Spektroskopi analitik

Spektroskopi analitik adalah ilmu mengenai penentuan jumlah senyawa yang terdapat di dalam suatu sampel dengan cara mengukur secara ajurat/banyaknya cahaya yang diserap atau diemisikan oleh atom-atom atau molekul-molekul yang terdaoat di dalam sampel tersebut. Spektroskopi berbeda-beda, bergantung pada jenis atau panjang gelombang radiasi elektromagnetik yang diserap atau diemisikan oleh atom atau molekul. Penjelasan rincian mengenai smua jenis analisis instrumental modern berada di luar cakupan buku ini, akan tetapi, kegunaan spektroskopi dalam analisis obat-obatan sangat penting dan akan dijelaskan. Cahaya merupakan suatu bentuk radiasi elektromagnetik karena terdiri atas komponen elektrik dan magnetik yang berosilasi dalam arah yang saling tegak lurus dan tegak lurus terhadap arah perjalanan radiasi di sepanjang ruangan (lihat Gambar 7.1).

Gambar 7.1 Diagram radiasi elektromagnetik Spektrum lengkap radiasi elektromagnetik ditunjukkan pada Gambar 7.2, dengan kisaran mulai dari gelombang radio dan televisi berenergi rendah hingga sinar gamma yang berenergi sangat tinggi. Bagian terkencil spectrum elektromagnetik yang dapat dideteksi oleh mata manusia (kira-kira 400-700 nm) disebut spektrum tampak, dan spektroskopi yang dilakukan pada kolorimetri. Bagian panjang gelombang ini dinamakan spektroskopi tampak atau spektrum elektromagnetik yang melewati bagian ujung merah

spektrum tampak, disebut bagian infra merah, yang memiliki panjang gelombang lebih panjang dan energi lebih rendah dari cahaya tampak. Sama halnya, bagian spektrum yang melewati ujung violet, spektrum tampak, disebut bagian ultraviolet, yang memiliki yang memiliki panjang gelombang lebih pendek dan energi lebih besar dari cahaya tampak.

Radiasi eloktromagnetik dapat dianggap mengitari ruangan, dan

sebagai suatu bentuk gelombang yang pada suatu percobaan tertentu,

jenis radiasi yang digunakan

bergantung pada informasi yang dibutuhkan dari percobaan tersebut. Salah satu istlah pada radiasi elektromagnetik yang sering digunakan adalah panjang gelombang cahaya. Panjang gelombang didefinisikan jarak dari satu puncak gelombang ke puncak berikutnya (dari palung ke palung). Dan biasanya dinyatakan nanometer (nm, 10-9 m) agar diperoleh bilangan terukur yang masuk akal (Gambar 7.3). Simbol untuk panjang gelombang adalah , yang berasal dari huruf Yunani lambda. Energi yang terkandung dalam masing-masing kuantum energi dari berkas radiasi pada panjang gelombang tertentu berbading terbalik dengan panjang gelombang. Ini berarti gelombang radio dengan panjang gelombang beberapa ratus meter memiliki energi yang rendah, sementara sinar gamma dan sinar -X adalah bentuk radiasi dengan panjang gelombang pendek dan berenergi tinggi.

Gambar 7.3 Panjang gelombang cahaya. Istilah lain yang sering digunakan dalam spektroskopi adalah bilangan gelombang dan frekuensi. Bilangan gelombang didefinisikan sebagai jumlah gelombang per satuan panjang (biasanya dinyatakan dalam satuan : balikan sentimeter (cm-1, 1 cm = 10-2 m) dan merupakan balikan panjang gelombang dalam cm, yaitu 1/. Penggunaan bilangan gelombang biasanya terbatas pada spektroskopi inframerah.
2

Frekuensi didefinisikan sebagai jumlah gelombang yang diemisikan dari sumber per detik; satuan frekuensi adalah hertz (Hz; 1 Hz = 1 gelombang per detik ), dan simbol yang digunakan adalah v (hurut Yunani nu). Frekuensi dan panjang gelombang dihubungkan oleh suatu tetapan yang disebut kecepatan cahaya dengan simbol c. Nilai ini (kira-kira 3 x 108 m/dtk) merupakan hasil kali antara frekuensi dan panjang gelombang, yaitu : Kecepatan cahaya = frekuensi x panjang gelombang atau c=v x Karena frekuensi dan bilangan gelombang berbading terbalik dengan panjang gelombang, energi foton berbanding lurus dengan keduanya. Jika suatu atom molekul terpanjang dengan radiasi elektromagnetik, energy dapat diserap melalui salah satu dari ketiga cara di bawah ini: 1. Energi dapat menaikkan elektron dari orbital ikatan menuju orbital antiikatan yang berenergi lebih besar sehingga disebut transisi elektronik. 2. Energi dapat bekerja untuk meningkatkan getaran atau osilasi atom di sekitar ikatan kimia. Ini diistilahkan sebagai transisi getaran. 3. Energi dapat menyebakan peningkatan putaran atom di sekitar ikatan kimia, yaitu transisi putaran. Perbedaan energi di antara efek-efek ini sangat besar, energi yang dibutuhkan untuk menghasilkan transisi getaran kurang lebih 100 kali lebih besar dari yang dibutuhkan untuk menghasilkan transisi putaran. Sama halnya, transisi elektronik memerlukan energi hampir 100 kali lipat lebih besar dari yang diperlukan untuk transisi getaran. Hal ini penting karena dua alasan : pertama, tiap transisi elektronik harus dikaitkan dengan transisi getaran dan putaran; kedua, karena transisi elektronik memerlukan energi yang sangat banyak, hanya cahaya dengan panjang gelombang pendek yang memiliki energi yang cukup untuk dapat melakukan transisi elektronik. Sebagai contoh, radiasi inframerah dapat mencapai getaran dan putaran yang meningkat di sekitar ikatan kimia, tapi energi yang dimiliki tidak cukup besar untuk menaikkan elektron ke orbital antiikatan dan menghasilkan transisi elektronik. Ultraviolet atau cahaya tampak umumnya diperlukan untuk menghasilkan transisi elektronik.
3

