Mdulo 1.A Higiene Parecera innecesario sealar la importancia que tiene el manejo sanitario de los alimentos.

Se sabe bien que cada ao ocurren miles de casos de infecciones, intoxicaciones o toxiinfecciones, transmitidas por ellos y que una proporcin considerable tiene un desenlace fatal. Estos problemas de salud causan tambin prdidas econmicas por ausentismo e incremento en el costo de los servicios de atencin mdica. Todo esto sucede debido a que, a pesar de los esfuerzos desarrollados por las autoridades de los servicios de salud, todava hay volmenes considerables de productos alimenticios que llegan al consumidor contaminados a causa de un manejo deficiente. El saneamiento de los alimentos significa eliminar o controlar en forma efectiva los microorganismos presentes en ellos y en todo aquello con lo que entren en contacto. La presencia numerosa de bacterias indica que algo no se hizo bien al prepararlos o sea, que se manipularon deficientemente. Pero la higiene en su manejo depende no solamente de la legislacin al respecto o del equipo utilizado. El papel que desempean quienes preparan y quienes sirven alimentos continuar siendo de gran responsabilidad, pues actan directamente sobre el aparato digestivo de millones de consumidores. Ambos influyen decisivamente en el grado de salud pblica de un pas. La inocuidad de los alimentos, es producto de muchas acciones directas e indirectas, dentro de las cuales los aspectos relativos al manejo higinico, as como el monitoreo a travs del muestreo y anlisis tanto de superficies vivas e inertes como del ambiente, son de suma importancia. La tendencia actual en la industria transformadora de los alimentos, es implementar planes y programas de anlisis de riesgos y puntos crticos de control (siglas en ingls HACCP), y es requisito entrenar a los obreros en buenas prcticas de limpieza e higiene, e instruir un sistema de monitoreo para asegurarse de que se estn siguiendo las instrucciones para reducir el riesgo de contaminacin. El HACCP es un enfoque moderno cuya pretensin primaria consiste en eliminar de los alimentos los riesgos a la salud asociados a su consumo. Por lo tanto es de suma importancia el conocer metodologas analticas adecuadas para efectuar (o bien solicitar a laboratorios de apoyo) el anlisis de superficies inertes, vivas y medio ambiente y, con base en los resultados analticos, conocer las condiciones de operacin reales que prevalecen en la industria. El anlisis de estos resultados permitir mantener o bien emitir e implementar medidas correctivas oportunas cuya finalidad es la obtencin de productos alimenticios dentro de estndares de calidad y seguridad alimentaria. A continuacin se presenta el significado de algunos trminos en el tema del manejo higinico de los alimentos: a. Contaminacin cruzada: Proceso por el que los microorganismos son trasladados por medio de personas, equipos, materiales, de una zona sucia o contaminada a una zona limpia. b. Contaminacin: Es la presencia de cualquier material extrao en los productos alimenticios que origina que sean inadecuados para el consumo. c. Control de calidad: Significa un procedimiento planificado y sistemtico para tomar todas las acciones necesarias para prevenir que los alimentos sean adulterados i

dentro del significado de la legislacin del pas correspondiente. d. Higiene de los alimentos: Todas las medidas necesarias para garantizar la inocuidad e higiene de los alimentos en todas las fases, desde su cultivo, produccin o manufactura hasta su consumo final. e. Higiene: Parte de la medicina que tiene por concepto la conservacin de la salud y los medios para prever las enfermedades; limpieza es la primer regla de la Higiene. f. Higinico: Libre de niveles nocivos de microorganismos y contaminantes. g. Limpio: libre de suciedad visible. h. Saneamiento: Significa tratar adecuadamente las superficies de contacto con los alimentos aplicando un proceso que sea efectivo para destruir las clulas vegetativas de los microorganismos de importancia en salud pblica y para reducir substancialmente el nmero de otros microorganismos indeseables, sin afectar adversamente el producto o la seguridad del mismo para los consumidores. i. Sanidad: Significa sano y consiste en conservar la calidad de los productos mediante mtodos fsicos (fro, calor), qumicos (sal, cidos, conservadores, etc.) manteniendo todas sus propiedades nutrimentales inalterables.

Referencias: Pascual, M. R & Caldern, V. (2000). Microbiologa Alimentaria. Metodologa analtica para alimentos y bebidas. 2. Ed. Diaz de Santos. Madrid, Espaa. Marshall, R. T. (1992) Standard methods for the examination of Dairy Products. American Public Health Association. Copyright, Washington, D. C. (1972). Tcnicas sanitarias en el manejo de los alimentos. ed. Pax-Mxico. Mxico, D. F. Harrigan, W. F. & Park, R. W. A. ((1991). Making safe food: A management guide for microbiological quality. Academic Press. U.K. Norma Oficial Mexicana NOM-093-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Prcticas de Higiene y Sanidad en la preparacin de alimentos que se ofrecen en establecimientos fijos. Norma Mexicana NMX-F.605-NORMEX-2000. Alimentos Manejo Higinico en el Servicio de Alimentos Preparados para la Obtencin del Distintivo H. Norma Oficial Mexicana NOM-120-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Prctias de Higiene para el Proceso de alimentos, bebidas no alcohlicas y alcohlicas.

ii

Objetivos: Determinar microorganismos viables en superficies inertes y vivas/ambiente, con o sin tratamiento de higiene. Detectar la presencia de microorganismos indicadores de contaminacin de los alimentos. Aplicar mtodos de enumeracin adecuados, segn la superficie-ambiente que se vaya a analizar. Relacionar la estimacin de la cifra de microorganismos presentes en la superficie/ambiente, con la calidad del producto procesado o manipulado, para concluir acerca de posibles efectos para la salud del consumidor. Explicar el efecto de sustancias desinfectantes utilizadas en los procesos de higiene de superficies. Comparar la efectividad de diferentes sustancias desinfectantes utilizadas en los procesos de higiene de superficies.

Ejercicio: 1. Con base en bibliografa, qu grupo o grupos de microorganismos se sugiere analizar en las superficies que estarn en contacto durante el proceso del alimento que se le asign. 2. Cules son los lmites o especificaciones microbiolgicas recomendadas en bibliografa especializada para considerar una superficie apta para manejar higinicamente el alimento? 3. Y para considerar un ambiente limpio para manejar higinicamente el alimento? 4. A qu nicho de consumidores se recomendara la utilizacin de las sustancias desinfectantes y por qu?. 5. Qu medidas propone para disminuir la carga microbiana de un ambiente que ponga en riesgo la calidad higinica del alimento? 6. Qu otras tcnicas conoce para realizar el anlisis de superficies? 7. Los resultados obtenidos concuerdan con lo que usted esperaba? Explique.

