71:06-3/151

РОССИЙСКАЯ
ГОСУДАРЙ-ЙВЕННОЕГ
[Г
ОБЩЕЙ ПАТРДОРИИ-И-ПАХОФЙЗЦОЛОГИИ
Начальник ) а ^ р 2 | Щ ^ 7 ^ . "^^^>:

ЖУКОВА АННА ГЕННАДЬЕВНА

СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ И
МЕХАНИЗМЫ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ЗАЩИТЫ ИРИ
АДАИТАЦИИ К ИЗМЕНЕНИЮ УРОВНЯ КИСЛОРОДА.
(экспериментальное исследование)

14.00.16. - натологическая физиология

03.00.04. - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой стенени доктора биологических наук

Иаучные консультанты:
член-корресиондент РАМИ, доктор
медицинских наук, нрофессор
В.В. Мороз,
доктор биологических наук
Т.Г.Сазонтова

Москва - 2005
 2
ОГЛАВЛЕНИЕ
Стр.
Введение 5

Обзор лнтературы 13

Глава Л. Роль свободнорадикальных нроцессов в организме 13

1.1. Активные формы кислорода 13

1. 2. Источники активных форм кислорода в организме 17

1.3. Роль свободнорадикального окисления в клетке 23

1.4. Роль активных форм кислорода в редокс-сигнализации 27

Глава 2. Современные нредставления о стратегии защиты клеток от неблагонрн-

ятных факторов 33

2.1. Роль гиноксией индуцируемого фактора - HIF-1 в синтезе защитных систем в

клетке 34

2.2. Система антиоксидантной защиты клетки 40

2.3. Гем-оксигеназа: функция, регуляция, биологическая роль 49

Глава 3. Современные нредставлення о механнзмах адантацин к разлнчным фак-

торам среды 70

3.1. Адаптация к интервальной нормобарической гиноксии 72

Глава 4. Материалы и методы исследования 78

4.1. Биохимические методы исследования 78

4.1.1. Подготовительные процедуры 78

4.2. Основные биохимические методы 79

4.2.1. Индукция свободнорадикального окисления in vitro и определение свободнора-

дикальных продуктов по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) 79

4.2.2. Определение скорости транспорта Са^"^ в сарконлазматическнй ретикулум (СР)

миокарда 80

4.2.3. Метод Westem-блот анализа 83

4.2.4. Определение активности ферментов антиоксидантной защиты 84

4.2.5. Определение концентрации белка 85

4.3. Фнзнологические модели 86

4.3.1. Острая нормобарическая гипоксия 86

 3
4.3.2. Острое стрессорное воздействие 87

4.3.3. Модель ишемического и реперфузионного повреждения миокарда 88

4.3.4. Кратковременная остановка системного кровообращения и последующая реани- 88

мация
4.5.5. Адаптация к гипербарической оксигенации и нормобарическая
гипероксическая тренировка §9

4.3.6. Адаптация к нормобарической гипоксии (ИНГТ), а также к периодам гипоксии и

умеренной гипероксии 39

Результаты исследований и их обсуждение 91

Глава 5. Механизмы иовреждеиия мембрапиых структур ири острых воздействи-

SIX. Дииамика и ткаиесиеиифичиость развития ответа 91

5.1. Тканеспецифические особенности включения компонентов клеточной редокс-

сигнализации - HIF-la, НОх-1, HSP70 и ферментов антиоксидантной защиты в дина- 9I
мике носле острой гипоксии
5.1.1. Влияние острой гипоксии на динамику уровня фактора транскрипции - HIF-la в
разных органах крыс 92

5.1.2. Влияние острой гипоксии на уровень экспрессии НОх-1 и HSP70 в разных орга-
нах крыс 93

5.1.3. Влияние острой гипоксии па активность ферментов антиоксидантной защиты в

разных органах крыс 97

5.1.4. Роль компонентов клеточной защиты в формировании резистентности мембран-

ных структур разных органов в динамике после острой гипоксии j QQ

5.1.5. Влияние острой гипоксии на резистентность Са-транспортирующей системы

сарконлазматического ретикулума (СР) миокарда к действию эндогенных повреждаю-
щих факторов

5.2. Клеточные механизмы устойчивости сердиа к стрессориым воздействиям у

крыс Вистар и Август

5.2.1. Уровень защитных систем в миокарде у крыс Вистар и Август при стрессе 110

5.2.2. Устойчивость к свободнорадикальному окислению, действию нротеаз и высоко-

го уровня Са2+ мембранных структур миокарда крыс Вистар и Август при стрессор-
ных воздействиях , ^ -,