Walaupun spektroskopi dapat dilaksanakan pada jenis senyawa yang berbeda-beda, dengan konfigurasi elektronik yang berbeda-beda, kebanyakan dari pekerjaan kuantitatif (dan semua contoh yang ada di dalam buku ini) akan melibatkan sistem elektron (pi). Elektron (juga disebut elektron gerak) adalah elektron yang ditemukan dalam ikatan-ikatan rangkap. Ikatan rangkap karbon-karbon terdiri atas satu ikatan (sigma) dan satu ikatan , sedangkan ikatan rangkap tiga terdiri atas satu ikatan dan dua ikatan . Elektron-elektron ini dapat dieksitasi dan dinaikkan ke orbital antiikatan berenergi tinggi dengan mudah. Jika elektron jatuh kembali keadaan dasar, energi ini dilepaskan dan dapat diukur dengan spektrofotometer. Bagian molekul yang bertanggung jawab terhadap penyerapan cahaya disebut kromofor (lihat gambar 7.4), dan terdiri atas ikatan rangkap dua atau rangkap tiga, terutama jika ikatan rangkap tersebut terkonjugasi (ikatan rangkap dan ikatan tunggal pada strukturnya berselangseling). Semakin panjang ikatan rangkap dua atau rangkap tiga terkonjugasi di dalam molekul, molekul tersebut akan semakin mudah menyerap cahaya. Senyawa-senyawa aromatik yang mengadung cincin benzen akan menyerap cahaya ultraviolet dengan panjang gelombang 254 nm, dan sifat ini digunakan dalam berbagai analisis spektroskopik dan pada detektor untuk sistem kromatografi. Jika kromofornya lebih luas, molekul akan tereksitasi oleh cahaya berenergi rendah, hingga jika kromofornya sangat luas, energi yang berasl dari cahaya tampak cukup kuat untuk mengeksitasi elektron kromofor dan senyawa tersebut akan menyerap cahaya tampak. Jenis molekul ini, yang menyerap cahaya pada bagian tampak dari spektrum elektromagnetik, dikatakan berwarna karena mata kita akan mendeteksi cahaya yang dipantulkan balik dari senyawa tersebut, yang akan menjadi warna komplementer terhadap cahaya yang diserap. Ingat, cahaya putih berasal dari gabungan seluruh warna pelangi, dan dapat terbagi menjadi warna-warna konstituennya oleh prisma atau tetesan air. Sebagai contoh, jika molekul zat warna menyerap cahaya dengan panjang gelombang merah, jingga, dan kuning, mata kita akan mendeteksi cahaya pantulan biru, hijau, dan ungu dan kuta akan melihat zat warna tersebut berwarna biru. Sama halnya, zat warna berwarna merah akan meyerap cahaya biru dengan panjang gelomban pendek dan memantulkan merah dan jingga ke mata kita. Sifat-sifat ini dimanfaatkan pada penggunaan indikator untuk titrasi (lihat Bab 6) yang spektrum penyerapan (serta warna) indikatornya berubaha sesuai dengan pH larutan.

O Benzen Antrakuinolon

O HO S O Jingga metal Gambar 7.4 Contoh-contoh kromoform Efek pH terhadap spektrum N =N N

CH3

CH3

Jika suatu grafik tingkat penerapan cahaya (diukur sebagai yang diistilahkan dengan serapan, akan didefinisikan pada halaman 162) diplotkan terhadap panjang gelombang, akan diperoleh spektrum penyerapan lengkap suatu molekul (Gambar 7.5). Panjang gelombang dengan serapan (A) terbesar disebut maks (dibaca lambda maks), dan merupakan karakteristik kromofor. maks suatu senyawa terkadang digunakan dalam British Pharmacopoeia untuk mengidentifikasi obat-obatan dan senyawa-senyawa yang belum dikenal.

Gambar 7.5 Plot serapan cahaya vx

Panjang gelombang pada saat maks terjadi akan berupa suatu tetapan untuk tiap senyawa, tapi seperti kebanyakan tetapan di dalam ilmu sains, maks dapat mengalami perubahan. Hal ini tidak sepenuhnya berita buruk, karena banyak informasi yang berguna mengenai senyawa dapat diperoleh hanya dengan mengamati geseran yang terjadi pada maks, contohnya, ketika suatu senyawa mengalami ionisasi. Geseran maks menuju panjang elombang yang lebih panjang dikenal sebagai geseran batokromik atau geseran merah, karena merah adalah warna bagian ujung pada panjang gelombang yang panjang, spektrum tampak. Geseran batokromik biasanya terjadi karena kerja auksokrom. Auksokrom adalah gugus fungsi yang menempel pada kromofor yang tidak menyerap energi cahayanya sendiri, tetapi memengaruhi panjang gelombang cahaya yang diserap kromofor. Contoh auksokrom di antaranya adalah gugus NH2, -OH, -SH. Gugusgugus fungsi ini memiliki pasangan elektron tidak terikat (non-bonded electron) yang dapat berinteraksi dengan elektron pada kromofor dan memungkinkan terjadinya penyerapan cahaya yang memiliki panjang geombang yang lebih panjang. Contoh yang baik dari efek ini adalah membandingkan nilai maka benzen dan anilin (juga disebut fenilamin atau aminobenzen), ditunjukkan pada Gambar 7.6. NH2

Benzen

Anilin

Gambar 7.6 Strukur benzena dan anilin. maks benzen adalah 204 nm, sedangkan maks anilin adalah 230 nm. Hal ini disebabkan pasangan elektron menyendiri pada NH2 yang berinteraksi dengan elektron cincin untuk meningkatkan densitas elektron di keseluruhan cincin, terutama pada posisi orto dan para dari cincin, seperti yang ditunjukkan pada gambar 7.7.