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ANALISIS DE SUPERFICIES INERTES.

OBJETIVO. Este procedimiento proporciona las reglas para la toma y anlisis de superficies inertes por los mtodos del hisopo, esponja, enjuague total y placa por contacto Rodac. GENERALIDADES. La higiene los alimentos implica una variedad de acciones, entre las cuales, el evitar la contaminacin ocupa lugar relevante. Cada fuente de contaminacin que puede actuar sobre los alimentos presenta sus propias peculiaridades y por ello requiere de mtodos especiales para lograr su control. As ocurre con el agua, los manipuladores, equipo, envases, superficies de trabajo, etc. En el caso del equipo, ste puede ser un vehculo pasivo de microorganismos, o puede constituirse en la base material sobre la cual, debido a un aseo deficiente, entren en actividad y lleguen a introducirse, por millares, en el alimento. La calidad sanitaria de los alimentos, depende de la materia prima utilizada en su preparacin y de las condiciones higinicas en que han sido elaborados, manejados y conservados, incluyendo todas las superficies que estn en contacto con ellos. Dinero y esfuerzo invertido en una planta para seleccionar materias primas e instalar equipo costoso, pueden perderse si la limpieza y desinfeccin en general, y especficamente en los puntos crticos, no se realiza adecuadamente y/o si no se evala su eficiencia correctamente. Existen procesos de lavado y desinfeccin, que utilizan sustancias y condiciones de tratamiento propios para cada necesidad, en las distintas ramas de la industria de alimentos. Cuando las normas o recomendaciones para su aplicacin se siguen con acierto, los resultados son claramente satisfactorios. El establecimiento de sistemas de higiene (lavado y sanitizacin) adecuados del equipo, debidamente programados y en manos de personal responsable y adiestrado, debieran ser una exigencia, motivo de supervisin especial, dentro de cada industria y por parte de la autoridad sanitaria competente. El laboratorio proporciona un valioso recurso que permite evaluar satisfactoriamente la eficiencia de estos procesos. Para evaluar la eficiencia de la limpieza y saneamiento de las superficies, se han desarrollado mtodos y propuesto normas basadas en el nmero total de microorganismos por unidad de superficie. Existen muchos mtodos para tal efecto, el recuento de microorganismos viables en el equipo tratado es sencillo y confiable, aunque necesariamente requiere de tiempo para disponer de los resultados. Los mtodos pueden aplicarse ya sea para buscar microorganismos indicadores, o un gnero especial, cuando se trate de un problema particular. Existen varios procedimientos, dentro de los cuales describiremos los ms usuales: PROCEDIMIENTO iv

MTODO DEL HISOPO. Esta tcnica se puede utilizar en superficies que sean regulares, lisas, pulidas. Consiste en frotar un aplicador de madera u otro material de algodn (hisopo) estril, humedecido con la solucin diluyente que recoge la flora microbiana en un rea determinada para finalmente suspenderla en el diluyente. Siguiendo las instrucciones del mtodo y contando con un valor normativo, es posible decidir sobre el nivel de contaminacin que prevalece sobre una superficie. Hay que tomar en consideracin la representatividad que ofrece este ensayo para sugerirlo a una planta o a un proceso particular. PRUEBA LIMITE PERMITIDO Mesoflicos aerobios Coliformes totales < 400 UFC/cm2 o unidad < 200 UFC/cm2 o unidad

Fuente: Norma Oficial Mexicana NOM-093-SSA1-1994. Prcticas de Higiene y Sanidad en la preparacin de alimentos que se ofrecen en establecimientos fijos.

MATERIAL Tubos con tapn de rosca conteniendo 10,0 mL de solucin diluyente. Hisopos estriles en sobres de papel manila o tubos de ensayo. Se pueden conseguir en forma comercial. Plantillas de papel aluminio de 12,0 cm por lado con un cuadro de 5,0 x 5,0 cm recontado en el centro y esterilizadas dentro de papel manila. TOMA DE LA MUESTRA. Muestreo de superficies. Colocar la plantilla o bien delimitar un rea aproximada de 5,0 x 5,0 cm 10,0 x 10,0 cm sobre la superficie que se va a muestrear. Sacar el hisopo aspticamente. Si la superficie est seca, humedecer el hisopo en la solucin diluyente y presionar contra la pared del frasco o tubo con un movimiento de rotacin para quitar el exceso de lquido, en caso contrario no es necesario hacer esto. Con el hisopo inclinado, frotar la superficie delimitada por la plantilla en 3 sentidos diferentes (horizontal, vertical y oblicuo). Regresar el hisopo al tubo o frasco y romper la parte que estuvo en contacto con los dedos. Este mtodo tambin puede utilizarse para buscar patgenos, substituyendo la solucin diluyente por el caldo de cultivo adecuado. Muestreo de utensilios de comedor. Utilizar tubos con l0,0 mL. Tomar un hisopo, mojarlo en la solucin diluyente y exprimir el exceso de lquido sobre la pared del tubo. Tomar la muestra del utensilio con el hisopo tratando de tomar de la superficie que est en contacto con el alimento o con la boca. Regresar el hisopo al tubo y romper la parte que estuvo en contacto con los dedos. Una vez tomada la muestra, se procede a hacer el recuento, por el mtodo ms adecuado, generalmente cuenta en placa, con los medios de cultivo recomendados para el grupo bajo estudio. v