5.2.3. Влияние иммобилизационного стресса на резистентность клеточных структур

 4
миокарда крыс Вистар и Август в изолированных сердцах 118

5.3. Аитиоксидантная занщта и чувствительность миокарда к свободнораднкаль-

ному окисленню у крыс Внстар и Август нри ишемии и ренсрфузии j 23

5.4. Уровень защитных белков и рсзистентность мембранных структур Разных

органов ири реаиимации иосле времсиной остаиовки системного кровообраще-
ния у крыс с генетически детермииированным разным тином новедения ч-^л

Глава 6. Измеиенне соотнощения нро- и аитиоксидантных факторов в клетке с

номощыо экзоге1Н1ых добавок: тканеснецифичность и эффективность ^ ^0

6.1. Перфторан и нроксанол как модуляторы антиоксидантного статуса организ-

^^ 150
6.2. Влияние кратковременного и длительного применения СОД на соотношение про-
и антиоксидантных факторов в коже ^55

Глава 7. Адаитацнонная защита организма от новрсждающнх воздействий 162

7.1. Периодическая гипероксическая гипербарическая и пормобарическая тренировка:

тканеспецифичность действия j 53

7.2. Адаптация к нериодам пониженного и относительно повышенного уровня кисло-

рода от нормоксического

7.2.1. Тканеснецифичность влияния кратковременной интервальной нормобарической

гипоксической тренировки на уровень про- и антиоксидантных систем в сердце, мозге
и печени

7.2.2. Сравнение эффективности достижения адаптационного защитного эффекта па

мембранные структуры различных органов крыс при пормобарической гипоксической
тренировке в разных режимах , од

Заключеиие 191

Выоды 199

Снисок литературы 202

 5
ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Гипоксические и ишемические повреждения