N
-

NH2

NH2

NH2

Gambar 7.7 Efek + M analin Efek mesomerik (atau M) ini terlihat jika anilin ditempatkan dalam larutan dengan pH 814, yaitu ketika anilin basa tidak terion. Jika anilin ditempatkan di dalam larutan dengan pH < 7 , maks kembali ke nilai sebenarnya yang diperoleh untuk benzen (203 nm). Dalam hal ini, anilin di dalam larutan asam bereaksi dan membentuk garam anilinium. Pasangan elektron menyendiri pada nitrogen kini terlibat dalam pembentukan ikatan dengan ion H+ dan tidak lagi berfungsi sebagai auksokrom. Struktur anilin hidroklorida dutunjukkan pada Gambar 7.8.
+

NH3 Cl-

maks = 203 nm

Gambar 7.8 Struktur anilin hidroklorida dan nilai maks nya. Geseran maks menuju panjang gelombang yang lebih pendek disebut dengan efek hipsokromik atau geseran biru, dan biasanya terjadi jika senyawa dengan auksokrom basa terion, dan pasangan elektron menyendirinya tidak lagi dapat berinteraksi dengan elektronelektron kromofor. Efek hipsokromik dapat juga terlihat jika spektrum digunakan pada pelarut-pelarut berbeda atau pada suhu elevasi. Jenis gesekan spektrum ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi obat-obatan yang menngandung gugus fungsi amin aromatic, misalnya anestetik benzokain lokal (lihat Gambar 7.9).

O H2N C O C2H5

Gambar 7.9 Struktur Benzokain.

7

Efek batokromik dan hipsokromik jarang terlihat dalam isolasi. Efek batokromik biasanya terkait dengan adanya peningkatan intensitas cahaya yang diserap, sedangkan efek hipsokromik biasanya terjadi dengan adanya penurunan serapan. Efek yang menyebabkan terjadinya peningkatan serapan cahaya disebut efek hiperkromik, sedangkan efek yang menyebabkan penurunan intensitas serapan cahaya disebut efek hipokromik. Mahasiswa sering mengalami kebingungan dalam mengingat keempat kata yang digunakan untuk menggambarkan geseran
maks.

Cara yang terbaik untuk mengingat istilah-istilah ini adalah

mungkin dengan mengingat hiper- berarti suatu peningkatan, hipo- suatu penurunan, dan gesekan menuju panjang gelombang yang lebih panjang disebut geseran merah, sedangkan geseran menuju panjang gelombang yang lebih pendek disebut geseran biru atau dengan alternatif lain, yaitu dengan mengingat Gambar 7.10. Efek-efek hiperkromik digunakan dalam penelitian obat-obatan antikanker untuk mengukur banyaknya obat yang diberikatan dengan DNA. Jika larutan dupleks atau untai ganda, DNA, dipanaskan dengan hati-hati, heliks ganda akan mulai terbuka. Sehingga memanjakan basa heterosiklik pada pusat dupleks. Melalui percobaan dapat diamati bahwa jika serapan larutan DNA pada panjang gelombang 260 nm maningkat, efek hiperkromik akan timbul. Obat-obatan yang terikat dengan DNA menstabilkan molekul dan mengurangi tingkat hiperkromisitas yang teramati.

Gambar 7.10 Perubahan yang terjadi pada maks. Obat-obatan yang mengandung gugus-gugus fenolik, misalnya perasetamol (lihat Gambar 7.11), juga menunjukkan geseran spektrum pada ionisasi. Pada fenol, yang merupakan suatu asam lemah dengan pKa kira-kira 10, ionisasi meningkat intensitas penyerapan cahaya dan posisi maks bergerak menuju panjang gelombang yang lebih panjang. Ini terjadi karena ionisasi dan hilangnya atom H dalam bentuk ion H+ menghasilkan muatan negatif penuh pada oksigen (ion fenoksida) yang dapat berinteraksi dengan cincin secara

lebih efektif bila dibandingkan dengan pasangan elektron menyendiri yang terdapat pada molekul yang tidak terion. Untuk fenol ditunjukkan pada Gambar 7.11. O H N C CH3

OH Parasetamol OH O+ H+

O
-

O
-

Gambar 7.11 Struktur parasetamol dan ionisasi fenol.

Peralatan
Alat yang digunakan untuk mengukur intensitas cahaya yang diserap oleh atom atau molekul disebut spektrofotometer. Jenis spektrofotometer yang tersedia berbeda-beda, bergantung pada cahaya yang digunakan, apakah berkas cahaya tunggal atau berkas cahaya sampel dan pembanding secara terpisah, dan apakah pengukurannya dilakukan pada panjang

gelombang tetap atau memindai spektrum pada berbagai panjang gelombang. Seperti pada sebagian besar alat analitik, akurasi, presisi, dan biayanya sangat bervariasi. Secara umum, semua spektrofotometer memiliki gambaran serupa dengan yang ditunjukkan pada Gambar 7.12