CLCULO Y EXPRESIN DE RESULTADOS Superficies. Contar todas las colonias que se desarrollen en las cajas, hacer el clculo de las colonias por mL, multiplicar por el volumen de diluyente empleado y dividirlo entre cm2 de la superficie. Los resultados se expresan como UFC/cm2. Utensilios de comedor. Hacer el clculo del nmero de colonias por mL, multiplicar el volumen total de la solucin diluyente de muestreo. Informar UFC/utensilio. MTODO DE LA ESPONJA. Esta tcnica se puede aplicar eficientemente para tomar muestras de superficies en reas grandes. Se utilizan esponjas estriles de espuma de poliuretano generalmente de 13,0 x 7,5 x 4,0 cm (o de dimensiones requeridas) y bolsas de plstico transparentes estriles de las dimensiones necesarias. Consiste en pasar la esponja sobre toda la superficie del equipo o utensilio que se va a muestrear pudiendo estimar de esta manera el contenido microbiano de toda la superficie y no nicamente de dimensiones limitadas. La bolsa de plstico se invierte a modo de guante sobre la mano del muestreado, haciendo que la parte interna pase a ser la externa y con la mano as protegida, se toma una esponja retirndola de la envoltura de papel manila. Se humedece la esponja con un poco de la solucin diluyente estril y se frota completamente toda la superficie que se va a muestrear. Terminando el muestreo, se vuelve la bolsa a su posicin original quedando la esponja en su interior y se adiciona el resto del volumen de la solucin diluyente a la bolsa que plstico que contiene la esponja y se homogeniza exprimiendo repetidamente la esponja. Esta suspensin ser considerada como la muestra directa y a partir de ella se harn las diluciones necesarias. Las superficies y utensilios a muestrear pueden ser de forma y tamao muy diverso, tales como, mesas, tablas de picar (tratando de llegar a las hendiduras y esquinas), utensilios de comedor (tomar muestra de la superficie del utensilio con excepcin del mango, prestando atencin a la parte interna como es el caso de los tenedores entre diente y diente), vasos, platos (tomar la superficie expuesta a los alimentos, incluyendo el borde que est en contacto con los labios del usuario), manos (la palma de la mano y parte interna y externa de cada uno de los dedos), etc. MATERIAL Esponjas de poliuretano o de celulosa de dimensiones apropiadas a la superficie que se va a muestrear. Envueltas individualmente en papel manila y esterilizadas en autoclave a 121C por 30 min. Se pueden conseguir en forma comercial estriles. Bolsas Whirlpack con esponja. Frascos con tapa de rosca con 50,0 mL o 100,0 mL (o el volumen necesario).de solucin diluyente estril. vi

 Bolsas de plstico estriles de la dimensin necesaria. TOMA DE LA MUESTRA Sacar la esponja utilizando la bolsa invertida a manera de guante, humedecerla con la solucin diluyente y frotar vigorosamente con la esponja el rea de muestreo . Regresar la esponja a la bolsa de plstico y verter el resto del lquido diluyente. Cerrar la bolsa y homogenizar exprimiendo repetidamente la esponja. CLCULO Y EXPRESIN DE RESULTADOS Contar las colonias y calcular el nmero de UFC/mL multiplicar por el volumen del diluyente y reportar por unidad de superficie (cm2) o por utensilio. MTODO DE PLACA POR CONTACTO, RODAC (Replicate Organism Detection and Counting). Este mtodo se recomienda para obtener datos cuantitativos en superficies planas e impermeables. Idealmente la placa se debe utilizar sobre superficies que han sido previamente saneadas y desinfectadas, ya que en lugares con un alto grado de contaminacin, resultar un crecimiento masivo en las placas que dificultar los recuentos. En el caso de muestreo de superficies previamente tratadas con desinfectante, es necesario que se agregue al medio de cultivo un agente neutralizante adecuado, por ejemplo, lecitina para neutralizar compuestos cuaternarios de amonio, y polisorbato 80 para neutralizar desinfectantes fenlicos. En superficies en las que se sospeche que se encuentran un poco ms contaminadas se deben tomar suficientes muestras para obtener datos representativos. La seleccin del sitio al azar permitir comparaciones adicionales y eliminar posibles interferencias. MATERIAL Las placas RODAC se pueden obtener en forma comercial. Cuando se preparan en el laboratorio, deben vaciarse de 15,0 -16,0 mL de agar para cuenta estndar en cajas de petri desechables. (El agar en la placa debe quedar ligeramente convexo en la superficie del centro, para poder hacer contacto adecuado con la superficie. Se pueden emplear medios de cultivo para determinar indicadores o bien patgenos. TOMA DE MUESTRA Quitar la tapa de plstico y presionar cuidadosamente el agar contra la superficie, mediante movimiento rotatorio uniforme, presionar sobre la parte de atrs de la placa para efectuar el contacto. Colocar de nuevo la tapa e incubar en posicin invertida 2448 h a 35+/-1C. vii

CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS Efectuar la lectura a las 24 h para prevenir crecimiento incontable, en caso de observar crecimiento pobre incubar 24 h ms. Se cuentan las colonias y se informa el nmero por placa o por cm2, dividiendo el nmero de colonias, entre la superficie de contacto de la caja. Debido a que la interpretacin es relativa, cada laboratorio o industria, deber establecer sus propios valores que constituyen un rea limpia. El Comit sobre contaminacin microbiana de superficies de laboratorios de la APHA establece los siguientes lmites: No. colonias por placa Rodac 0-25 25-50 50 ms Calidad bien regular pobre

MTODO DE ENJUAGUE TOTAL Este mtodo se emplea para tomar muestras de objetos pequeos como son cucharas, tenedores, biberones, etc. o para el muestreo de superficies interiores de envases, botellas y bolsas de plstico, etc. MATERIAL Frascos de boca ancha con 50,0 mL de solucin diluyente, o con la cantidad necesaria segn el tamao del objeto que se va a muestrear. Bolsas de plstico estriles de tamao adecuado al objeto que se va a muestrear. TOMA DE MUESTRA Utensilios. Sumergir la superficie de los utensilios que estn en contacto con la boca (cucharas, tenedores, etc.) en frascos de boca ancha con la solucin diluyente o bien, verter la solucin dentro de una bolsa estril, colocar el objeto que se va a muestrear, enjuagar perfectamente bien el objeto y regresar el lquido al frasco inicial. Superficies interiores. Introducir en el envase o bolsa que se va a muestrear 10,0 mL o el volumen adecuado de solucin diluyente. Enjuagar haciendo correr el lquido por toda la superficie, agitar bien. Regresar el contenido de los envases al frasco. CLCULO Y EXPRESIN DE RESULTADOS viii

Contar las colonias y expresar las UFC/utensilio o envase, tomando en cuenta el volumen del diluyente y si se efectuaron diluciones posteriores.