являются основой или сопутствующими факторами патогенеза многих заболева-
ний. Поэтому изучение механизмов этих повреждений на всех уровнях организма
и разработка методов их профилактики и коррекции составляют важнейшую про-
блему медицины.
Одним из ключевых механизмов повреждения клеток при ишемии, стрессе,
гипоксии и реоксигенации является чрезмерная активация свободнорадикального
окисления, обусловленная повышенным уровнем образования активных форм ки-
слорода (АФК). Однако известно, что повышение уровня АФК вызывает не только
повреждение мембранных структур клеток, но и является стимулом для индукции
заш,итных систем организма [Nanji А.А. et al., 1995; Suzuki Y.J. et al., 1997; Сазон-
това Т.Г., 1998; Maulik N. et al., 1999; Kietzmann T. et al., 2000].
Из работ последних лет стало очевидным, что АФК играют важную роль на
начальных этапах внутриклеточной сигнализации, которая является многокомпо-
нентной системой передачи сигнала к клеточному ядру, и получила название ре-
докс-сигнализации по начальному звену, чувствительному к изменению уровня
свободнорадикального окисления [Semenza G.L., 1999; Chandel N.S., Schumacker
Р.Т., 2000; Скулачев В.П., 2001]. Одним из важных следствий инициации редокс-
сигнализации и АФК-опосредованной передачи сигнала является активация ядер-
ных факторов транскрипции, принимающих непосредственное участие в актива-
ции генов, кодирующих различные защитные системы - антиоксидантную систе-
му клеток, простагландины, а также систему белков срочного ответа, которые мо-
гут синтезироваться при гипоксии и реоксигенации, гипероксии, действии окисли-
телей [Graven К.К. et al., 1993; Omar R., Pappolla M., 1993; Nanji A.A. et al., 1995;
Nilanjana M. et al., 1999; Peng J. et al., 2000]. В настоящее время наибольшее зна-
чение придают следующим факторам транскрипции - NF-kB, АР-1, HIF (индуци-
рованный гипоксией фактор). HIF-1 играет важную роль при развитии гипоксиче-
скнх состояний, поскольку через активацию генома приводит к увеличенному
синтезу различных защитных белков.
 6
Среди белков срочного ответа, которые синтезируются при гипоксии, осо-
бое внимание исследователей привлекает гем-оксигеназа, изменение экспрессии
которой коррелирует с содержанием кислорода в тканях. Транскрипция гена гем-
оксигеназы регулируется уровнем свободнорадикального окисления [Ryter S.W.,
Tyrrell R.M., 2000] и индуцируется различными прооксидантпыми факторами
[Clark J.E. et al., 2000; Ryter S.W., Tyrrell R.M., 2000; Hanselmann C. et al., 2001].
Несмотря на то, что эти процессы имеют особое значение при гипоксических со-
стояниях, данные о роли индукции факторов транскрипции и синтеза защитных
белков, в том числе и гем-оксигеназы, при гипоксии разрозненны, а, кроме того,
эти эксперименты проведены в основном на культуре клеток [Kuroki М. et al.,
1998; Maines M.D., 2000; Motterlini R. et al., 2000].
В настоящее время накоплены многочисленные данные относительно роли
АФК-индуцированных процессов в патогенезе гипоксических состояний. С другой
стороны, помимо развития повреждений при гипоксических состояниях АФК уча-
ствуют в генерации редокс-зависимого ответа. Однако, мало изучен компонент-
ный состав редокс-сигнальной системы, последовательность включения ее звеньев
при физиологических условиях и переход физиологического сигнала в патологи-
ческий. Таким образом, актуальным является разработка новых способов эффек-
тивной коррекции гипоксических состояний организма на основе комплексного
изучения механизмов индукции защитных систем клетки и их у^шстия в регуляции
свободнорадикального окисления.
Важным аспектом этой проблемы является изучение активации компонен-
тов редокс-сигнальной системы при гипоксических состояниях с учетом гено- и
фенотипических особенностей животных. В связи с этим больщое значение пред-
ставляют исследования высоко- и низкоустойчивых организмов при острых и
адаптационных гипоксических и стрессорных воздействиях. Показано, что у высо-
коустойчивых животных при острой гипоксической нагрузке нарушения сократи-
тельной функции сердца развиваются позже и выражены слабее, чем у низкоус-
тойчивых. Вместе с тем, при длительной адаптации к гипоксии у низкоустойчивых
животных резистентность к действию повреждающих факторов увеличивается, а у
высокоустойчивых не меняется или даже уменьшается [Лукьянова Л.Д., 1997;
2004; Хачатурьян М.Л. и др., 1996; Пщенникова М.Г., 2003]. Однако, особенности
 7
активации компонентов редокс-сигнализации на острое и адаптационное гипокси-
ческое воздействие у таких животных практически не изучены,
В последние годы на основе многочисленных работ по оценке соотношения
про- и антиоксидантов в клетке при острых и адаптационных воздействиях была
сформулирована концепция о роли АФК в механизмах повышения резистентности
организма при периодическом действии различных факторов [Сазонтова Т.Г.,
1998; Arkhipenko Yu.V. et al., 1997]. К ним относятся гипобарическая и нормоба-
рическая гипоксия [Архипенко Ю.В. и др., 1992; Меерсон Ф.З. и др., 1992; Nakani-
chi К. et al., 1995; Arkhipenko Yu.V. et al., 1997], адаптация к стрессу [Сазонтова
Т.Г. и др., 1987], физической нагрузке [Сазонтова Т.Г. и др., 1996; Powers S.K. et
al., 1994], холоду [Шустанова Т.А. и др., 2004; Spasic М.В. et al., 1993]. Кроме того,
появились данные о сходстве механизмов заш;итного действия не только адапта-
ции к периодической гипоксии, но и использования гипероксии в адаптационном
режиме [Киселев CO., Лобов М.А., 2002; Леонов А.Н., 2002]. Однако, до настоя-