Sumber cahaya
Sumber cahaya atau lampu yang digunakan adalah dua lampu terpisah yang digunakan secara bersama-sama, yang mencakup seluruh daerah tampak dan daerah ultraviolet spektrum elektromagnetik. Untuk cahaya tampak putih, digunakan lampu tungsten. Lampu ini tidak lebih canggih dibandingkan dengan lampu bola yang filamennya terbuat dari tungsten logam. Anda munkin saja membaca buku ini dengan menggunakan cahaya dari salah satu lampu ini. Lampu tungsten memancarkan cahaya dengan panjang gelombang 350 2000 nm dan memadai untuk kolorimetetri. Untuk senyawa yang menyerap pada daerah ultraviolet spektrum, diperlukan lampu deuterium. Deuterium merupakan salah satu isotop berat hydrogen yang memiliki satu neutron lebih banyak dari hidrogen biasa di dalam nukleusnya. Lampu deuterium merupakan sumber berenergi besar yang mengemisikan cahaya dengan panjang gelombang kira-kira 200 370 nm dan digunakan pada semua spektroskopi di daerah ultraviolet spektrum. Alat dengan panjang gelombang tetap, memungkinkan operator memilih lampu yang diperlukan untuk suatu penetapan kadar, sedangkan alat pemindaian, yang menghasilkan suatu plot seluruh spektrum penyerapan sampel, mengganti lampu secara otomatis.

10

Monokromator
Pada sebagian besar pengukuran kuantitatif, cahaya yang digunakan harus

monokromatik, yaitu cahaya dengan satu panjang gelombang tertentu. Cahaya mokromatik ini didapatkan dengan melewatkan cahaya polikromatik (yaitu cahaya dengan berbagai panjang gelombang) pada sebuah monokromator. Monokromator pada spektrofotometer modern ada dua jenis, yaitu prisma atau kisi difraksi. Prisma adalah suatu potongan kuarsa berbentuk segitiga, yang membiaska (atau membelokkan) cahaya yang melaluinya. Tingkat pembiasan ini bergantung pada panjang gelombang cahaya, sehingga seberaas cahaya putih dapat dipecah menjadi warna-warna komponennya dengan melewati sebuah prisma. Prisma tersebut kemudian diputar untuk memilih panjang gelombang tertentu yang diperlukan untuk penetapan kadar (Gambar 7.13). Efek ini identik dengan pembentukan pelangi, saat cahaya dari matahari terpecah menjadi tujuh komponen warna (merah, jingga, kuning, hijau, biru, nila dan ungu) melalui pembiasan pada tetesan air hujan.

Gambar 7.13 Diagram sebuah prisma Kisi difraksi adalah suatu potongan kecil gelas kaca yang di atasnya terdapat banyak garis berjarak sama, telah dipotong-potong menjadi beberapa ribu per millimeter kisi, dan menghasilkan suatu struktur yang tampak seperti sisir kecil. Jarak antara potongan-potongan tersebut kurang lebih sama dengan panjang gelombang cahaya, sehingga seberkas cahaya polikromatik akan dibiaskan menjadi panjang gelombang komponen-komponennya oleh kisikisi tersebut. Kisi-kisi tersebut kemudian diputar untuk memilih panjang gelombang yang penetapan kadar untuk pengujian (Gambar 7.14).

Gambar 7.14 Diagram kisi difraksi

11

Detektor
Setelah cahaya melewati sampel, penurunan intensitas yang terjadi karena penyerapan diukur oleh detektor. Detektor biasanya berupa suatu alat elektronik yang pintar disebut tabung fotopenggenda (photomultiplier tube) (lihat Gambar 7.15), yang mengubah intensitas berkas cahaya menjadi sinyal elektrik yang dapat diukur dengan mudah, dan juga bertindak sebagai amplifier (penguat) untuk meningkatkan kekuatan sinyal secara terus menerus. Cahaya memasuki tabung dan meabrak katoda, sehingga melepaskan elektron yang bergerak ke arah anoda yang berada di atasnya. Jika elektron menabrak anoda ini, elektron-elektron tersebut melepaskan elektron lebih banyak lagi kemudian akan bergerak ke anoda yang berada di atasnya, dan proses ini akan terulang kembali. Dengan cara inilah terbentuk kaskade elektron dan sinyalnya diperkuat.

Gambar 7.15 Diagram tabung fotopengganda Begitu meninggalkan tabung fotopengganda, sinyal elektrik segera dihubungkan dengan suatu perekam jika diperlukan hasil cetakan, atau yang lebih umum, dihuungkan ke suatu layar yang dapat menampilkan spektrum penyerapannya. Spektrofotometer modern saat ini kebanyakan dihubungkan dengan computer pribadi (personal computer) agar dapat menyimpan banyak data atau untuk menyediakan akses ke tempat kumpulan spektrum yang tersimpan pada piranti keras computer tersebut. Ini memungkinkan pembandingan spektrum yang tersimpan di piranti keras dengan spektrum yang dihasilkan melalui percobaan di laboratorium dan membantu di dalam mengidentifikasi senyawa-senyawa tidak dikenal.

12

Pengukuran percobaan serapan

Tahapan pengukuran dengan spektrofotometer adalah sebagai berikut : 1. Monokromator diatur sesuai dengan panjang gelombang pengukuran, katupnya ditutup untuk mencegah cahaya mencapai detektor, dan alat diatur untuk serapan yang tidak terbatas. Ini sering dilakukan secara otomatis pada saat pemanasan oleh alat modern. 2. Katup dibuka, pelarut (atau blangko) ditempatkan pada jalan cahaya, dan alat diatur sehingga serapan menjadi nol. Blangko biasanya hanya berupa pelarut yang digunakan untuk penetapan kadar, tapi pada dasarnya, seharusnya semua komponen yang terdapat di dalam matriks sampel kecuali sampel yang sedang ditentukan. Ini berarti dalam penetapan kadar yang kompleks, larutan blangko harus dibuat tepat sesuai dengan komposisi pelarut / medium sampel yang akan diujikan, dan harus diekstraksi atau diperlakukan dengan cara yang sama persis dengan perlakuan terhadap sampel. 3. Larutan sampel (atau uji) ditempatkan pada jalan cahaya dan serapannya dibaca langsung oleh alat.