ANLISIS DE LAS MUESTRAS PARA LOS CUATRO MTODOS ANTERIORES. Transferir volmenes de 1,0 mL y 0,1,0 mL o diluciones de la muestra a cajas de Petri marcadas con la clave, fecha, medio de cultivo y dilucin inoculada. Agregar el medio de cultivo seleccionado: Agar triptona extracto de levadura para cuenta de mesoflicos aerobios Agar bilis rojo violeta para cuenta de organismos coliformes totales. Aadir una doble capa del mismo medio de cultivo una vez solidificada la primera capa, para crear condiciones de anaerobiosis. Agar papa dextrosa acidificado para cuenta de hongos y levaduras. Acidificar a un pH de 3.5 +/- 0,1 con cido tartrico estril a 10,0% (aproximadamente 1,4 mL de cido tartrico por cada 100,0 mL del medio). SUPERFICIES Contar todas las colonias que se desarrollen en las cajas, hacer el clculo de las colonias por mL, multiplicar por el volumen de diluyente empleado y dividirlo entre los cm2 de la superficie. Los resultados se expresan en UFC/cm2. EJEMPLO Si se tom la muestra de 4 superficies de 25,0 cm2 c/u en un volumen de 10,0 mL de diluyente, multiplicar el nmero de colonias x 10 y dividir el resultado entre 100 para obtener las UFC/cm2. UTENSILIOS DE COMEDOR Hacer el clculo del nmero de colonias por mL, multiplicar el volumen total de la solucin diluyente de muestreo y sacar promedio dividiendo entre el nmero de utensilios muestreados para informar UFC/utensilio. BIBLIOGRAFIA Manual of Food Quality Control. 12. Quality assurance in the food control microbiological laboratory. FAO. Rome, 1991. Manual de prcticas. Curso: Toma y manejo de muestras para anlisis bacteriolgico. Laboratorio Nacional de Salud Pblica. Mxico 1992. Standard methods for the examination of dairy products. APHA. 16 th. 1992. Procedimiento para el examen microbiolgico de superficies y utensilios. Secretara de Salud. Laboratorio Nacional de Salud Pblica. Mxico 1990.

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Medios de Cultivo

Agua Peptonada Peptona Cloruro de sodio Agua destilada 1,0 g 8,5 g 1,0 L

Disolver los componentes de la formulacin en un litro de agua y ajustar la solucin a pH de 7,0, con solucin de hidrxido de sodio 1,0 N; distribuir en matraces o tubos, de acuerdo a los requerimientos de la tcnica y esterilizar a 121 C1 C durante 15 minutos. Despus de la esterilizacin, los volmenes y el pH de la solucin deben ser iguales a los iniciales.
Bilis rojo violeta, agar Peptona de carne Extracto de levadura Cloruro de sodio Lactosa Mezcla de sales biliares Rojo neutro Cristal violeta Agar Agua destilada 7,0 g 3,0 g 5,0 g 10,0 g 1,5 g 0,03 g 0,002 g 13,0 g 1,0 L

Humectar perfectamente los ingredientes del medio en 750,0 mL de agua, posteriormente ajustar el pH a 7,40.1 y esterilizar en condiciones suaves: 30 minutos en bao de vapor. No esterilizar en caso de usarlo al momento. Principio de accin

La bilis de buey que contiene una mezcla de sales biliares y que se encuentra en el medio, inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas, permitiendo el desarrollo de bacterias coliformes cuyo Gram es negativo. Las sales biliares se presentan como derivados del cido clico y desoxiclico, su estructura qumica bsica es la del ciclo pentano perhidrofenantreno.
Mtodos Estndar para, agar Peptona de casena Extracto de levadura Dextrosa Agar x 5,0 g 2,5 g 1,0 g 15,0 g

Agua destilada

1,0 L

Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada, calentar hasta ebullicin para disolver por completo y ajustar el pH a 7,0 0,2 a 25 C. Distribuir en tubos de ensayo con tapn de rosca o en un matraz, despus esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Enfriar a 45-50 C y vaciar en cajas Petri. Puede volverse a fundir una sola vez cuando se necesite. Principio de accin La peptona de casena proporciona aminocidos y otras sustancias nitrogenadas complejas necesarias para el crecimiento bacteriano. El extracto de levadura proporciona vitaminas del complejo B y la dextrosa es utilizada por los microorganismos como la fuente de carbono y energa. Es un medio general por lo que no contiene inhibidores. Papa dextrosa agar Infusin de papa, (a partir de 200g de papa) Dextrosa Agar Agua destilada 4,0 g 20,0 g 15,0 g 1,0 L

Se suspenden los ingredientes en el agua destilada, permitiendo la humectacin de los polvos, para evitar la formacin de grumos que son difciles de disgregar, calentar el medio hasta ebullicin y finalmente esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Enfriar el medio de cultivo en bao de agua hasta 45 C1 C, despus acidificar a un pH de 3,5 0,1, con cido tartrico al 10% previamente esterilizado (1.4 mL de cido tartrico por cada 100,0 mL de medio de cultivo). Despus de adicionar el cido tartrico al medio de cultivo, medir el pH con un potencimetro. Principio de accin A partir de los hidratos de carbono contenidos en la infusin de papa, se observa que stos favorecen el crecimiento de hongos y levaduras, al igual que a otras bacterias, sin embargo se le confiere selectividad al medio para que desarrollen los hongos y las levaduras, acidificando el medio con una polucin de cido tartrico al 10%, adicionando a cada litro de medio de cultivo 14,0 mL del cido.

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ANALISIS DE SUPERFICIES VIVAS. OBJETIVO Monitorear las manos del personal que realice manipulaciones en cualquier punto de la cadena de transformacin de los alimentos. MATERIAL METODO DEL HISOPO Tubos con tapn de rosca conteniendo 10,0 mL de solucin diluyente. Hisopos estriles en sobres de papel manila o tubos de ensayo. conseguir en forma comercial.