щего времени не проводилось сравнение молекулярных механизмов формирова-
ния защитных эффектов различных видов адаптации, связанных с периодическим
изменением концентрации кислорода как ниже, так и выще нормоксического
уровня.
На примере действия факторов различной природы показано, что формиро-
вание устойчивой адаптационной защиты требует длительного времени (3-5 не-
дель). В связи с этим существует необходимость снижения сроков достижения
стадии долговременной адаптации при сохранении ее эффективности на уровне
разных органов. Это, по-видимому, может быть решено за счет увеличения интен-
сивности адаптационного сигнала, что в соответствии с концепцией о редокс-
сигнализации должно быть связано с более интенсивной продукцией АФК. Увели-
чение интенсивности этого сигнала за счет большего снижения уровня кислорода
в периоды действия гипоксии не принесли желаемого результата из-за появления
отрицательных побочных эффектов. Так, повышение интенсивности как гипоба-
рической гипоксии (увеличение «высоты» до 5000 и 6000 м в условиях барокаме-
ры) [Arkhipenko Yu.V. et al., 1997], так и интервальной нормобарической гипокси-
ческой тренировки (увеличение длительности каждого цикла) [Sazontova T.G. et
al., 1994] приводило к снижению резистентности мембранных структур сердца и
 8
нечени. Поэтому, в настоящее время актуальной задачей является разработка но-
вых способов адаптации организма к гипоксии, повышающих интенсивность
адаптациопного сигнала без углубления гипоксической компоненты.
Цель исследования: на основе комплексного изу^1ения механизмов индук-
ции компонентов клеточной редокс-сигнализации в разных органах повысить эф-
фективность коррекции гипоксических состояний организма.
Задачи иселедоваиия:
1. Исследовать тканеснецифические особенности включения компонентов
клеточной редокс-сигнализации - фактора транскрипции HIF-la, гем-оксигеназы-
1, HSP70, ферментов антиоксидантной защиты при острых воздействиях - гипок-
сии, остром стрессе, ищемии и реперфузии.
2. Оценить уровень компонентов клеточной защиты в формировании рези-
стентности мембранных структур сердца, печени, мозга и легких к действию по-
вреждающих факторов в динамике после острой гипоксии.
3. Изучить влияние острой гипоксии и адаптации к изменению уровня ки-
слорода на устойчивость Са-насоса саркоплазматического ретикулума (СР) мио-
карда к повреждающему действию эндогенных факторов - активации свободно-
радикального окисления, автолитическому поврелодению и высокому уровню Са^"^.
4. Выявить отличия в уровне компонентов клеточной защиты и резистентно-
сти мембранных структур миокарда у крыс с генетически детерминированной раз-
личной устойчивостью к стрессорным и ишемическим повреждениям.
5. Исследовать уровень защитных белков и особенности реакции мембран-
ных структур разных органов на ишемию при временной остановке системного
кровообращения в зависимости от генетически детерминированного типа поведе-
ния.
6. Изучить модулирующее действие антигипоксантов и антиоксидантов на
процессы свободнорадикального окисления в разных органах при коррекции
стрессорных и гипоксических состояний.
7. Экспериментально обосновать и разработать новый способ профилактики
и коррекции гипоксических состояпий с помощью адаптации организма к измене-
нию уровня кислорода. Оценить эффективность защиты различных органов с по-
 9
мощью нредложенного в работе способа адаптации в сравнении с принятыми ме-
тодами адантации к гипоксии.
Научная новизна работы.
Проведено комплексное изучение активации компонентов редокс-
сигнализации и выявлены тканеснецифические особенности их индукции при
острой гипоксии, ишемии и стрессе. Впервые показано, что синтез фактора
транскрипции HIF-la, гем-оксигеназы-1, HSP70 и ферментов антиоксидантной
защиты в сердце, мозге, печени и легких имеет нелинейный характер, проходит с
различной скоростью, достигает максимума в разные временные интервалы и
может иметь несколько пиков индукции.
Острая гипоксия, гипероксия и ишемия нарушают работу Са-
транспортирующей системы СР миокарда, что выражается в снижении ее
активности и устойчивости к действию повреждающих факторов - активации
свободнорадикального окисления, повышенному содержанию свободного Са^"^,
автолизу. При адаптации к периодическому изменению уровня кислорода
значительно повышается резистентность Са-насоса СР миокарда к активации
свободнорадикального окисления, действию высокого уровня Са^^ и автолиза, что
может обеспечивать эффективную защиту от повреждающих факторов.
Впервые на уровне комнонентов редокс-сигнализации выявлены механизмы
различной устойчивости к стрессорным и ишемическим повреждениям миокарда у
крыс разных генетических линий. Обнаружен сниженный врожденный уровень и
высокая стабильность параметров антиоксидантной защиты при стрессе и ишемии
у крыс Август по сравнению с Вистар, что приводит к большей резистентности
миокарда крыс Август при этих воздействиях. При стрессорных воздействиях
эффективность функционирования Са-транснортирующей системы СР миокарда у
крыс Август выше, чем у крыс Вистар.
Впервые показаны выраженные тканеснецифические особенности измене-
ния резистентности внутриклеточных структур сердца, мозга и печени в различ-
ные сроки ностреанимационного периода после временной остановки системного
кровообращения. Выявлена зависимость формирования защитного или повреж-
дающего ответа в разных органах от генетически детерминированного типа пове-
дения животных.
 10
Проведено сравнение эффектов in vivo и in vitro веществ с антигипоксиче-