Pengenceran
Bagian terpenting pada penetapan kadar spektroskopi bukanlah kinerja spektrofotometer (walaupun akurasi alat diperiksa secara berkala), melainkan penyiapan larutan uji dan larutan pengenceran yang akurat larutan stok dengan menggunakan peralatan gelas volumetrik, yang diperkenalkan pada Bab 6, yaitu pipet dan labu ukur. Prosedur yang umum dilakukan adalah menyiapkan serangkaian pengenceran untuk digunakan sebagai grafik kalibrasi seperti contoh kerja di bawah ini.

Contoh kerja
Anda diberikan larutan stok yang mengandung larutan obat 50 g/ml. siapkan 100 ml larutan yang mengandung 5, 10, 20, dan 30 g/ml obat. Langkah pertama adalah menghitung volume larutan stok 50 g/ml yang diperlukan untuk masing-masing pengenceran. Ini dapat dilakukan dengan menggunakan hubungan di bawah ini. [Yang diperlukan] x volume yang diperlukan [Stok] [ ] melambangkan konsentrasi obat. Hubungan ini akan lebih mudah diingat sebagai :

13

[Yang diinginkan] x volume labu [Yang dimiliki] Dengan menggunakan hubungan ini, larutan 30 g/ml disiapkan dari (30/50) x 100 = 60 ml larutan stok dan diencerkan dengan pelarut hingga mencapai volume 100 ml. Larutan 20 g/ml disiapkan dari (20/50) x 100 = 40 ml larutan stok yang dengan pelarut diencerkan hingga mencapai volume 100 ml, dan seterusnya untuk keseluruhan pengenceran. Cara lain untuk menyiapkan pengenceran-pengenceran ini adalah dengan menyiapkan masing-masing pengenceran dari larutan dengan konsentrasi terdekat. Cara ini dikenal dengan pengenceran berseri dan dilaksanakan sebagai berikut. Larutan 30 g/ml dan 20 g/ml disiapkan seperti cara di atas. Larutan 10 g/ml disiapkan dari larutan 20 g/ml (50 ml larutan 20 g/ml diencerkan hingga 100 ml dengan pelarut) dan larutan 5 g/ml disiapkan dari larutan 10 g/ml dengan cara yang sama. Pengenceran berseri ini mempunyai keuntungan, yaitu penggunaan larutan stok yang lebih sedikit (100 ml dibandingkan dengan 130 ml yang dibutukan pada contoh ini), dan digunakan bilamana harga obat atau regen mahal atau suplainya terbatas.

Aspek kuantitatif spektroskopi

Cahaya yang melewati suatu senyawa mengalami penurunan intensitas akibat tiga proses : 1. Pemantulan pada perbatasan fase (cairan/udara, kaca/cairan, dan lain-lain). Pemantulan ini terjadi karena adanya perbedaan indeks bias pada bahan yang berbeda yang dilewati cahaya. 2. 3. Hamburan cahaya karena ketidakhomogenan sampel. Serapan oleh atom atau molekul yang terdapat di dalam larutan. Hilangnya intensitas karena nomor (1), dapat diatasi dengan menggunakan larutan blangko yang tepat, karena efek perbatasan fase, pada larutan uji dan larutan blangko akan sama. Efek hambatan cahaya nomor (2) dapat diminimalkan dengan menyiapkan sampel secara hati-hati, yaitu dengan memastikan bahwa sampel terlarut dengan sempurna di dalam pelarut yang dipilih, yaitu tidak adanya gelembung udara yang menempel pada sel sampel, serta tidak ada sidik jari, debu, maskara, ketombe, atau material yang tidak diinginkan lainnya pada bagian luar sel yang akan memengaruhi keakuratan pengukuran serapan.

14

Kehilangan intensitas dengan alasan nomor (3) merupakan yang kita perhatikan dalam pengukuran.

Hukum Beer dan Lambert

Aspek-aspek kuantitatif spektrofotometri didasarkan pada dua hukum yang sangat mirip. Pertama adalah hukum Beer (Gambar 7.16), yang menyatakan bahwa intensitas seberkas cahaya monokromatik yang parallel menurun secara eksponensial dengan konsentrasi molekul penyerap. Hukum Beer dapat dinyatakan secara matematika sebagai : I = I0e kc I0 adalah intensitas cahaya yang terdapat di dalam sampel, I adalah intensitas cahaya yang ditransmisikan oleh sampel, k adalah suatu tetapan, dan c adalah konsentrasi sampel.