Se pueden

PROCEDIMIENTO a) METODO DEL HISOPO. Esta tcnica se puede utilizar en superficies que sean regulares, lisas, pulidas. Consiste en frotar un aplicador de madera u otro material de algodn (hisopo) estril, humedecido con la solucin diluyente que recoge la flora microbiana en un rea determinada para finalmente suspenderla en el diluyente. Siguiendo las instrucciones del mtodo y contando con el siguiente valor normativo, NOM-093-SSA1-1993. Prcticas de higiene y sanidad en la preparacin de alimentos que se ofrecen en establecimientos fijos. a) Manos de personal < 3 000 UFC/manos < 1 500 UFC/mano Cuenta de coliformes totales < 10 UFC/manos < 5 UFC/mano es posible decidir sobre el nivel de contaminacin que prevalece sobre las manos del operario. Tomar un hisopo y sumergirlo en la solucin diluyente retirando el exceso de lquido. Limpiar bien la superficie de la palma de la mano, as como la superficie interna de dedos y uas. Repetir la operacin tomando muestra de la otra mano. Regresar el hisopo nuevamente al tubo y romper la parte que estuvo en contacto con los dedos. Transferir volmenes de 1,0 mL y 0,1,0 mL o diluciones de la muestra a cajas de Petri marcadas con la clave, fecha, medio de cultivo y dilucin inoculada. Agregar el medio de cultivo seleccionado: Agar triptona extracto de levadura para cuenta de mesoflicos aerobios Agar bilis rojo violeta para cuenta de organismos coliformes totales. Aadir doble capa del mismo medio de cultivo una vez solidificada la primer capa. xii Cuenta total de Mesoflicos aerobios

CLCULO Y EXPRESION DE RESULTADOS METODO DEL HISOPO Superficie de manos Calcular el nmero de colonias por mano o manos, multiplicando por el volumen de diluyente empleado y dividirlo entre 2 en el caso de haber muestreado ambas manos. Reportar como UFC/superficie de mano. BIBLIOGRAFIA Procedimiento para el Examen Microbiolgico de Superficies y Utensilios. Secretaria de Salud. Direccin General de Epidemiologa. Laboratorio Nacional de Salud Pblica. Mxico 1990

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EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD DE UN DESINFECTANTE INTRODUCCION La eliminacin adecuada de los microorganismos constituye una fase importante en la higiene de las plantas que elaboran alimentos, esto se puede considerar como uno de los problemas principales en la presencia de enfermedad para los consumidores, en donde el alimento es el vehculo del microorganismo patgeno. Las superficies contaminadas, los utensilios y el equipo mal saneado, constituyen una fuente importante de microorganismos patgenos para los alimentos, por lo que es necesaria la utilizacin de algunos desinfectantes en estas fuentes de contaminacin. La utilizacin de sustancias como desinfectantes sobre los microorganismos patgenos es de gran inters, el conocer el metabolismo microbiano para entender los mecanismos de accin de los desinfectantes y sus implicaciones prcticas, ha dado lugar a mucha informacin a fin de desarrollar un concepto ms claro, sobre todo de la accin de los desinfectantes ms comnmente utilizados en la Microbiologa de los Alimentos. 1.- Mecanismos de accin de los desinfectantes comnmente usados en la industria alimentaria. La reaccin de los desinfectantes con los constituyentes celulares puede involucrar reacciones de xido-reduccin, hidrlisis, formacin de sales, transposicin con algunos grupos como los de las protenas, adsorcin en la interface, etc., lo anterior puede suceder en partes fundamentales de los microorganismos: lesin a la membrana celular, lesin al ncleo, a los genes y en consecuencia inhibicin de las enzimas. 2.- Lesin a la membrana celular: Algunos desinfectantes, como compuestos nitrogenados, fosforados, y los detergentes rompen la barrera osmtica permitiendo la salida de los componentes celulares metablicamente activos, destruyendo con esto a los microorganismos. Otros desinfectantes como el perxido de hidrgeno o los compuestos halogenados ejercen su accin antimicrobiana al reaccionar con los compuestos de la membrana citoplasmtica. 3.- Lesin al ncleo y a los genes: Algunos agentes tienen afinidad particular por los ncleos o genes de las clulas microbianas, por ej. Se tiene a los colorantes bsicos, como el cristal violeta, los cuales reaccionan con los cidos nucleicos de las nucleoprotenas quizs para la formacin de sales. Los desinfectantes que presentan metales pesados reaccionan con los grupos sulfhidrilo (-SH) de las nucleoprotenas inhibiendo la accin enzimtica, interrumpiendo con esto el crecimiento microbiano. Cualquier lesin en los genes se traduce en inhibicin de las enzimas que los regulan. Los compuestos como desinfectantes que inhiben a las enzimas se encuentran en el cido nitroso el cual desamina a ciertas bases del DNA, como a la adenina a la que convierte en hipoxantina, la citosina en uracilo y la guanina en xantina. En este grupo estn algunos agentes alquilantes como el xido de etileno, etilenmetasulfnico y las mostazas nitrogenadas, los cuales actan por la alquilacin de uno o ms de los tomos de nitrgeno de las bases del cido desoxirribonucleico (DNA), causando anomalas en el apareamiento de las bases en la hlice del DNA y tambin la prdida posiblemente de una de las bases. Otro grupo de antimicrobianos que reacciona con el DNA y que lo hacen intercalndose entre los pares de las bases son el bromuro de etilo y la proflavina. Los desinfectantes del cloro, iodo y las sales cuaternarias de amonio son los ms comnmente utilizados en la industria de alimentos, presentando ventajas y xiv

desventajas sobre su utilizacin. A continuacin se mencionan algunas de ellas de los tres grupos de desinfectantes. DESINFECTANTES VENTAJAS DESVENTAJAS

HIPOCLORITO (oxidacin de enzimas esenciales IODOFOROS (inactivacin de protenas por iodinacin) -

Barato Fciles de aplicar en pequeas cantidades Se usa en concentracin de 10 ppm Tiempo de exposicin corto (2 min 100 ppm) Acta contra esporas Compatible con detergentes aninicos Se usa en contraccin de 200 ppm No presenta olor ni sabor No mancha No son irritantes Tienen cualidades humectantes y de penetracin Acta sobre bacterias, hongos y virus Esta incorporado a un detergente tensoactivo aninico no inico o catinico

Es corrosivo Se inactiva por materia orgnica Deja olor y sabor desagradable

No actan contra esporas bacterianas Ms claro que el hipoclorito. Se inactiva por materia orgnica

SALES CUATERNARIAS DE AMONIO (Tenso activo, rompe membrana celular, inactiva enzimas

Estables en polvo seco o en pasta Sin olor No es corrosivo No es irritante de la piel Tiene poder residual Se usa en una concertacin de 200 ppm de NH4 Es ms activo en presencia de materia orgnica Es efectivo contra microorganismos Gram positivos y Gram negativos

Actividad antibacteriana limitada No es efectivo contra esporas ni muchos virus Es neutralizado por jabones Pueden crecer microorganismos en l Deja pelcula en superficies

