Вы находитесь на странице: 1из 6

УДК 579.871.08+577.112.385.4.

08
О. В. МОСИН, Е. Н. КАРНАУХОВА, А. Б. ПШЕНИЧНИКОВА,
Д. А. СКЛАДНЕЕ*. О. Л. АКИМОВА
Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М. В.
Ломоносова, 117571
НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва, 113545

Биосинтетическое получение деитериймеченного L-


фенилаланина, секретируемого метилотрофным мутантом
Brevibacterium rnethylicum
На примере L-фенилаланинсекретирующего мутанта Brevibacterium methylicum
продолжены исследования по использованию метилотрофных бактерий для
биосинтетического получения аминокислот, меченных стабильными изотопами.
Представлены данные по адаптации L-фенилаланинсекретирующего метилотрофа В,
methylicum к максимальной концентрации дейтерия в среде: 98% D2O и 2% CD3OD по
объему. Разработанный метод позволяет получать изотопно-меченный L-фенилаланин
разной степени изотопного обогащения, вплоть до полной замены атомов водорода на
дейтерий, что подтверждено данными масс-спектрометрического анализа. Контроль
биосинтетического включения дейтерия в секретируемые аминокислоты был осуществлен
с использованием производных типа метиловых эфиров N-дансил-аминокислот и
последующей масс-спектрометрией электронного удара.

Метилотрофные бактерии — группа микроорга- тантом В. methylicum за счет биоконверсии дейтеро-


низмов, способных расти на метаноле и других метанола на средах с тяжелой водой разного уровня
восстановленных производных углерода, являются дейтерирования.
весьма притягательными биотехнологическими объ-
ектами, возможности практического применения ко- УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
торых реализованы явно недостаточно [1, 2].
Одним из наиболее важных направлений работ с Бактериальные штаммы. Исследования проводили
метилотрофными микроорганизмами являются исс- с факультативным лейцинзависимым (макси-
ледования, направленные на поиск или конструиро- мальная потребность в L-лейцине — 100 мкг/мл)
вание новых продуцентов аминокислот и других метилотрофом В. methylicum, продуцентом L-фе-
биологически активных соединений. В плане нача- нилаланина, полученным из коллекции культур
тых исследований по получению аминокислот, ме- ВК ПМ НИИ генетики и селекции промышленных
ченных стабильными изотопами [3 — 6], практиче- микроорганизмов (ВКПМ В 5652).
Исходный штамм поддерживали на агаризованной
ский интерес представляет использование метилот- (2 %-ный агар) среде М9 [13] с метанолом (2 %).
рофов, особенно продуцентов аминокислот для пол- Штаммы хранили в водном 70 %-ном растворе
учения целевых соединений за счет биоконверсии глицерина при -10°.
низкомолекулярных меченых субстратов. Традици- Адаптированный к максимальному содержанию
онным подходом при этом остается селекция проду- дейтерия в среде лейциновый ауксотроф В. met-
центов биологически активных соединений (БАС) hylicum был получен в серии пассажей с последова-
[7,8]. тельным отбором хорошо растущих клонов на ага-
Безусловно, наиболее целесообразным является ризованных средах (с 2 % СDзОD по объему),
использование облигатных метилотрофов, которые содержащих ступенчатое увеличение концентрации
способны ассимилировать меченые Ci-субстраты в дейтерия (начиная с нсдсйтерированных сред, вплоть
качестве единственного источника углерода [9]. Как до полной замены воды и метанола на их дсйтери-
было показано на примере L-лейцинсскретирущего рованные аналоги).
облигатного метилотрофа Methylobacillus flagellatum, Адаптированный к дейтерию штамм В. methylicum
полная замена в среде метанола на его 13С-аналог поддерживали на агаризованных средах М9 (см.
практически не сказывается на величине лаг-фазы выше) с максимальным содержанием дсйтеро-ком-
и уровне накопления биомассы, а степень биосинте- понентов.
тического изотопного обогащения характеризуется Для приготовления питательных сред с различным
главным образом изотопной чистотой 13Ci-субстрата содержанием СОзОО и D2O использовали соли марки
[3]. «х. ч.», D2О (99,9 % D) и CD3OD (99,6 % О), получе-
Известно, что исчерпывающее биосинтетическое нные из Всесоюзного центра «Изотоп» (Санкт-Пе-
обогащение дейтерием бактериальных микроорга- тербург, РФ), а также L-лейцин (Reanal, Венг-
низмов при высоких концентрациях изотопа в среде рия). Для получения производных аминокислот
может вызвать ингибирование биосинтеза клеточ- использовали Н-диметиламинонафталин-5-сульфо-
ных протеинов и тем самым замедлить бактериаль- хлорид (дансилхлорид) (Sigma, США) и диазометан.
ный рост [10]. В отличие от микроводорослей [11], Для получения диазометана применяли N-нитрозо-
бактерии весьма чувствительны к высокому содер- метилмочевину, закупленную у Merck (Германия).
жанию дейтерия в среде и, как правило, не способны Посевной материал выращивали до ранней фазы
выдерживать концентрации оксида дейтерия более экспоненциального роста бактериальной культуры
чем 75 % [4, 12]. В связи с этим разработка способов на средах разного уровня дейтерирования, затем
возможной адаптации метилотрофных микроорга- вносили в ферментационные среды с соответствую-
низмов к максимальному содержанию дейтерия в щим изотопным насыщением D2O и СОзОD (табли-
ца) в количестве 5 об. % и культивировали, как
среде представляется очень актуальной. описано ниже.
Целью данной работы было исследование динами- Выращивание посевного материала и фермента-
ки роста микробной биомассы и секреции деитерий- цию проводили на синтетической среде М9 [13] с
меченного L-фенилаланина лейцинзависимым му- десятикратным избытком NH4C1 (так как в предва-
Влияние изотопного состава питательной среды на величину лаг-фазы, выход биомассы и время генерации В. methylicum
Номер Компоненты среды, об. % Выход Время
Лаг-фаза, ч биомассы, % от генерации, ч
опыта
Н20 D20 CHjOH CD3OD
1 98 0 2 0 24 100 2,2
2 98 0 0 2 30 92 2,4
3 73,5 24,5 2 0 32 90 2,4
4 73,5 24,5 0 2 35 86 2,6
5 49 49 2 0 40 70 3,0
6 49 49 0 2 44 60 3,2
7 24,5 73,5 2 0 46 56 3,5
8 24,5 73,5 0 2 49 47 3,8
9 0 98 2 0 60 33 4,4
10 0 98 0 2 64 30 4,8