Gambar 7.16 Diagram hukum Beer Dalam bentuk logaritma, I0 Log = I Log (I0 / I) adalah kuantitas yang tidak berdimensi (logaritma perbandingan intensitas cahaya), dan ditetapkan sebagai serapan. Serapan merupakan nilai yang diukur dan diplotkan pada spektrofotometri. Jadi Hukum Beer menyatakan bahwa serapan sebanding dengan konsentrasi. Hubungan yang kedua adalah hukum Lambert, yang menyatakan bahwa intensitas seberkas cahaya monokromatik yang paralel menurun secara eksponensial pada saat melewati cahaya ketebalan medium homogen, secara metematika dinyatakan sebagai: = kc

15

I = I0e kl

(7.1)

I dan I0 sama dengan yang sebelumnya, l adalah ketebalan medium yang dilewati cahaya, dan k adalah tetapan (yang lain). Dalam bentuk logaritma, I0 Log I Serapan sebanding dengan ketebalan medium. Kedua persamaan dasar ini sangat mirip sehingga dapat digabungkan menjadi satu, yaitu hukum atau persamaan Beer Lambert, yang dapat dinyatakan dengan: I0 Serapan = Log I k disini adalah tetapan lainnya, nilainya bergantung pada satuan yang digunakan untuk konsentrasi, c. jika satuan knsentrasi adalah molaritas (yaitu jumlah mol per liter), tetapannya adalah (huruf Yunani epsilon) dan dikenal dengan keterserapan molar. memiliki satuan L mol-1 cm-1, walaupun satuannya jarang digunakan. sama dengan serapan larutan 1 persamaan Beer Lambert dituliskan sebagai: A = cl (7.4)
M

= kl

(7.2)

= kcl

(7.3)

di dalam sel

setebal 1 cm dan biasanya bernilai besar, yaitu kurang lebih 10.000 20.000. pada kasus ini,

Jika konsentrasi sampel dinyatakan dalam persen berat per volume (% b/v) (yaitu gr/100 ml), tetapan yang digunakan adalah A 1%, 1 cm, biasanya dituliskan sebagai A1 , dan disebut serapan spesifik dengan satuan dl g-1 cm-1 walaupun nilai A1 biasanya juga dinyatakan tanpa satuan. Nilai A1 sangat berguna dalam analisis farmasi dan farmaseutikal, untuk sampel yang berat molekulnya mungkin sampel tiak diketahui (misalnya, ketika menganalisis suatu makromolekul, seperti protein) atau suatu campuran beberapa komponene yang dianalisis di dalam sampel yang sama. Hal ini menghasilkan bentuk persamaan Beer Lambert yang paling berguna : A = A1 cl (7.5)

16

Dari persamaan diatas, nilai dan A1 saling berhubungan, dan salah satunya dapat dihitung dari nilai lainnya dengan menggunakan persamaan (7.6) : A1 x massa molekular relatif = 10 Seperti yang disebutkan diatas, serapan didefinisikan sebagai log I0 / I; buku teks lama menggunakan istilah ekstingsi (punahan), sedangkan naskah lama menyebutkan rapatan optis. Ketiga istilah tersebut memiliki arti yang sama, tapi serapan adalah istilah yang harus digunakan dalam seluruh spektroskopi analisis. Dua istilah lain untuk intensitas cahaya di dalam spektroskopi : Transmitan, didefinisikan sebagai perbandingan I/I0 Persentase transmitan, merupakan perbandingan yang sama yang dinyatakan dalam persentase, yaitu 100 I/I0 Penggunaan kedua istilah ini di dalam spektroskopi analitis terbatas untuk spektroskopi inframerah karena tidak seperti serapan, kedua istilah ini tidak memberikan hubungan linear jika diplotkan terhadap konsentrasi. (7.6)

Metode penetapan kadar obat

Ada dua metode penggunaan pengukuran spektroskopik dalam analisis obat, yaitu metode penerapan kadar absolut dan komparatif, dan metode mana yang digunakan bergantung pada daerah mana di samudra atlantik anda melaksanakan analisis. Di Inggris dan Eropa, persamaan Beer Lambert cenderung digunakan pada metode penetapan kadar absolut. Pada prosedur ini, serapan ditentukan melalui percobaan, dan persamaan Beer Lambert diselesaikan untuk mendapatkan nilai c, yaitu konsentrasi obat. Dengan alasan ini, British Pharmacopoeia dan European Pharmacopoeia menggunakan nilai A1 dalam monografi obat. Pada US Pharmacopoiea, metode penetapan kadar komparatif lebih disukai. Pada jenis penetapan kadar ini, larutan standar obat yang akan dianalisis disiapkan, serapan sampel dan standar ditentukan pada kondisi yang sama, dan konsentrasi sampel dihitung dari hubungan. Auji = Astd [standar] [uji] (7.7)

17

[uji] adalah konsentrasi sampel dan [standar] adalah konsentrasi standar yang disiapkan. Metode penetapan kadar komparatif memiliki keuntungan, yaitu tetap dapat digunakan walaupun obat mengalami reaksi kimia selama penetapan kadar (misalnya, pembentkan derivat berwarna agar dapat dilakukannya pengukuran di daerah tampak spektrum). Akan tetapi, kekurangannya adalah harus tersedianya sampel asli obat untuk perbandingan. Jika melakukan penetapan kadar obat secara spektroskopi, seringkali perlu dibuat sampel standar analit dengan berbagai konsentrasi dan ditentukan serapan masing-masing sampel larutan tersebut. Jika data-data ini diplotkan, akan diperoleh sebuah garis lurus dengan slop positif yang melalui titik asal. Pembuatan grafik seperti ini tidak hanya menegaskan bahwa hukum Beer Lambert berlaku untuk penetapan kadar pada panjang gelombang pengukuran, tetapi juga memungkinkan grafik tersebut untuk digunakan pada tujuan-tujuan kalibrasi. Larutan dengan konsentrasi yang tidak diketahui, disiapkan dengan cara yang sama persis dengan larutan standar. Kemudian serapannya dibaca dari grafik kalibrasi dan dihitung konsentrasinya. Larutan standar yang disiapkan secara terpisah dari sampel dengan cara ini dikenal sebagai standar eksternal. Teknik yang lebih teliti melibatkan penggunaan standar internal. Standar internal adalah senyawa yang memiliki struktur kimia dan sifat-sifat fisika yang sama dengan sampel yang dianalisis. Standar internal harus ditambahkan ke dalam sampel yang akan dianalisis sebelum ekstraksi atau penetapan kadar dimulai, dan kemudian berada di dalam matriks sampel selama penetapan kadar berikutnya. Pada penetapan kadar sampel yang kompleks, biasanya diperlukan beberapa perlakuan pendahuluan pada sampel dan pemulihan sampel dari proses ekstraksi tidak dapat 100%. Jika digunakan standar internal, kehilangan sampel akan tercermin dari kehilangan standar pada jumlah yang sama, dan perbandingan sampel terhadap standar akan bernilai tetap. Standar internal digunakan terutama dalam analisis kromatografi (terutama kromatografi gas dan kromatografi cair kinerja tinggi). Pada analisis kromatografi, fluktuasi parameter-parameter instrumental (misalnya, laju alir fase gerak) berpengaruh pada keakuratan. Pada analisis spektroskopi tertentu, digunakan pendekatan yang sama terhadap penggunaan standar internal, yaitu teknik penambahan standar. Pada teknik ini, dilakukan penambahan larutan standar analit dengan volume meningkat ke dalam suatu sampel bervolume tetap, dan pembuatan grafik kalibrasi. Grafik pada penetapan kadar penambahan standar memiliki kemiringan positif, tetapi memotong sumbu y pada nilai serapan positif. Jumlah obat di dalam sampel diperoleh melalui ekstrapolasi grafik kalibrasi ke titik

