar e educacional que
promove o desenvolvimento e a
ampla utilizao de normas e
procedimentos laboratoriais
padronizados.
A subcomisso do NCCLS
composta de representantes de
profisses, do governo e indstria,
incluindo laboratrios de
microbiologia, educadores,
farmacuticos, etc.
Recomendaes na escolha dos antimicrobianos
Padronizao das tcnicas
Critrios para a interpretao dos resultados
Parmetros para o controle qualidade do teste.
NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS
NCCLS
Laboratrio de Microbiologia Clnica
Infectologistas
Comisso de Infeco Hospitalar
Comisso de Controle de Utilizao Antibiticos
Farmcia
NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS
NCCLS
Seleo dos agentes antimicrobianos
Isolado requer terapia antimicrobiana
Isolado cuja susceptibilidade no preditiva
Isolado capaz de exibir resistncia
Orientao teraputica
Permite individualizar padres de resistncia.
Quando e porque realizar o antibiograma?
NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS
NCCLS
Avaliao da Sensibilidade
Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter spp.
- Agar Mueller-Hinton
- Inculo mtodo do crescimento ou suspenso direta
- Incubao 35
o
C em atm. ambiente
- Leitura 16 a 18h
- Controle de qualidade P.aeruginosa ATTC* 27853
E.coli ATTC* 35218
NCCLS.M100 -S11, 2002
Pacientes com fibrose cstica 24h
Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp.
AMICACINA 2
TOBRAMICINA 2
GENTAMICINA 1
CEFEPIMA 2
CEFTAZIDIMA 1
CIPROFLOXACINA 2
IMIPENEM 2
MEROPENEM 2
PIPERACILINA/Tazo 1
TICARC / c.clav. 1
POLIMIXINA
AMICACINA 2
GENTAMICINA 1
AMPICILINA/Subac.
CEFEPIMA 2
CEFTAZIDIMA 1
CEFTRIAXONA 3
CIPROFLOXACINA 2
IMIPENEM 2
MEROPENEM 2
PIPERACILINA/Tazo 1
TICARC / c.clav. 1
POLIMIXINA
Cefotaxima
Pode ser reportado quando
a cepa for resistente
Os outros no fermentadores devem ser
testadas pelo mtodo de diluio.
NCCLS 2002 - M100-S11 Tabela 2B




Avaliao da Sensibilidade
Estafilococos
- Agar Mueller-Hinton
- Inculo suspenso direta
- Incubao 35
o
C em atm. ambiente
- Leitura 16 a 18 mas 24h Oxacilina e Vancomicina
- Controle de qualidade S.aureus ATTC* 25923
E.coli ATTC* 35218
NCCLS 2002 - M100-S11 Tabela 2C
CIPROFLOXACINA 3
CLINDAMICINA 2
ERITROMICINA 2
GENTAMICINA 3
OXACILINA 1g 1
PENICILINA 1
SULFA/TRIMET 2
TEICOPLANINA
VANCOMICINA 2
Quinupristin/Dalfopristin 3
LINEZOLIDA 3
Staphylococcus aureus Staphylococcus no aureus
Azitromicina
Claritromicina
Rotineiramente no so
reportado em urina
MRSA
CIPROFLOXACINA 3
CLINDAMICINA 2
ERITROMICINA 2
GENTAMICINA 3
OXACILINA 1g 1
PENICILINA 1
SULFA/TRIMET 2
TEICOPLANINA
VANCOMICINA 2
Quinupristin/Dalfopristin 3
LINEZOLIDA 3
MRS
As penicilinas, cefens e outros | lactmicos como
amoxi/c.clav., ampi/sulb., ticarcilina/c.clav. e imipenem
Oxa R PR Oxa s e PS S
Oxa S e PR
Resitentes penicilina lbeis s | lactamases
<14mm MIC
Gatifloxacina
Levofloxacina
Ofloxacina
NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL
LABORATORY STANDARDS NCCLS- 2001
Vancomicina
- halo s 14 mm MIC
Incubao por 24hs a 35C
- MIC > 4 g
Encaminhar a
Laboratrio de Referncia
Staphylococcus spp.
Deteco de resistncia oxacilina
Staphylococcus aureus (MRSA)
gar Screening - MHA com 6 g de oxacilina + 4% de NaCl
Microdiluio - CAMHB + 2% NaCl
gar diluio - MHA + 2% NaCl
Disco-difuso - MHA (1g de oxacilina)
Inculo: suspenso direta (0,5 Mc Farland)
Temperatura: 35C
Tempo de incubao: 24 horas completas de incubao
NCCLS 2002 - M100-S11 Tabela 2C
Deteco Laboratorial GISA - Screening