Данные приведены для В. methylicum, не адаптированного к средам с высоким содержанием дейтерия.

рительных экспериментах по оптимизации состава Детекцию при ТСХ проводили 0,2 %-ным раство-
питательных сред показано, что такое увеличение ром нингидрина в ацетоне. N-Дансильные производ-
концентрации хлористого аммония в среде стимули- ные аминокислот идентифицировали в системе (Б)
рует биосинтез L-фенилаланина несмотря на неко- по характерной флуоресценции в УФ-свете.
торое увеличение продолжительности лаг-фазы) и Аминокислоты идентифицировали сопоставлени-
L-лсйцином. После стериллизации рН доводили до ем их спектральных и хроматографичсских характе-
величины 7,0—7,2 при помощи NaOH. В качестве ристик с литературными данными [14], сравнением
источника углерода использовали метанол (2 % от со стандартными аналогами, а также подтверждали
данными масс-спсктрометричсского (МС) анализа
объема среды) или его дейтериймеченный аналог. их производных.
Культивирование бактерий проводили при 37° в Масс-спектры электронного удара производных
условиях интенсивной аэрации растущей культуры аминокислот измерены на приборе МВ-80 A (Hitachi,
в колбах емкостью 750 мл с наполнением 100 — 150 Япония) при энергии ионизирующих электронов
мл среды. Морфологию клеток В. methylicum иссле- 70 эВ.
довали с помощью поляризационно-интерфсрснци-
онного микроскопа «Biolar» (Польша). Рост культу- РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ры контролировали на спектрофотометре «Beckman
DU 6» (США) при X 620 нм. Как известно, большинство микроорганизмов, рас-
Все эксперименты по биосинтетическому включе- пространенных в природе, к которым относятся ме-
нию дейтерия проводили параллельно с контроль- тилотрофы, не могут служить хорошими продуцен-
ным (см. таблицу) на стандартной недейтерирован- тами ароматических аминокислот, вследствие нали-
чия эффективных механизмов регуляции биосинтеза
ной среде. этих соединений в микробной клетке, хотя эта спо-
Для каждого эксперимента по биосинтетическому собность появляется у ряда их мутантных форм
введению дсйтериевой метки в В. methylicum клетки [15 — 17]. Активными микробными продуцентами
на ранней фазе экспоненциального роста осаждали L-фснилаланина являются, как правило, мутанты, у
центрифугированием (10000 мин"1, 5 мин). После которых снят негативный контроль со стороны таких
отделения биомассы супернатант лиофилизовали. ключевых ферментов биосинтеза этой аминокисл-
Сухой остаток супернатанта, содержащий фенила- оты, как префенатдегидратаза (ПД) и дезоксиара-
ланин, переводили в метиловые эфиры N-дансил- биногептулозофосфатсинтстаза (ДАГФ-синтетаза)
производных аминокислот, как описано в работе [3]. [18, 19]. Определенный интерес в связи с этим
ТСХ осуществляли на пластинках «Silufol» (Че-хо- представляет исследование способности продуциро-
Словакия) в системах: (А) — изопропанол-аммиак вать L-фенилаланин лейцинзависимым метилотроф-
(7:3) и (Б) — хлороформ-метанол-ацетон (7:1:1). ным мутантом В. methylicum, достаточно удобным,
Количественное определение секретируемого фе- хотя и малоизученным объектом для биотехнологи-