18

perpotongan antara garis dengan sumbu -x (yaitu ketika y = 0 didalam persamaan garis), seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7.17.

Gambar 7.17 Grafik kalibrasi yang menggunakan metode penambahan standar Metode penambahan standar banyak digunakan dalam spektroskopi atom (misalnya, penentuan ion-ion Ca2+ di dalam serum dengan menggunakan spektrofotometri emisi atom), dank arena beberapa alikuot sampel dianalisis untuk menghasilkan grafik kalibrasi, akurasi dan presisi penetapan kadar harus ditingkatkan.

Spektroskopi inframerah
Spektroskopi inframerah merupakan teknik yang sangat berguna untuk pengdentifikasian senyawa-senyawa yang tidak dikenal, misalnya produk dari suatu sintesis atau metabolit kemih dari seekor hewan percobaan, terutama ketika digunakan bersama-sama dengan teknik elusidasi struktur lainnya, seperti resonans magnetik nuklir dan spektrometri massa. Daerah inframerah spektrum elektromagnetik merupakan daerah cahaya dengan panjang gelombang 2,5 15m (yaitu 2,5 x 10-6 - 15 x 10-6 m) dan penyerapan cahaya ini oleh molekul menyebabkan perubahan energi getaran molekul pada keadaan dasarnya. Seperti yang telah dinyatakan sebelumnya, transisi getaran selalu terkait dengan perubahan pada putaran atom di sekitar ikatan kimia. Ini analog dengan transisi elektronik pada penyerapan energy ultraviolet yang juga menghasilkan transisi getaran dan putaran. Kegunaan inframerah berdasarkan pada fakta bahwa masing-masing puncak pada spektrum dapat ditentukan sebagai suatu ikatan atau gugus fungsi tertentu di dalam molekul. Ini sering berarti bahwa spektrum inframerah adalah kompleks, dengan adanya kemungkinan sebanyak 20-30 puncak berada pada satu spektrum. Akan tetapi, identifikasi senyawa-senyawa kimia yang tidak dikenal dibuat menjadi mudah karena beberapa gugus fungsi selalu tampak pada daerah spektrum inframerah yang sama. Ikatan-ikatan tunggal (misalnya, O H, N H, C H) menyerap pada bagian spektrum berfrekuensi tinggi (kira-kira 4000 2100 cm-1). Ini disebabkan oleh rendahnya massa atom hidrogen yang menyebabkan getaran terjadi pada frekuensi tinggi. Ikatan rangkap tiga
19

(misalnya, CN-) menyerap pada frekuensi kira-kira 2100 1900 cm-1 sementara ikatan rangkap dua (misalnya C=O, C=C) menyerap pada frekuensi kira-kira 1900 1500 cm-1. Deaerah spektrum inframerah memiliki bilangan gelombang kira-kira kurang dari 1500 cm-1 akibat peregangan molekul secara akurat. Daerah spektrum ini disebut daerah sidik jari, karena pola puncak yang terjadi pada derah ini khas bagi senyawa yang diujikan dan tidak ada senyawa lain yang memilikinya. Sifat-sifat ini digunakan di dalam British Farmacopoeia yang menyatakan bahwa dua sampel akan dikatakn sama jika spektrum inframerah yang diperoleh pada kondisi yang sama, serupa secara keseluruhan, yaitu puncak yang sama berada pada posisi dan intensitas yang sama. Spektrum inframerah pembanding dari sampel otentik sebuah obat dipublikasikan di dalam BP untuk pemeriksaan identitas sampel yang tidak dikenal.