скими свойствами. Впервые показано, что кровезаменитель с полифункциональ-
ными свойствами перфторан и его компонент проксанол обладают модулирую-
щим действием на соотношение про- и антиоксидантных систем в разных органах.
Впервые обнаружены принципиальные отличия длительного и кратковре-
менного применения препарата с антиоксидантными функциями, содержащего ре-
комбинантную СОД, на активность эндогенных антиоксидантных систем клетки.
Кратковременное применение препарата предотвращает чрезмерную активацию
свободнорадикального окисления при ожоге кожи, а длительное обладает менее
выраженным протекторным эффектом на фоне относительного снижения собст-
венных антиоксидантных ферментов кожи.
Впервые показана принципиальная возможность достижения устойчивого
защитного эффекта при применении адаптационного режима, сочетающего перио-
ды гипоксии и умеренной гинероксии. Формирование адаптационной защиты про-
исходит в более короткие сроки, чем при классической интервальной нормобари-
ческой гипоксической тренировке и без побочных эффектов на чувствительные к
свободнорадикальным процессам органы.
Теоретическое значение работы: определена роль активных форм кисло-
рода в активации различных компонентов системы редокс-сигнализации при раз-
витии гипоксических состояний. Выявлены тканеспецифические особенности из-
менения про- и антиоксидантных факторов и резистентности мембранных струк-
тур клеток разных органов к свободнорадикальному окислению при адаптации ор-
ганизма к изменению уровня кислорода.
Практическое значение работы: на основе изучения закономерностей ин-
дукции защитных систем в клетках различных орга^юв экспериментально обосно-
ван и предложен рациональный способ коррекции гипоксических состояний, ос-
нованный на адаптации к периодам гипоксии и умеренной гипероксии.
Положения, выносимые на защиту.
1. Активация свободнорадикального окисления при острой гипоксии,
ишемии и стрессе приводит к изменению уровня различных компонентов
клеточной редокс-сигнализации - фактора транскрипции HIF-la, гем-оксигеназы-
1, HSP70 и ферментов антиоксидантной защиты.
 11
2. Тканеспецифические особенности индукции синтеза защитных систем -
HIF-la, гем-оксигеназы-1, HSP70 и антиоксидантных ферментов в сердце, мозге,
нечени и легких в динамике носле острой гипоксии выражаются в том, что этот
процесс является нелинейным, проходит с различной скоростью, достигает
максимума в разные временные интервалы и может иметь несколько пиков
индукции. Высокий уровень синтеза защитных белков не всегда приводит к
снижению свободнорадикального окисления в клетках разных органов.
3. Генетически детерминированная повышенная устойчивость сердца к
ишемическим и стрессорным повреждениям в значительной степени связана с бо-
лее высокой стабильностью системы антиоксидантной защиты и резистентностью
мембранных структур кардиомиоцитов к свободнорадикальпому окислению при
этих воздействиях.
4. Тканеспецифические особенности реакции мембранных структур сердца,
мозга и печени на ишемию, вызванную временной остановкой системного крово-
обращения, коррелируют с генетически детерминированным разным типом пове-
дения.
5. Защита от острых воздействий, опосредованных повышением уровня ак-
тивных форм кислорода, наиболее эффективна при кратковременном, но не дли-
тельном применение экзогенных антиоксидантов. Это позволяет максимально со-
хранить собственную эндогенную антиоксидантную защиту.
6. Новый способ адаптации, сочетающий периоды гипоксии и умеренной
гипероксии, обладает значительным защитным действием на мембранные системы
миокарда, мозга и печени, повышая их резистентность к высокому уровню актив-
ных форм кислорода. Формирование защитного эффекта происходит при более
коротком времени тренировки и без побочных эффектов на чувствительные к сво-
боднорадикальным процессам органы.
Результаты работы внедрены в курс лекций на кафедре биохимии и пато-
физиологии в Оренбургском государственном медицинском университете, на ка-
федре биохимии в Московском государственном медицинском стоматологическом
университете, на факультете фундаментальной медицины Московского государст-
венного университета им. М.В. Ломоносова, в ГУ НИИ общей реаниматологии
Российской АМН.
 12
Публикации. По теме диссертации опубликовано 34 печатные работы (17
статей и 16 тезисов) в отечественных и зарубежньк изданиях, имеется патент на
изобретение.
Аиробация работы. Основные положения работы были доложены и обсуж-
дены на Всероссийских научных конференциях «Гипоксия: мехапизмы, адаптация,
коррекция» (Москва, 2002; 2005), на IV Международном конгрессе патофизиоло-
гов (Будапешт, Венгрия, 2002), на международной конференции "Hypoxia in Medi-
cine" (Innsbruck, Austria, 2003), на конференции «Основные общепатологические и
клинические закономерности развития критических, терминальных и постреани-
мационных состояний. Принципы их коррекции» (Москва, 2003), на IX конгрессе
физиологов (Екатеренбург, 2004), на III Российском конгрессе по патофизиологии
(Москва, 2004).
Работа выполнена в лаборатории патофизиологии сердца Государственного
учреждения Научно-исследовательского института общей патологии и патофизио-
логии РАМН, в лаборатории адаптационной медицины факультета фундаменталь-
ной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, в лаборатории общей патологии терми-
нальных состояний Государственного учреждения Научно-исследовательского ин-
ститута общей реаниматологии РАМН.
 13
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Роль свободиорадикальных процессов в организме.