нилаланина производили методом ТСХ на пластин- ческого применения. Поэтому начальный этап биохи-
ках «Silufol» в системе (А). Образцы КЖ объемом 10 мических исследований В, methylicum был связан с
получением ауксотрофных мутантов, для которых в
мкл наносили на пластинки. Элюирование прояв- большинстве случаях характерны ограниченный спектр
ленных нингидрином пятен фенилаланина проводи- мутантных фенотипов и кроме того довольно высо-
ли 0,5 %-ным раствором хлористого кадмия в 50 %- кий уровень реверсий [20 — 23]. Исходный лейцин-
ном этаноле. Концентрацию аминокислоты опреде- зависимый штамм В. methylicum, продуцент L-фени-
ляли спектрофотомстрически с использованием кри- лаланина, был отобран в лаборатории генетики ме-
вой корреляции при X 540 нм. тилотрофов НИИ генетики и селекции промышлен-
Очистку метиловых эфиров N-дансил-производ- ных микроорганизмов на предыдущем этапе работы
ных аминокислот из КЖ, содержащей дейтерий, после обработки В. methylicum нитрозогуанидином
осуществляли с помощью колоночной (150 х 40 мм) по устойчивости к аналогу фенилаланина мета-
хроматографии на силикагеле L 40/100 (Chemapol, фторфенилаланину (50мкг/мл.). Выделенные таким
Чехо-Словакия) с градиентной элюцией системой образом аналогорезистентные мутанты конвертиро-
хлороформ-метанол (от 0 до 10 % метанола). вали метанол и накапливали при этом фенилаланин
в ферментационной среде. Сравнительные анализы пассажей на агаризованных средах (с 2 % СD3ОО
аминокислоты методом тонкослойной по объему) при ступенчатом увеличении
хроматографии и масс-спектрометрии показали, что концентрации оксида дейтерия в них (см. таблицу).
фенилаланин, секретиру-емый В. mcthylicum, Последовательно отбирали наиболее продуктивные
полностью идентичен коммерческому L- по уровню накопления дейтерированной биомассы
фенилаланину. клоны В. methylicum и пересевали их на среды с
Мы изучали влияние степени замещенности дей- большей степенью дейтерирования, вплоть до
терием низкомолекулярных субстратов воды и мета- полной замены воды и метанола на их
нола в составе питательных сред на рост полученного дейтерированные аналоги (выживаемость на
ауксотрофа, величину лаг-фазы и времени клеточ- полностью дейтерированных средах не более 40 %).
ной генерации (см. таблицу), а также секрецию Полученный в результате ступенчатого отбора шта-
дейтериймеченного фенилаланина. Продолжитель- мм В. methylicum, адаптированный к дейтерию, пе-
ность лаг-фазы, время генерации и максимальная реносили затем с максимально насыщенных дейте-
секреция фенилаланина В. melhylicum в условиях рием агаризованных сред на жидкие среды М9, приго-
изотопных экспериментов (см. таблицу, опыт 2, 4, товленные исключительно из 98 % D2O (99,9 % D) и
6, 8, 10) представлены на гистограмме (рис. 1). содержащие 2 % СОзОD, и культивировали, как
описано в эксперименте.
Динамика роста бактерии В. mеthylicum,
адаптированного к высокому содержанию дейтерия
Секреция в среде, и способность секретировать L-
, г/л фенилаланин в условиях максимально насыщенных
дейтерием сред представлены на рис. 2.
Секреция
Рис. 1.
Рис. 2.