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OBJETIVOS: Conocer la accin de los agentes destinados para la limpieza y desinfeccin de equipo, utensilios, superficies, etc., en una planta procesadora de alimentos. Evaluar la accin de los agentes destinados para lavado y/o desinfeccin de frutas y verduras. Conocer tcnicas utilizadas para evaluar la eficiencia de los desinfectantes. Evaluar la accin de procesos de lavado y/o sanitizacin o combinacin de ellos. PROCEDIMIENTO: Cortar la cantidad necesaria para efectuar evaluaciones de una verdura o fruta cruda sucia, lavada, desinfectada o combinaciones de estas condiciones. Aproximadamente 50,0 g. Utilizar coladera, tabla y un cuchillo limpio para realizar estas operaciones. 1. PRODUCTO SUCIO (sin lavar ni desinfectar) Tomar 10,0 g de la verdura o fruta cruda y sucia y colocar en un frasco de dilucin con 90,0 mL de solucin diluyente (dilucin 10 1) practicar diluciones hasta 10-4 o las que el tcnico analista juzgue convenientes, en tubos con 9,0 mL de solucin diluyente. Para cada dilucin tomar alcuotas de 1,0 mL, depositar en tantas placas de petri como grupos de microorganismos se quiera determinar y verter el medio de cultivo fundido y enfriado segn corresponda. Sugerido: Probar diluciones 10 1 a10 4 para la cuenta total de mesoflicos aerobios y 10 1 a10 3 para coliformes totales. 2. PRODUCTO LAVADO Depositar 10,0 g de la verdura o fruta cruda y sucia en una coladera y lavarla con una solucin jabonosa preparada con detergente en polvo o lquido, enjuagar con suficiente agua del grifo y depositar los 10,0 g de la verdura o fruta (lavada) en un matraz con 90,0 mL de solucin diluyente (dilucin 10-1) y realizar diluciones hasta 10-3 o las diluciones que el tcnico analista juzgue adecuadas, en tubos con 9,0 mL de solucin diluyente. Para cada dilucin tomar alcuotas de 1,0 mL, depositar en tantas placas de petri como grupos de microorganismos se requiera determinar y verter el medio de cultivo fundido y enfriado segn corresponda. Sugerido: Probar diluciones 10 1 a10 3 para la cuenta total de mesoflicos aerobios y 10 1 a10 2 para coliformes totales. 3. PRODUCTO LAVADO Y DESINFECTADO Preparar un desinfectante comercial en cantidad y tiempo de acuerdo con las indicaciones del producto. Sumergir 10,0 g de la verdura o fruta cruda lavada. Procedimiento.- Escurrir la solucin diluyente del matraz 10-1 de la verdura o fruta (producto lavado) del paso anterior. Sumergir en la solucin desinfectante durante el tiempo indicado en el marbete del producto. Escurrir los 10,0 g (lavados y desinfectados) y adicionar nuevamente 90,0 mL de solucin diluyente (diluyente 10-1) y realizar diluciones hasta 10-2 o las diluciones que el tcnico analista juzgue adecuadas, en tubos con 9,0 mL de solucin diluyente. Para cada dilucin tomar alcuotas de 1,0 mL, depositar en tantas placas de petri como grupos de microorganismos se requiera determinar y verter el medio de cultivo fundido y enfriado segn corresponda. Sugerido: Probar diluciones 10 1 a10 2 para la cuenta total de mesoflicos aerobios y 10 1 para coliformes totales. PRODUCTO DESINFECTADO (sin lavar) Preparar el desinfectante comercial en cantidad y tiempo de acuerdo con las indicaciones del producto. Sumergir 10,0 g de la verdura o fruta cruda sucia. Procedimiento.- Sumergir 10,0 g de la verdura o fruta sucia en una solucin desinfectante durante el tiempo indicado en el marbete del producto. Escurrir los 10,0 xvi

g (desinfectados) y adicionar nuevamente 90,0 mL de solucin diluyente (diluyente 10) y realizar diluciones hasta 10-3 o las diluciones que el tcnico analista juzgue adecuadas, en tubos con 9,0 mL de solucin diluyente. Para cada dilucin tomar alcuotas de 1,0 mL, depositar en tantas placas de petri como grupos de microorganismos se requiera determinar y verter el medio de cultivo fundido y enfriado segn corresponda. Sugerido: Probar diluciones 10 1 a10 3 para la cuenta total de mesoflicos aerobios y 10 1 a 10 2 para coliformes totales. NOTA: En cada uno de los casos (sucia, lavada, desinfectada y/o lavada y desinfectada) se utilizarn las diluciones adecuadas segn la experiencia del tcnico analista, empleando los medios correspondientes para cada uno de los grupos estudiados, y adems se pueden realizar las combinaciones que se requieran, es decir, evaluar el desinfectante sobre la superficie o el producto mismo, habiendo previamente lavado o no o las condiciones seleccionadas.

INCUBACION Mesfilos aerobios-Agar cuenta estndar. Incubar a 35 2/48 2 h. Organismos coliformes totales-Agar bilis y rojo violeta. Aadir doble capa una vez solidificada la primera capa. Incubar a 35 2 /24 2 h. Hongos y levaduras Agar papa dextrosa acidificado. Incubar a 26 2/3-5 das. Incubar a la temperatura y tiempos sealados para cada uno de los grupos microbianos. INTERPRETACIN Al finalizar el tiempo de incubacin, realizar los recuentos para obtener el % de reduccin o efectividad. Interpretacin: el producto debe cumplir con el valor de efectividad de 99,0 y 99.9% de reduccin en el tiempo de contacto, dosis y bajo las recomendaciones descritas en el marbete de cada producto. EXPRESIN Y CLCULO DE RESULTADOS. Utilizar la siguiente frmula para expresar el % de reduccin en cada una de las etapas, sucia, lavada, desinfectada y/o lavada/desinfectada: % de Reduccin = 100 B x 100 A A = Cuenta inicial B = Cuenta final obtenida Ejemplo 1: Cuenta total de mesoflicos aerobios: Cuenta inicial (sucia) 90 x 104 UFC/g :Con solucin desinfectante cuenta obtenida (desinfectada) 8 x 102 UFC/g

% de Reduccin = 100 8 x 102 x 100 = 99.9 % 90 x 104 Ejemplo 2: Cuenta de grupo colfirme total: xvii

Cuenta inicial (sucia)

70 x 103 UFC/g 10 UFC/g

Lavada y desinfectada: cuenta obtenida (lavada y desinfectada)