1.1. Активные формы кислорода.
Пристальное внимание исследователей к процессам свободнорадикального
окисления и антиоксидантной защиты тканей не ослабевает на протяжении многих
лет в связи с их огромной ролью в патогенезе, теранин н профилактике самых раз-
личных заболеваний. Особое место в этом ряду занимают исследования свободно-
радикальных процессов и антиоксидантных систем при гиноксических состояни-
ях.
Основное количество молекулярного кислорода (95-98%), потребляемое ор-
ганизмом, расходуется на выработку энергии и окислительный катаболизм суб-
стратов. Кроме четырехэлектронного восстановления молекулы Ог на компонен-
тах дыхательной цепи митохондрий в аэробных клетках всегда происходит и не-
полное - одно-трехэлектронное восстановление с образованием различных актив-
ных форм кислорода (АФК) [Владимиров Ю.А. и др., 1991]. Это - сунероксидный
анион-радикал - Ог"®, перекись водорода - Н2О2, гидроксильный радикал - 0Н°
(реакции 1):

+4е +4Н*

02 • 02'° • H2O2 • 0Н° - • 2Н2О

Основными свойствами АФК являются - высокая реакционная способность,

короткое время жизни и относительно низкая концентрация в тканях. Все это де-
лает АФК эффективным инструментом локального действия. Особенное значение
нриобретают АФК в деятельности органов, отличающихся высоким уровнем
аэробного метаболизма. К таким органам относятся сердце, мозг, легкие. Так, на-
пример, сердце при массе, составляющей всего 0,5% массы тела, поглощает около
10% всего кислорода, потребляемого организмом.
 14
Исследования, проведенные в последнее десятилетие, показали, что свобод-
ные радикалы являются ключевыми элементами регуляции многих физиологиче-
ских процессов на различных уровнях. Участие одних и тех же молекул в повреж-
дении клеток и тканей, в их защите от внешней агрессии и в процессах внутри- и
межклеточной регуляции позволяет считать, что образование АФК является ха-
рактерным физиологическим процессом, результатом эволюционного отбора [Зен-
ковН.К. идр., 2001].
В настоящее время выделяют три категории свободных радикалов - первич-
ные, вторичные и третичные [Владимиров Ю.А., 1998].
Первичные радикалы образуются в результате последовательного одно-
электронного восстановления молекулы кислорода. К ним относятся, прежде все-
го, супероксидный анион-радикал, перекись водорода, а также оксид азота.
Супероксидный анион-радикал образуется в результате присоединения
одного электрона к молекуле кислорода. Как анион 0{° имеет заряд и плохо миг-
рирует через мембраны [Владимиров Ю.А., 1998]. Обладая способностью и отда-
вать, и принимать электроны, Ог'" может выступать и как восстановитель, и как
окислитель. Среди его мищеней небольшие органические молекулы - катехолами-
ны, низкомолекулярные тиолы, аскорбат, тетрагидроптерины. В кислой среде он
способен образовывать гидропероксильный радикал - НгО", являющийся гораздо
более активным окислителем, чем супероксидный анион-радикал [Packer L., 1995;
KaganV.E.etal., 1998].

Перекись водорода. В норме 0{° под действием супероксиддисмутазы

(СОД) превращается в Н2О2, которая используется, в частности для синтеза гипо-
хлорита (СЮ") или разлагается нерадикальным путем под действием других за-
щитных ферментов - пероксидаз, наибольщей активпостью среди которых обла-
дают каталаза и глутатионпероксидаза.
Оксид азота. Оксид азота (N0) - высоколабильный, реактивный свободный
радикал, который, как показано в последнее десятилетие, способен влиять на це-
лый ряд физиологических и патологических процессов в организме животных и
человека. Биологическая роль N0 в больщой степени определяется малой величи-
ной молекулы, ее высокой реактивностью и способностью к диффузии в тканях
 15