Характеристики бактериального роста В.


methylicutn {выход биомассы, время генерации и максимальная
секреция фенилаланина) на средах с изотопным составом,
соответствующим номерам экспериментов 2, 4, 6, 8, 10 в
таблице

Как видно из представленных данных, в отсутст-


вие дейтериймеченных субстратов при росте
исходной бактерии на протонированной среде
продолжительность лаг-фазы не превышала 24 ч
(см. таблицу, опыт 1). С увеличением содержания
тяжёлой воды в среде продолжительность лаг-фазы
увеличивалась до 64 ч на средах с 98 % D2O и 2 %
CD3OD по объему (см. таблицу, опыт 10). Если дО время, ч
замена метанола на его дейтерированный аналог не Динамика роста В. methylicum (la, 10'а, 10d) и секреция
вызывала существенного ингибирования роста фенилаланина (16, 10'б, 10б) на средах с изотопным составом,
бактерий и не сказывалась на выходе микробной соответствующим номерам эксперимента в таблице: I а,б —
биомассы, то на средах с высоким содержанием исходный метилотроф на стандартной среде М9; 10'а,б — адап-
тированный к высокому содержанию дейтерия В. melhylicum на
оксида дейтерия микробный рост был заметно полностью дейтерированной среде; 10 а,б — неадаптированный
подавлен. Вследствие этого в экспериментах, где метилотроф на полностью дейтерированной среде
оксид дейтерия преобладал в среде (см. таблицу,
опыт 9, 10), выход биомассы был значительно ниже, Выход биомассы, время генерации и максималь-
чем в контрольных экспериментах и в тех случаях, ная секреции фенилаланина исходным мутантом
когда использовали простую воду и дейтеро-метанол (10) и мутантом, адаптированным к высокому содер-
(см. таблицу, опыт 2). жанию дейтерия в среде (10'), на средах, максималь-
Как видно, длительность времени генерации но насыщенных дейтерием, приведены в гистограм-
бактериальной культуры с увеличением изотопного ме на рис. 3 относительно контрольного (У). Срав-
насыщения среды дейтерием увеличивается. Из нивали ростовые данные адаптированного к дейте-
данных таблицы видно, что продолжительность лаг- рию метилотрофа и секрецию фенилаланина (опыт
фазы и время клеточной генерации бактерии при 10') с исходным В. methylicum на стандартной среде
переходе со стандартной на дейтерированные среды М9 (опыт I) и на полностью (98 % D2О) дейтери-
находятся в определенной корреляции. Так рованных средах с 2 % CD3OD (опыт 10).
например, в условиях эксперимента 10 продол- Как видно из графиков на рис. 2, степень заме-
жительность лаг-фазы увеличивается в 2,6 раза, а щенности дейтерием воды и метанола не оказывает
время генерации возрастает в 2,2 раза.
С целью увеличения эффективности изотопного
мечения клеточных БАС и аминокислот и интенси-
фикации роста метилотрофа на полностью
дейтерированных средах мы адаптировали
полученный мутант В. methylicum к максимальному
содержанию дейтерия в среде культивирования. Для
этого были проведены пять серий адаптационных
Продолжая обсуждать механизм секреции фени-
лаланина этим метилотрофом следует отмстить, что
общей особенностью сскретируемой целевой амино-
кислоты было значительное увеличение ее проду-
кции на ранней фазе экспоненциального роста В.
mehtylicum, когда выход микробной биомассы был
м• незначителен (см. рис. 2). Затем во многих экспери-
ментах наблюдалось, как правило, ингибирование
биосинтеза фенилаланина на поздней фазе экспо-
ненциального роста и снижение его концентрации в
среде. Как показали микроскопические наблюдения
за растущей популяцией микроорганизмов, подо-