BHI gar com 6g/mL de vancomicina. Incubao por 24h
Uma ou mais colnias - resultado positivo
Controle de qualidade
S. aureus ATCC 25923 - controle negativo
Enterococcus faecalis ATCC 51299 - controle positivo
Staphylococcus saprophyticus
S. saprophyticus isolado de urina no precisa ser submetido
ao teste de sensibilidade, pois a infeco responde s
concentraes dos antibiticos rotineiramente utilizados
para o tratamento em infeces no complicadas.
(ex. nitrofurantoina, trimetoprim/sulfametoxazol, ou fluoroquinolona)


A oxacilina no recomendada, pois cepas mecA negativa
freqentemente so resistentes pelos critrios de
interpretao dos estafilococos coagulase negativos.
URINA
ACIDO NALIDIXICO
C. PIPEMDICO
AMICACINA
AMPICILINA
CEFALOTINA
CEFTRIAXONA
CIPROFLOXACINA
GENTAMICINA
NORFLOXACINA
NITROFURANTOINA
SULFA/TRIMET
AMICACINA
CEFEPIMA
CEFTAZIDIMA
CEFTRIAXONA
CIPROFLOXACINA
GENTAMICINA
IMIPENEM
MEROPENEM
NORFLOXACINA

Pacientes internados
P.aeruginosa, Enterobacter spp., E.coli e Klebsiella spp.
Pacientes ambulatoriais
Avaliao da Sensibilidade
Enterococos
- Agar Mueller-Hinton
- Inculo mtodo de crescimento e suspenso direta
- Incubao 35
o
C em atm. ambiente
- Leitura 16 a 18h, mas 24h para Vancomicina
- Controle de qualidade S.aureus ATTC* 25923


MIC
NCCLS.M100 -S11, Tabela 2D, 2002
Avaliao da Sensibilidade
Enterococos
- Escolha dos discos - Tabela 2D
gentamicina 120 g
estreptomicina 300 g
- Deteco de | lactamase
teste de nitrocefin
MIC
s 6 = Resistente
7-9 = inconclusivo
> 10 mm = Sensvel
Penicilina
NCCLS.M100 -S11, Tabela 2D, 2002
Enterococcus spp.
AMPICILINA 1
CIPROFLOXACINA U
CLORANFENICOL 3
GENTAMICINA 120 g 3
STREPTOMICINA 300 g 3
TEICOPLANINA
VANCOMICINA 2
QUINUPRISTIN/DALFOPRISTIN 2

Penicilina
Sinergismo positivo
Sinergismo negativo
Ampicilina, amoxacilina, amoxi/c.clav.,
ampi/sulb., piperacilina e piperacilina /c.clav.
Para cepas no produtoras de | lactamases
Deteco de | lactamases
+
R Penicilina
S
15-16 mm MIC
NCCLS.M100 -S11, Tabela 2D, 2002
7-9 mm MIC
Avaliao da Sensibilidade
Enterobactrias
- Agar Mueller-Hinton
- Inculo mtodo de crescimento e suspenso direta
- Incubao 35
o
C em atm. ambiente
- Leitura 16 a 18h
- Controle de qualidade E.coli ATTC* 25922
E.coli ATTC* 35218

NCCLS, M100-S11 Tabela 2A, 2002
Enterobactrias
AMICACINA 2
AMPICILINA 1
AMPICILINA/Sulbactan 2
AZTREONAM 3
CEFALOTINA 1
CEFEPIMA 2
CEFTAZIDIME 3
CEFOXITINA 2
CEFTRIAXONA 2
CIPROFLOXACINA 2
GENTAMICINA 1
IMIPENEM 2
PIPERACILINA/Tazobactan 2
SULFA/TRIMET 2
TICARCILINA/c.clavulnico2
Cefotaxima
Meropenem
Levofloxacina
Amoxacilina
Amoxacilina/c.clavulnico
NCCLS, M100-S11 Tabela 2A, 2002
National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) - 2001
Deteco de ESBL em bacilos Gram-negativos
Klebsiella spp. e Escherichia coli
Teste de triagem: disco difuso ou determinao da MIC
Antimicrobianos
Ceftriaxona
Ceftazidima
Cefpodoxima
Aztreonam
Cefotaxima
DD (mm)
s 25
s 22
s 17
s 27
s 27
NCCLS, M100-S11 Tabela 2A, 2002
Teste confirmatrio da produo de ESBL
Klebsiella spp. e Escherichia coli
Teste de cefotaxima e ceftazidima, sozinhos
e associados cido clavulnico
Adio de 10L de uma soluo de cido
clavulnico de 1000g/mL a discos
contendo 30g dos antimicrobianos
Aumento >5mm indica produo de ESBL
NCCLS, M100-S11 Tabela 2A, 2002
Avaliao da Sensibilidade e Especificidade de Diferentes
Testes para Deteco de Cepas Produtoras de ESBL
Teste Sens. Espec.
Disco difuso (bkpts ESBL-NCCLS) 89 62
Dupla Difuso 41 100
ESBL Etest 89 98
Disco difuso (CTX + AZT - NCCLS) 88 83
Adio de clavulanato 97 47
MICs para 5 substratos (Etest) 100 100