[Moncada S. et al., 1991]. Образование NO в организме человека и животных нро-

исходит при ферментативном окислении L-аргинина и обнаружено во многих
клетках и тканях. Синтез N 0 осуществляется семейством уникальных цитохром-Р-
450-подобных гемопротеинов - NO-синтаз. Для работы NO-синтаз необходим ки-
слород, поскольку он служит источником О2'°, включающегося в гуанидиновую
группу L-аргинина. В результате этой реакции происходит 5-электронное окисле-
ние L-аргинина с образованием L-цитруллина и N 0 [МаНп J., Rodriguez-Martinez
А., 1997]. Синтез N0 с участием различных NO-синтаз является доминирующим,
но не единственным путем его генерации in vivo. Так, описаны катализируемое
ксантиноксидазой восстановление нитрита в N0° в условиях тканевого ацидоза
[Zweier J.L. et al., 1995] и при гипоксии [Zhang Z. et al., 1998], а также зарегистри-
рована реакция между аргинином и Н2О2 с образованием N0° [Nagase S. et al.,
1997].
Диапазон проявлений биологический активности N0° огромен. Было пока-
зано, что этот радикал участвует в регуляции тонуса кровеносных сосудов как эн-
догенный вазодилататор и антагонист адренергической нервной системы [Волин
М.С. и др., 1998], а также тормозит агрегацию тромбоцитов и их адгезию на стен-
ках сосудов [Струкова СМ. и др., 1999]. N0° проявляет и цитотоксическую ак-
тивность, выступая в качестве одного из основных эффекторов системы клеточно-
го иммунитета [Маеда X., Акаике Т., 1998].
Повреждающее действие N0° во многом опосредуется его способностью
реагировать с 02'° с образованием чрезвычайно реакционного пероксинитрита.
Пероксинитрит в свою очередь повреждает любые белковые молекулы, в том чис-
ле и ферменты антиоксидантной защиты. Так, обнаружено, что пероксинитрит
может повреждать митохондриальную Мп-СОД [Маек А., 1996] и глутатионпе-
роксидазу [Padmaja S. et al., 1998], что еще более увеличивает уровень О2'° и в
дальнейшем - пероксинитрита.
Вторичные свободные радикалы образуются из Н2О2, липоперекисей и ги-
похлорита в присутствии ионов Fe(II). К ним относятся - гидроксильный радикал
и липидные радикалы, участвующие в реакциях окисления ненасыщенных жирно-
 16
кислотных цепей липидов биологических мембран и липопротеинов плазмы крови
[Владимиров Ю.А., 1998].
Гидроксильный радикал. Дальнейшее одноэлектронное восстановление
перекиси водорода, происходящее в присутствии свободных ионов Fe^"^ и Си"^ (ре-
акция Фентона), приводит к образованию 0Н°, который является весьма сильным
окислителем, способным атаковать нуклеиновые кислоты, белки и фосфолипиды.

ОН-радикал может разрывать любую С-Н или С-С-связь, при этом скорость
его взаимодействия с большинством органических соединений достигает величин,
равных скорости его диффузии [Зенков Н.К., и др., 2001]. В обычных условиях об-
разование 0Н° протекает достаточно слабо и усиливается в присутствии металлов
переменной валентности.
Гидроксильный радикал атакует боковые цепи ненасыщенных жирных ки-
слот с отщеплением водорода и образованием лииидного радикала (L°) (реакции
3), который в присутствии кислорода переходит в органические радикалы кисло-
рода (L00°) - пероксильиые радикалы. Они, в свою очередь, забирают водород
от жирнокислотных цепей фосфолипидов с образованием гидроперекисей лиии-
дов (LOOH). Одновременно с этой реакцией появляются новые липидные радика-
лы, которые могут вновь вступить в реакционный цикл.

+ 0Н° + Ог +Ш
LH -Z^ 1° • L00° • L° •

LOOH -I^ L0° T:^ L°—•

-HO'

(3)
В результате свободнорадикального окисления жирнокислотных остатков
фосфолипидов образуются продукты, которые являются источниками различных
биологически активных соединений. Нолиеновые жирные ацилы до свободнора-
дикального окисления могут быть предварительно отщеплены от фосфолипидов с
помощью гидролиза их фосфолипазой типа Аг. Тогда в результате действия ли-
поксигеназы, при окислении жирных кислот образуются лейкотриены, а с помо-
щью циклооксигеназы - простагландины, тромбоксаны и простациклины. При
 17

окислении жирнокислотных ацилов без выщенления их из состава фосфолипидов

образуются диеновые коньюгаты, гидроперекиси липидов, а затем - газообразные
продукты и карбонильные соединения типа альдегидов и, наконец, шиффовы ос-
нования, то есть первичные, вторичные и конечные продукты перекисного окис-
ления липидов [Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972; Биленко МБ., 1989].