бный характер динамики секреции фенилаланина не
коррелирует с качественными изменениями росто-
вых характеристик культуры на различных стадиях
роста, что служит подтверждением морфологической
и биомассы, % 0тк0нтрол»н<?го однородности микробной популяции. По-видимому,
L-Ptic, г/л накопленный в процессе роста фенилаланин ингиби-
Время ровал ферменты собственного пути биосинтеза. Кро-
ме того, как показано еще на других микробных
Рис. 3. Выход биомассы, время генерации и максимальная секреция продуцентах L-фенилаланина! при культивирова-
фенилаланина на средах с изотопным составом, соответствующим нии микроорганизмов без рН-статирования не иск-
номеру эксперимента в таблице: 10 — исходный метилотроф; 10' — лючено обратное превращение экзогенного фенила-
адаптированный к высокому содержанию дейтерия В. methylicum; 1 ланина в интермедиаторные соединения его биосин-
— исходный метилотроф на стандартной недейтери-рованной среде
теза [25, 26]. Кроме основной сскретируемой ами-
значительного влияния на секрецию фенилаланина, нокислоты в среде, как правило, присутствуют сле-
в то время как выход микробной биомассы на дей- довые количества других аминокислот (аланин, ва-
терированной среде значительно уменьшается. Не- лин, а также тирозин и триптофан) и других мета-
значительное снижение уровня секреции фенилала- болитов, четко детектируемых масс-спектрометри-
нина (до 0,5 г/л) наблюдалось лишь в изотопных чсским анализом [3].
экспериментах (см. рис. 2, 10 б), когда использовали Степень биосинтетического обогащения секрети-
исходный метилотроф на средах с максимальным руемого L-фенилаланина была определена масс-спе-
насыщением дейтерием. Уровень накопления микро- ктрометрическим анализом метиловых эфиров N-
бной биомассы адаптированным метилотрофом на дансильных производных аминокислот методом эле-
полностью дейтерированной среде выше, чем для ктронного удара. Согласно сравнительным данным
исходного В. methylicum (см. рис. 2, 10 а) , несмотря масс-спектрометрического анализа производных на-
на двухкратное увеличение продолжительности лаг- тивного и дейтерироваиного фенилаланина со сред
фазы (рис. 2, опыт 10' а), в то время как секреция разного уровня дейтерирования (см. таблицу), сте-
фенилаланина у адаптированного метилотрофа су- пень биосинтетического включения дейтерия в мо-
щественным образом не отличалась от таковой на лекулу фенилаланина коррелирует с концентрацией
недейтерированной среде. В отличие от адаптиро- дейтерия в среде. Так например, в масс-спектре
ванного к дейтерию В. methylicum, рост исходного дейтерированного производного фенилаланина (мо-
мутанта на полностью дейтерированной среде с 98%- лекулярная масса недейтерированного соединения
ной тяжёлой водой сильно ингибируется дейтерием 412), полученного из В. methylicum в условиях мак-
(см. рис. 2, 10 и). симального насыщения среды дейтерием (см. табли-
Как видно из рис. 3, время клеточной генерации цу, опыт 10), четко детектируется высокоинтенсив-
для адаптированного метилотрофа (2,5 ч) близко к ный пик молекулярного иона с m/z 420 (М+ + 8) и
исходному на стандартной среде. Несложный селек- менее интенсивный пик с примесью m/z 419 (М.++ 7).
ционный подход позволил получить штамм В. met- Предварительные данные свидетельствуют о высо-
hylicum, способный конвертировать дейтеро-метанол кой степени включения дейтерия в молекулу фени-
на максимально насыщенных дейтерием средах в лаланина в условиях полной замены воды и метанола