Reis et al., J Bras Patol Clin, 2000. [in press]
ESBL
Como reportar amostras produtoras de ESBL?
O NCCLS sugere que todas as amostras produtoras
de ESBL sejam reportadas como resistentes s
penicilinas, cefalosporinas, e aztreonam.
NCCLS, M100-S11 Tabela 2A, 2002
Salmonella spp. e Shigella spp.
Ampicilina, uma quinolona e trimetoprim-sulfametoxazol.

Em isolados extra-intestinais de Salmonella spp.
cloranfenicol e uma cefalosporina de terceira gerao devem
ser includos.

Cefalosporinas de primeira e segunda geraes e
aminoglicosdeos podem aparecer sensveis in vitro mas
no so efetivas clinicamente. Nunca reportar como
sensvel.
O que testar?
NCCLS, M100-S11 Tabela 2A, 2002
Avaliao da Sensibilidade
Haemophilus spp


- Agar Haemophilus Test Medium (HTM)
- Inculo suspenso direta
- Incubao 35
o
C em atm. 5% CO
2

- Leitura 16 a 18h
- Controle de qualidade H.influenzae ATTC* 49247
H.influenzae ATTC* 49766
E.coli ATTC* 39218
NCCLS, M100-S11 Tabela 2E, 2002
Avaliao da Sensibilidade
Haemophilus spp


+

O teste Positivo preditivo de resistncia ampicilina e amoxacilina
NCCLS, M100-S11 Tabela 2E, 2002
Ampicilina
Cefalosporina de 3
a
gerao
Cloranfenicol

Haemophilus spp. meio HTM
AMPICILINA 1
AZITROMICINA 3
CEFTRIAXONA 2
CEFUROXIMA 2
CIPROFLOXACINA 3
CLORANFENICOL 2
SULFA/TRIMET 1
MEROPENEM 2
Cefotaxima
Ceftazidima
Gatifloxacina
Levofloxacina
Lomefloxacina
Moxifloxacina
Ofloxacina
Sparfloxacina
Amoxilina
S
Deteco de
| lactamases
+
R Ampicilina
Amoxicilina
Resistncia s
fluoroquinolonas rara.
-
Avaliao da Sensibilidade
Moraxella catarrhalis


+
O teste Positivo preditivo de resistncia ampicilina e amoxacilina
90% + (Livermore,Clin.Microbiol.rev.8: 557, 1996)
Haemophilus influenzae e Moraxella catarrhalis
Perfil de sensibilidade de amostras isoladas no Brasil
Programa SENTRY 1997 a 1999
Amostras de So Paulo (UNIFESP); Rio de Janeiro (Lab. Lmina),
Florianpolis (Lab. Sta Luzia) e Porto Alegre (Hosp. de Clnicas).
Antibitico
Amoxicilina
Amoxicilina/Clav.
Cefaclor
Cefuroxima
Cefepima
Azitromicina
Cloranfenicol
STX/TMP (Bactrim

)
Levofloxacina
Gatifloxacina
H. influenzae (n = 187)
8
0,5
8
2
0,12
2
s 2
8
s 0,5
s 0,03
MIC90
88,8
100,0
96,5
97,9
100,0
99,4
96,6
52,4
100,0
100,0
% sens.
M. catarrhalis (n =109)
4
0,25
2
2
2
s 0,12
s 2
1
0,06
0,06
MIC90
6,4
99,1
100,0
100,0
100,0
100,0
99,1
85,3
100,0
100,0
% sens.
Avaliao da Sensibilidade
S.pneumoniae