Analisis kuantitatif dengan menggunakan spektroskopi inframerah

Aturan Beer Lambert yang diturunkan di atas (persamaan 7.3) berlaku juga pada serapan radiasi inframerah obat molekul. Selain itu, spektrum penyerapan inframerah memiliki kelebihan dibandingka dengan penyerapan ultraviolet yang lebih umum, yaitu jumlah pita yang ada lebih banyak. Seringkali (dimungkinkan untuk) memilih pita penyerapan untuk setiap komponen suatu campuran yang memiliki sedikit atau tidak memiliki interferens di antara pita-pita tersebut. Karena alasan-alasan ini, spektroskopi inframerah sering digunakan secara kuantitatif di laboratorium analitik untuk menentukan konsentrasi obat di dalam larutan. Kurva kalibrasi untuk penetapan kadar dapat diperoleh (dan berdasarkan hukum Beer) dengan mengubah spektrum yang tercetak menjadi I0 dan I dengan menggunakan teknik garis dasar, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7.18. Jarak dari garis dasar ke bagian paling bawah halaman ditunjukkan dengan I0, yaitu cahaya yang tersedia untuk penyerapan, sedangkan jarak dari puncak ke bagian paling bawah halaman ditunjukkan sebagai I, yaitu cahaya yang ditransmisikan melalui sampel. Bentuk logaritma (bilangan dasar 10) perbandingan I0 / I diperoleh sebagaimana sebelumnya untuk mendapatkan nilai serapan. Perhatikan bahwa spektrum inframerah biasanya diplot terbalik sehingga serapan nol berada di puncak spektrum (seperti yang biasanya ditunjukkan) dan serapan 100% berada pada bagian dasar. Perlu diperhatikan juga bahwa spektroskopi inframerah memiliki idiosinkrasi (keanehan) karena menggunakan bilangan gelombang (kebalikan sentimeter, cm-1) dan bukan panjang gelombang sumbu x, dan persentase transmitan (bukan serapan) pada sumbu y.

20

Gambar 7.18 Penerapan teknik garis dasar Perbedaan utama antara spektroskopi inframerah dan ultraviolet terletak pada konsentrasi yang diperlukan untuk penetapan kadar. Pada spektroskopi inframerah, harus disiapkan larutan sampel 10% b/v. Ini berarti panjang lintasan sel yang digunakan dalam inframerah sangat pendek., biasanya 0,025 0,1 mm (kalau tidak, nilai serapannya akan terlalu besar). Masalah lain pada spektrum inframerah adalah pelarut yang digunakan dalam penetapan kadar (biasanya kloroform atau diklorometan) juga memiliki ikatan kimia dan akan menyerap radiasi inframerah pada beberapa bagian spektrum sehingga mengaburkan penyerapan sampel pada panjang gelombang tersebut. Sampel disiapkan di dalam larutan, mull atau pasta yang dibuat dengan paraffin cair (Nujol), atau di dalam cakram padat yang dibuat melalui trituasi dengan kalium bromide kering dan kemudian dilanjutkan dengan pengempaan dalam pengempa hidraulik.

Fluorimetri
Fluorimetri adalah suatu teknik analitik yang berdasarkan pada emisi energi elektromagnetik oleh molekul. Kromoform molekul dapat menyerap cahaya (biasanya pada daerah ultraviolet spektrum elektromagnetik) dan mengemisikannya kembali (biasanya pada daerah tampak spektrum) untuk diukur dengan sebuah detektor. Untuk melakukan hal ini, kromofor (terkadang disebut fluorofor) harus dilindungi dari proses normal yang dapat menyebabkan hilangnya energi pada keadaan tereksitasi (misalnya, benturan antar molekul). Cahaya yang diemisikan oleh sampel selalu memiliki panjang gelombang yang lebih panjang (berenergi lebih rendah) dibandingkan dengan cahaya yang diserap oleh molekul. Hal ini dikarenakan proses transfer energi yang terjadi di dalam keadaan tereksitasi molekul tidak efisien 100%. Sebagian energi yang terserap hilang (misalnya, pada transisi getaran) sehingga cahaya yang

21

diemisikan sebagai fluoresensi memiliki energi yang lebih rendah dibandingkan cahaya yang diserap. Alat yang digunakan untuk mengukur fluoresensi, yaitu spektrofluorimeter, memerlukan sumber cahaya berenergi besar (biasanya lampu busur xenon) untuk membebaskan energi yang diperlukan untuk mengeksitasi molekul, dan detektor alat tersebut biasanya ditempatkan pada posisi 90o terhadap sumber cahaya untuk meminimalkan deteksi cahaya langsung dari sumber cahaya. Spektrofluorimeter juga memerlukan dua monokromator, satu monokromator untuk memilih panjang gelombang cahaya eksitasi, dan yang lainnya untuk memilih panjang gelombang cahaya yang diemisikan oleh sampel. Spektrofluorimeter analitik banyak digunakan dalam analisis farmaseutikal, terutama untuk penetapan kadar obat yang sangat potensi (highly potent drug) yang terdapat di dalam obat-obatan dalam jumlah yang sangat sedikit. Ada dua kelebihan utama penggunaan fluorimetri dibandingkan dengan spektroskopi ultraviolet : 1. Keberadaan dua monokromator, dan fakta bahwa tidak semua molekul dengan kromofor berfluoresensi, menunjukkan bahwa fluorometri lebih spesifik dibandingkan dengan spektroskopi ultraviolet biasa. Ini memungkinkan obat yang berfluoresensi tetap dapat ditentukan kadarnya walaupun terdapat senyawa-senyawa lain yang dapat mengganggu apabila menggunakan penetapan kadar spektroskopi ultraviolet. 2. Fluorimetri kira-kira 100 kali lebih sensitive dibandingkan dengan spektroskopi ultraviolet dan ideal untuk analisis obat-obat potensi dalam jumlah yang sangat kecil. Contohnya adalah steroid digoksin di dalam Tablet Digoksin BP dan senyawa kontrasepsi etinil estradiol yang memiliki kadar hanya 30 g per tabletnya.

Pemadaman
Sesuai dengan namanya, fenomena ini merupakan penguraian intensitas cahaya yang diemisikan selama fluoresensi. Pemadaman ini ada dua jenis, yaitu pemadaman sendiri dan pemadaman oleh yang lain, yaitu senyawa non-fluoresensi.

22