клеточные БАС и секретирусмый L-фенилаланин. на D2О и СDзOD, что составляет (с учетом
При этом выход фенилаланина у адаптированного точности метода) 7-8 атомов из 8 детектируемых по
мутанта не сократился (см. рис. 2). Таким образом, скелету молекулы. При этом лсгкообмсниваемые
было показано, что некоторые виды метилотрофных атомы D(H) амино- и карбоксильной групп не рас-
бактерий, например, факультативный метилотроф сматриваются.
В. methylicum, в принципе могут быть адаптированы Основными преимуществами В. methylicum, адап-
к высокому содержанию дейтерия в среде без потери тированного к максимальному содержанию дейтерия
ростовых и биосинтетических способностей бактери- в среде и способного конвертировать дейтеро-мета-
альной культуры. нол для получения униформно дсйтерированных
Механизм биосинтеза L-фенилаланина В. methy- аминокислот и белка (в отличие от некоторых тра-
licum и роль лейцина в этом процессе не объяснены диционных способов с использованием других мик-
окончательно. робных продуцентов [27, 28] и микроводорослей
Что же касается самого фенилаланина, то он, как [29]) являются хорошие ростовые и биосинтетиче-
известно, синтезируется в клетках микроорганизмов ские способности этого метилотрофа на максимально
и, в частности, в коринебактериях из своего предше- дейтерированных средах.
ственника — префеновой кислоты, которая через При помощи адаптированного штамма В. met-
стадию образования фенилпирувата превращается в hylicum можно достаточно быстро наработать в ла-
фенилаланин под действием клеточных трансаминаз
[24 — 26] .
бораторных условиях граммовые количества уни- 15. Shiio Jsamu. II Biotechnol. Amino Acid Prod. —
формно меченного дейтерием L-фенилаланина. Та- Токио, 1986. — P. 188 — 206.
ким образом, использование в прикладных целях 16.Максимова И. П., Олехнович И. II. Регуляция
биосинтеза
полученного в настоящей работе мутанта В. met- ароматических аминокислот у метилотрофных
hylicum, адаптированного к полностью дейтериро- бактерий: Биохимия и физиология метилотрофов.
ванным средам, содержащим тяжёлую воду и — Пущино, 1987. —С. 77 — 85.
дейтеро-метанол и, в частности, для 17.KadziM. etal.// ActaBiotechnol. — 1990. — V. 10. _
№ 1.— Р 93 — 98.
биосинтетического получения фенилаланина разной 18.Netrusov A. I., Dikanskaja E. M., Kulicova W. P.
степени обогащенности дейтерием {вплоть до Biochemical
полной замены всех атомов водорода на дейтерий) specifity of asydophilik methylotrops: Abst. of 13
является весьма эффективным, Intern. Cong.
of Microbiol. USA. Boston. August. 1982. — Boston:
В заключение следует отметить, что более высо- Academic
кая эффективность изотопного мечения клеточных press, 1982. —V. 1. — P. 61.
БАС может быть обеспечена путем полной замены 19.WunscheL., Fischer II., KieselB. II Z. Allg. Microb. —
1983. —P. 23. — № 3. — S. 189 — 196.
протонированных компонентов среды на их дейтери- 20.Noon D. M, Lindstrom M. E. II J. Bacteriol. —
рованные аналоги, а также используя лейцин, уни- 1986. —V. 166. — P. 581 —590.
формно меченный дейтерием, который в принципе 21.Levering P. Д., Tiesma L., Woldedorp J, P. et
можно получать из гидролизатов тотального белка al. // Arch. Microbiol. — 1987. — V. 146. — P. 346
— 352.
биомассы этого метилотрофа. Анализ биосинтетиче- 22.КлецоваЛ. В., Говорухина Н. И. и др. //
ского включения дейтерия в аминокислоты тоталь- Микробиология. — 1987. — Т. 56. — Вып. 6. —
ного белка биомассы будет опубликован отдельно. С. 901 — 906.