- Mueller-Hinton agar com 5% de sangue de carneiro
- Inculo suspenso direta
- Incubao 35
o
C em atm. 5% CO
2

- Leitura 20 a 24h
- Controle de qualidade S.pneumoniae ATTC* 49619
NCCLS, M100-S11 Tabela 2G, 2002
Avaliao da Sensibilidade
Streptococcus pneumoniae





NCCLS.M100 - S11, Tabela 2G, 2002
- Escolha dos discos Tabela A
Oxacilina Penicilina
no recomendado para outros estreptococos

- Dimetros de inibio especficos (Tabela 2G)

- Interpretao
Oxacilina > 20 mm Sensvel
s 19 mm
penicilina, meropenem e ceftriaxona ou cefotaxima

MIC
Streptococcus pneumoniae
CLORANFENICOL 2
ERITROMICINA 1
OFLOXACINA
OXACILINA 1g PENICILINA 1
RIFAMPICINA
GATIFLOXACINA 3
SULFA/TRIMET
VANCOMICINA 2

Ampicilina, Amoxacilina,
amoxacilina/c.clav.
ampicilina/sulb.,
cefaclor, cefepima,
cefotaxima,
ceftriaxona,
cefuroxima, imipenem
e meropenem
Pencilina
Meropenem
Ceftriaxona
> 20mm
S
s19 mm
MIC
< 17 mm
Levofloxacina
Moxifloxacina
NCCLS.M100 - S11, Tabela 2G, 2002
21%
16,5%
18%
14,5%
13,6%
16,7%
24,7%
S = 79%
S = 92%
RI =19,2%
AR= 1,8%

RI =7%
AR=1%

< 6 anos
Resistncia de Pneumococo Penicilina
< 6 anos
R: 21% *
> 6 anos
R: 8% *
* P <0,05
Perodo: 1993 2000

RI - MIC: 0,1 1,0 ug/ml
AR - MIC: > 2,0 ug/ml
1-2anos:
R: 31,7%
RI =27,4%
AR= 4,3%
N.cepas invasivas=4.000
PAHO
Projeto SIREVA
Instituto Adolfo Lutz
Streptococcus pneumoniae
123 cepas do Hospital So Paulo - Perfil de Resistncia
Oxacilina S = 90
Penicilina S = 90 (79,67%)

Oxacilina R = 33

Penicilina S = 8
Penicilina I = 22 (17,89%)
Penicilina R = 3 (2,44%)

Ceftriaxona S = 30
Ceftriaxona I = 2
Ceftriaxona R = 1
8
22
5
30
2
1
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Penicilina Cef triaxona
TESTE DE INDUO PARA DETECO DO FENTIPO MLS
Staphylococcus spp. e S.pneumoniae

Antibitico

Amox-clav
Cefuroxima
Cefotaxima
Claritromicina
Azitromicina
TMP/SMX
Levofloxacina
Gatifloxacina


Susceptibilidade do S.pneumoniae aos antimicrobianos
Programa SENTRY - Amrica Latina 1997- 1999
991 isolados - S: 67,0% I:21,6% R:11,4%

Peni S (664)
MIC 90 %S
2 100
0.12 99.6
0.03 99.4
s 0.25 94.4
s 0.12 95.3
4 74.4
1 99.8
0.5 99.7
Peni I (214)
MIC 90 %S
2 99.5
2 80.6
0.5 93.2
> 32 78.5
> 16 81.7
8 43.0
2 100.0
0.5 100.0
Peni R (214)
MIC 90 %S
4 0.0
8 2.3
2 21.6
4 70.5
8 77.3
8 7.1
2 100.0
0.5 100.0
Isolados da Argentina, Brasil, Chile, Colmbia, Mxico, Uruguai e Venezuela
1997 a 1999 - Pneumonia comunitria.
S. pneumoniae - Programa SENTRY Brasil - 1997 a 2000
387 amostras - S: 78,3% -- I: 23,1 % -- R: 4,6%
Antibitico Peni - S (303) Peni - I (70) Peni - R (14)
MIC90 %S MIC90 %S MIC90 %S
Amoxic-clavul 0,25 100,0 0,5 100,0 4 78,6
Cefaclor 2 88,0 4 63,3 >32 0,0
Cefuroxima 0,12 99,2 1 92,5 8 9,1
Cefotaxima 0,03 99,1 0,5 95,2 2 12,5
Cefepima 0,12 98,6 0,25 95,7 2 35,7
Claritromicina < 0,25 93,0 2 79,1 4 54,5
Azitromicina < 0,12 94,2 8 83,6 2 81,8
Tetraciclina >16 65,7 >16 75,7 >16 71,4
Sulfa / Trimet 4 57,9 8 30,0 >8 7,1
Levofloxacina 1 100,0 2 100,0 1 100,0
Gatifloxacina 0,5 100,0 0,5 100,0 0,5 100,0
#
Inclui amostras de So Paulo, Rio de Janeiro, Florianpolis e Porto Alegre.
Helio Sader - UNIFESP
Streptococcus spp, no S.pneumoniae
Streptococcus viridans
Penicilina MIC
Streptococcus pyogenes
Streptococcus agalatie
Critrios de interpretao para disco-difuso devem ser
usados somente para Streptococcus |-hemolticos
penicilina, ampicilina, ofloxacina e quinupristin-dalfopristin