% de Reduccin = 100 10 x 100 = 99.9 % 70 x 103 BIBLIOGRAFA Instituto Politcnico Nacional. Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas. Departamento de Microbiologa. Manual de Laboratorio de Microbiologa Sanitaria. Association of Official Analytical Chemist. (1995). Official Methods of Analysis. 16 th Ed. AOAC 960,09. Arlington, VA. Instituto Mexicano del Seguro Social. (1990). Actividades Antimicrobianas de Sanitizantes, Germicidas y Detergentes. Mxico, D. F. Banwart G. S. (1979). Microbiologa Bsica de los alimentos. Ed. Bellaterra. Espaa. Frobisher, Hinsdill, Crabtree, (1974). Fundamentals of Microbiology. Ed. W. B. Saunders Company. USA. Gamboa, H. J. & Vela, A. H. (1985). Mecanismo de accin de los desinfectantes comnmente usados en las plantas de alimentos. Trabajo de Microbiologa de alimentos. Laboratorio de M. Sanitaria. IPN: Reddrish, G. F. (1961). Antiseptics, Desinfectants, Fungicides, and Chemical and Physical sterilization. Lea and Febiger 2a. ed. USA.

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MONITOREO DEL MEDIO AMBIENTE. OBJETIVO El monitoreo e identificacin de los microorganismos del ambiente permitir conocerlos y probar que desinfectantes o germicidas pueden atacarlos para controlar las reas, ya sean cuartos limpios, de preparacin estriles o no estriles, y cualquier rea de inters particular. EQUIPO Y MATERIAL Incubadora a diferentes temperaturas. Microscopio. Cuenta colonias. 1 placa de agar cuenta estndar 1 placa de agar bilis y rojo violeta 1 placa de agar papa y dextrosa PROCEDIMIENTO NOTA: Medios de cultivo.- El medio de cultivo de donde se aslan principalmente los microorganismos ambientales, es Agar Cuenta Estndar Tripticaseina. Se utiliza Agar Sabouraud o Agar Papa Dextrosa, para la investigacin especfica de hongos y levaduras, Agar BRV, para la investigacin del Grupo Coliforme y agares selectivos y/o diferenciales para patgenos. Tcnica de sedimentacin en placa.- Las placas con los medios de cultivo para monitoreo de los 3 grupos de microorganismos indicadores, se exponen al medio ambiente seleccionado, retirando la tapa de cada placa y colocando sta boca abajo. Se sugiere colocar las placas con los medios de cultivo lo ms cercanas entre s, para que la calidad del medio ambiente monitoreado sea homognea. Despus de 15 minutos de exposicin, las placas se tapan e incuban a 35 + 2 C/48 + 2 h. (bacterias) o 26 + 2 C / 3-5 das (hongos y levaduras). Considerar que el volumen de aire monitoreado tras exponer durante 15 minutos las placas con los medios de cultivo, equivale a 1 m3. Efectuar el cmputo por placa de medio de cultivo utilizado para cada grupo microbiano. Reportar el cmputo de cada grupo microbiano en UFC/m3. Opcional: despus de registrar caractersticas de desarrollo y morfologa colonial, hacer un frotis (ver al mismo tiempo, consistencia de colonia, color, bordes, elevacin, tamao). Teir con Gram y cuando sea necesario con otro colorante. Observar al microscopio. Las observaciones microscpicas, identificarn si son microorganismos Gram positivos Gram negativos, a veces se observan mezclados de una sola colonia, cocos Gram negativos con bacilos de diferentes tamaos Gram positivos, negativos amorfos.

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LMITE MXIMO PERMITIDO EN MEDIO AMBIENTE Prueba Mesoflicos aerobios Coliformes totales Hongos y levaduras Lmite permitido 15 UFC/m3 0 UFC/ m3 3 15 UFC/m (para la sumatoria de ambos cmputos)

Fuente: Standard Methods for the examination of Dairy Products.

BIBLIOGRAFIA Manual of Food Quality Control. 12. Quality Assurance in the Food Control Microbiological Laboratory. FAO.- Rome, 1991. Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 16 th Ed. (1992). Robert T. Marshall, Ph D, Editor. APHA, Washington D. C. Garanta de Calidad de los Laboratorios de Microbiologa Alimentaria. Organizacin Panamericana de la Salud. Organizacin Mundial de la Salud. Yolanda Ortega Dvalos. Fernando Quevedo. Copyright 1991. Mxico, D. F.

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PRUEBA DEL RETO MICROBIANO.

OBJETIVO El mtodo se basa en determinar el porcentaje de reduccin de un nmero determinado de microorganismos, cuando se pone en contacto con un germicida bajo condiciones de pruebas especficas.

MATERIAL Matraces Erlenmeyer de 250,0 mL, boca ancha con tapa de rosca. Probetas graduadas. Pipetas serolgicas y bacteriolgicas. Tubos de ensayo sin labio de 20,0 x 150,0 mm. Cajas Petri. Frasco cuadrado de dilucin de boca ancha con tapas de vinilo o baquelita. Bao de agua controlado a 25 C. Gradillas para los tubos Asa de 4,0 mm de dimetro y de 5,0-7,0 cm de longitud con porta asa.

MICROORGANISMOS DE PRUEBA Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa ATCC 6538 ATCC 11229 ATCC 15442-2

Nota.- Determinar su resistencia al fenol cada tres meses. La resistencia de E.coli debe ser similar a la de S.typhi con base en la seccin 960,09 del AOAC (1995) y la de S.aureus equivalente a las especificadas para este microorganismo en la seccin 960,09 del AOAC (1995) p.70-71.