Авторы выражают благодарность ст. н. с. ВНИЦ 23.Whitta S., Sinclair M. I., Holloway В. W. II J.
Gen. Microbtol. — 1985. — V. 131. — P. 1547 —
молекулярной диагностики О. С. РешетовоЙ за уча- 1549.
стие в получении масс-спектров изучаемых образцов 24.Fazel A. M. et al. // J. Bacteriol. — 1979. — V.
производных аминокислот. 138. — P. 805 — 815.
25.Stenmark S. L., Pierson D. L., Glover G. I. et al. //
Nature (London). — 1974. — V. 247. — P. 290 —
ЛИТЕРАТУРА 292.
26.Ворошилова Э. Б., Гусяпшнер М. М., Жданова II. И.
1. Романовская В. А., и др. // Биотехнология. — 1989. — Т. 5. — № 2. —
С. 137 — 141.
2. Мохамед эль Сайд II Микробиология. — 27.Рувинов С. В., Сапоровская М, В., Беликов В. М.
1986.— Т. 48. — № 2. — С. 97 — 107. II Изв. Акад. наук. — 1989. — № 10. — С. 2341 —
2.Никонова Е. С., Доронина Н. В., Троценко Ю. А. II 2343.
Прикл. биохим. и микробиол. — 1986. — Т. 22. — 28.Сох J., Kyle D., Radmer R. et al. // Trends.
С. 557 — 561. Biotechnol. — 1988. — V. 6. — P. 279 — 282.
3.Karnaukhova Е. N., Resheiova О, S., Semenov S. I. 29. Crespi II. L. Synth, and Appl. Isot. Labeled
et al. // Amiiio Asids. — 1993. — V. 4. — P. i — 14. Compounds. Proc. 2nd Int. Symp., 3-6. Sept. 1985. —
4.Skladnev D. A., Baev M. V., Shilova S. Ун. // Amsterdam, Oxford, N.-Y., Tokyo: Elscvier, 1986. —
Proceedings of 6th Europ. Conf. on Biomass for P. I l l — 112.
Energy, — Industry and Enviroment. — Athens. —
1991. — P. 47 — 51.
5.Skladnev D. A., Reshetova O. S. II J. Pharm. Belg. —
1992. — V. 47. — № 3. — P. 216.
6.Pshenichnicova А. В., Reshetova O. S. it Abstr. O. V. MOSIN, E. N. KARNAUKHOVA, A. B.
of 4th International Meeting on Bio-Chroma to graphy PSHENICHNIKOVA,
and Molecular Biology. — La Grand Motte. France, D. A. SKLADNEV, O. L. AKIMOVA
1992. — № 63. Moscow Institute of Fine Chemical Technology, 117571
7.Tsygankov Y. D., Kasakova S. M. (I Arch. Institute for Genetics and Selection of Industrial
Microbiol. — 1987. V. 149. — P. 112 — 119. Microorganisms, Moscow, 113545
8.Stone S., Goodwin P. M. II J. General Microbiol. —
1989. — V. 135.__p. 227 235. Biosynthetical Preparation of D-Labeled L-
9.Patent USA № 0220951, 1988.
10. Borek E., Rittenberg D. II Proc. Natl. Acad. ScL — Phenylanine Produced by Methylotrophic Mu-
1960. — V. 46. — P. 777.
11.Keiko Vnno., Hiroki Busujima., Shegeki Shimba. // tant Brevibacterium methylictim
Chem. Pharm. Bull. — 1988. — V. 36. — № 6. — P.
1828 — 1833. Using L-phenylalanine producing mutants B. methylicum the
12.Papadimitriou C., Wenzei M. II Z. Naturforsch. — study on application of methylotrophic bacteria to the biosynthetic
1989. — V. 44. — S. 1053 — 1057. production of amino acids labeled with stable isotopes was
13.Миллер Дж. II Эксперименты в молекулярной developed. The data are presented on the adaptation of
генетике. — М-: Мир, 1976. — С. 393. phenylalanine producing methylotroph B. methylicum to maximal
14.Боллигер X. Р., Бреннер М., Шпшль Э. И deuterium concentration in medium: 98 per cent D2O and 2 per
Хроматография в тонких слоях. — М.: Мир, 1965. cent CD3OD (v/v). The method developed enables to obtain
— С. 395 — 408. deuterium labeled L-phenylalanine with various content of isotope
up to complete substitution of hydrogene by deuterium which is
approved by means of mass spcctrometry. The biosynthetical
introduction of deuterium into produced amino acids was valued
with the use of electron impact mass spectrometry of the methyl
ethers of N-dansyl amino acids derivatives.

Оценить