Penicilina < 24 mm
S Ampicilina, amoxicilina, amoxi/ c.clav., amoxi/sulb., ceflacor,
ceftriaxona, cefalotina, imipenem e meropenem
NCCLS.M100 - S11, Tabela 2H, 2002
Neisseria gonorrhoeae
Suspeita de falncia teraputica
Vigilncia
Estudos para orientar terapia emprica

NCCLS, M100-S11 Tabela 2F, 2002
Avaliao da Sensibilidade
Neisseria gonorrhoeae


- GC agar com 1% de suplemento
- Inculo suspenso direta
- Incubao 35
o
C em atm. 5% CO
2

- Leitura 20 a 24h
- Controle de qualidade n.gonorrhoeae ATTC* 49226
NCCLS, M100-S11 Tabela 2F, 2002
Neisseria gonorrhoeae
Teste |-lactamase:
POSITIVA : R amoxicilina, ampicilina e penicilina (PPNG)
: no garante sensibilidade (CRMNG - PBPs)
Todos os isolados? Detecta PPNG e no CRMNGs

Obs.:raros casos de resistncia por |-lactamase alterao de PBPs
NCCLS, M100-S11 Tabela 2F, 2002
NEGATIVA
Neisseria gonorrhoeae
Resultados intermedirios Confirmar

Gonococo com halos s19mm para penicilina (10U) indica
provvel produo de |-lactamase

Gonococo com halos s19mm para tetraciclina (30g)
indica resistncia mediada por plasmideo (TRNG)
MIC
R s 26 mm
R s 30 mm
NCCLS, M100-S11 Tabela 2F, 2002
Stenotrophomonas maltophilia

Resistncia intrnseca a carbapenens

Resultados de sensibilidade obtidos por disco-difuso e
automatizados podem no apresentar correlao
com resultados obtidos por MIC convencional

Determinao da MIC (microdiluio ou gar diluio)

Antimicrobianos a serem testados (MIC):
sulfametoxazol/trimetoprim,
ticarcilina/cido clavulnico
tetraciclina e cloranfenicol
RESISTNCIA BACTERIANA
RESISTNCIA INTRNSICA
CEFALOTINA
Enterobacteriaceae
-Cedecea spp
-Citrobacter freundii
-Enterobacter spp
-Providncia spp
-M.morganii
-P.vulgaris
-P.penneri
-Serratia spp
-Yersinia enterocoltica

RESISTNCIA INTRNSICA
CEFOXITINA
Enterobacteriaceae
-Citrobacter freundii
-Enterobacter spp
-Serratia spp


RESISTNCIA INTRNSICA
Amp/.clavulnico e Amp/Sulbactam
Enterobacteriaceae
-Citrobacter freundii
-Enterobacter spp
-Serratia spp


RESISTNCIA BACTERIANA
FENTIPOS RAROS DE RESISTNCIA
Enterobacteriaceae Imipenem
S.aureus Vanco, Teico
S.coag.negativa Vancomicina
E.faecalis Ampicilina
Strep.|hem:A, B, C, F, G Peni, Ampi, cefal. de 3 e 4 gerao
Streptococcus spp Vancomicina
H.influenzae Cefal. de 3 e 4 gerao e fluoroquinolonas
N.gonorrhoeae Cefal. de 3 e 4 gerao


Quinolonas e aminoglicosdeos
| Lactmicos
RESISTNCIA BACTERIANA









A qualidade dos resultados do teste
MUITO OBRIGADA
amachado-labc@dhsp.epm.br