PROCEDIMIENTO 1. Conservacin y preparacin de los microorganismos de prueba. Conservar las cepas del microorganismo, resembrndolas quincenalmente en tubos de 16,0 x 125,0 mm de agar nutritivo inclinado. Incubar a una temperatura de 35-37 C por un periodo de 20-24 horas. Posteriormente mantener los cultivos en refrigeracin. Antes de realizar la prueba, efectuar 2 resiembras diarias consecutivas, incubando en las condiciones indicadas anteriormente. A partir de estos cultivos, resembrar 5 tubos de 22 x 175mm que contengan 12,0 mL de agar nutritivo inclinado e incubar bajo las condiciones antes sealadas. Recuperar xxi

el crecimiento de cada tubo con 1,5 mL de solucin salina estril 0,85 % y estandarizar la suspensin en condiciones aspticas al 9,0% de transmitancia a 580,0 nm 10,0% de transmitancia a 650,0nm para obtener un promedio de cuenta bacteriana de 10,2 x 109 UFC/mL. Verificar por cuenta en placa, conservando la suspensin original en refrigeracin. 2. Preparacin de la muestra. Usar el producto a la concentracin sealada por el fabricante (directo o diluido). Medir exactamente y por duplicado 99,0 mL del producto o su dilucin. Transferir a un matraz Erlenmeyer de 250,0 mL, estril con tapn de rosca. Preparar otros 2 matraces con solucin reguladora de fosfatos diluida estril, los cuales se emplean para determinar el nmero inicial de microorganismos: (Matraz con 99,0 mL (solucin reguladora de fosfatos) + 1,0 mL de cultivo estandarizado (10,2 x 109 UFC/mL= 75-125 x 106 UFC/mL) = Control Cuenta Inicial. 3. Inoculacin. Agitar el matraz y suspender la agitacin justamente antes de la inoculacin para que en el momento de la misma, an exista un movimiento residual y as facilitar la incorporacin del inculo. Inocular individualmente 1,0 mL de la suspensin del microorganismo en el centro y sobre la superficie del lquido, evitando tocar con la pipeta el cuello o las paredes del matraz durante la inoculacin. Agitar y exactamente a los 30 segundos de la inoculacin, transferir 1,0 mL del cultivo expuesto a 9 mL de la solucin neutralizante; mezclar y transferir alicuotas de 1,0 mL y 0,1 a cajas petri estriles por dulicado agregar de 12,0-15,0 mL de medio agar para mtodos estndar con neutralizador (C). Homogeneizar, solidificar, invertir e incubar las placas durante 48 horas a 35-37 C. 4. Determinacin de la cuenta inicial. Transferir 1,0 mL de la suspensin microbiana (1,.2 x 109) a 99,0 mL de la solucin amortiguadora de fosfatos diluida y efectuar una lectura de 580,0 nm esperando que d 9,0 % y a 680,0 d 10,0 % . Hacer las diluciones decimales necesarias para obtener placas que contengan entre 30 y 300 colonias por placa de la dilucin inicial (1:100) hacer diluciones 1:99 (aprox.). Colocar alcuotas de 1,0 mL por duplicado de cada dilucin en cajas de petri estriles y de la ltima dilucin, transferir alcuotas de 1,0mL y 0,10 mL por duplicado. Agregar 12,0-15,0 mL de agar para mtodos estndares solidificar. Invertir e incubar las placas 48 horas a 35-37C. Despus del periodo de incubacin de todas las placas (control de inculo y del producto), contar las UFC y ver el por ciento de reduccin del producto. Para que la prueba sea vlida, el nmero de microorganismos en la suspensin del matraz 1:100, debe estar entre 75 y 125 x 106 UFC/mL. Para muestras que se analicen cada da, deben correrse paralelamente con un testigo del inculo en igualdad de condiciones. 5. Interpretacin. El producto debe cumplir con el valor de efectividad de 99,0 y 99.9,0 % de reduccin a los 30 segundos de contacto. xxii

EXPRESIN DE RESULTADOS. % de Reduccin = 100 - B x 100 A En donde, A = Cuenta inicial B = Cuenta obtenida Ejemplo 1: S aureus En germicida A

Cuenta Inicial Cuenta Obtenida

90 x 106 8 x 102 = 99,999%

% de reduccin = 100 - 8 x 102 x 100 90 x 106

Ejemplo 2: S.aureus Cuenta Inicial 90 x 106 En germicida B Cuenta Obtenida 8 x 103 % de reduccin = 100 - 8 x 103 x 100 = 99,98% 90 x 106 Ejemplo 3: S. aureus Cuenta Inicial 110 x 106 En germicida B Cuenta Obtenida 50 x 104 4 % de reduccin = 100 - 50 x 10 x 100 = 99,55% 110 x 106

BIBLIOGRAFA AOAC Official Methods of Analysis. 1995 Seccin 960,09 16th Ed. p.70-71. Actividades Antimicrobianas de Sanitizantes, Germicidas y Detergentes IMSS-1990.

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MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES

Agar Nutritivo Extracto de carne Peptona de gelatina Agar Agua destilada pH final 5,8 +/- 0,2 Mtodos Estndar para, agar Peptona de casena Extracto de levadura Dextrosa Agar Agua destilada 5,0 g 2,5 g 1,0 g 15,0 g 1,0 L 3,0 g 5,0 g 15,0 g 1,0 L

Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada, calentar hasta ebullicin para disolver por completo y ajustar el pH a 7,0 0,2 a 25 C. Distribuir en tubos de ensayo con tapn de rosca o en un matraz, despus esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Enfriar a 45-50 C y vaciar en cajas Petri. Puede volverse a fundir una sola vez cuando se necesite. Medios de agar para cuenta estndar, con neutralizante. Igual que agar para mtodos estndar, excepto que hay que adicionar 25,0 mL de solucin neutralizante y preparar. Pesar y re suspender la cantidad de cada uno de los medios indicados por el fabricante para un litro de agua. Disolver por calentamiento hasta ebullicin durante un minuto. Envasar de acuerdo a las necesidades y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Solucin neutralizante Azolecitano (lecitina de soya) Polisorbato 80 Solucin amortiguador de fosfatos 0,25 M

40,0 g 280,0 g 1,25 mL

Mezclar los ingredientes, disolverlos en agua destilada hasta obtener un volumen final de un litro; ajustar el pH a 7,2 y distribuir en porciones de 9,0 y 99,0 mL. Esterilizar a 121 C durante 15 minutos.

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Solucin amortiguadora de Fosfatos 0,25 M. Fosfato monobsico de potasio (KH2PO4) Agua destilada. En un matraz volumtrico disolver el KH2PO4 en 500,0 mL de agua destilada ajustar el pH a 7,2 +/- 0,1 utilizando solucin de NaOH 0,1 N. Llevar al aforo con agua destilada, mezclar y distribuir en porciones de 100 mL esterilizar a 121 C durante 15 minutos y conservar en refrigeracin. Solucin amortiguadora de fosfatos diluida. Tomar 1,25 mL de solucin amortiguadora de fosfatos 0,25 M y transferirla a un matraz volumtrico de 1,0 L. Llevar al aforo con agua destilada. Mezclar y distribuir en tubos y matraces proporciones de 9,0 y 99,0 mL respectivamente esterilizar a 121 C durante 15 min.

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