1.2. Источники активиых форм кислорода в организме.

Источниками свободных радикалов в организме являются самые различные
процессы, протекающие как вне-, так и внутри клеток.
В клетках Ог"" является промежуточным продуктом многих биохимических
реакций - таких, как окисление тиолов, флавинов, хинонов, катехоламинов, а так-
же метаболизма ксенобиотиков [Pronai L. et al, 1991; Dhalla K.S. et al., 1996; Di-
mascio P. et al., 1997; Thomas S. et al., 1998]. Однако основные источники его обра-
зования - ферментативные системы: митохондриальная цитохром-с-оксидаза,
NADPH-оксидаза фагоцитирующих клеток, ксантиноксидаза и микросомальные
монооксигеназы [Биленко М.В., 1989; Владимиров Ю.А. и др., 1991; Skulachev
V.P., 1999; 2000].
Основным источником АФК - Ог'", Н2О2 и 0Н° в клетке являются митохон-
дрии, что было впервые показано на клетках миокарда животных и человека. В
нормальных условиях при окислительпом фосфорилировании в митохондриях ме-
нее 5% молекулярного кислорода преобразуется в АФК [Sohal R.S. et al., 1990].
Основными участками дыхательной цепи митохондрий, где образуются АФК, яв-
ляются ферменты NADH-зависимая дегидрогеназа и NADH-зависимая убихинон-
редуктаза [Beyer R.E., 1992]. В физиологических условиях в митохондриях 02'° и
Н2О2 метаболизируются Мп-СОД и глутатионпероксидазой, в результате концен-
трация этих АФК поддерживается на низком уровне [Yu В.Р., 1994].
Образование АФК в митохондриях может возрастать при различных патоло-
гических состояниях, в частности при ишемии/ренерфузии органов, как показано
на сердце и почках [Леднев А.Н., Рууге Э.К., 1985; Биленко М.В., 1989; Коган А.Х.
и др., 1992], при гипоксии/реоксигенации кардиомиоцитов [Зоров Д.Б., 2003] и при
старении организма [Sohal R.S., 1993; Richter С, 1994]. Так, например, увеличение
степени восстановленности переносчиков дыхательной цепи (NAD, NADP, FAD,
 18

коэнзим-Q), a также снижение активности СОД при ишемии создают благоприят-

ные условия для образования 0{° [Леднев А.Н., Рууге Э.К., 1985; Кашкаров К.П. и
др., 1994; Лукьянова Л.Д., 1997]. Кроме того, показано, что при ишемии восста-
новленные формы переносчиков дыхательной цепи - NAD, FAD и коэнзим-Q
подвергаются автоокислению с образованием АФК, инициируюш,их свободнора-
дикальное окисление [Fridovich J., 1979].
Немаловажную роль в образовании АФК играет изменение мембранного по-
тенциала митохондрий. Так, показано, что ингибирование окислительного фосфо-
рилирования в митохондриях приводит к повышению мембранного потенциала и
усилению образования АФК [Касымов В.А., Зинченко В.П., 2003; Skulachev V.P.,
2000].
Существенное влияние на образование АФК митохондриями при ишемии
или гипоксии органов оказывают ионы кальция. Прямым следствием нарушения
кальциевого гомеостаза клетки является изменение состояния ряда Са-зависимых
митохондриальных ферментов (пируватдегидрогеназы, изоцитратдегидрогеназы,
а-кетоглутаратдегидрогеназы). В результате Са-зависимого угнетения дыхания,
снижения энергосинтезирующей функции митохондрий и увеличения отношения
NADH/NAD происходит усиление образования АФК [Лукьянова Л.Д., 1997].
Наиболее хорошо изуг1енным ферментом, продуцирующим АФК, является
фагоцитарная NADPH-оксидаза (молекулярная масса 240-250 kDa), которая оно-
средует феномен «респираторного взрыва» при активации нейтрофилов [Segal
A.W., 1995; Nauseef W.M., 1999; Kobayashi Т., Seguchi Н., 1999]. Центральной ка-
талитической субъединицей этого фермента является gp91'''^°'' (phox - phagocyte
oxidase). Этот протеин вместе с белком р22'''^°'' составляет флавоцитохром bsss, ко-
торый осуществляет перенос электронов от NADPH к кислороду. Кроме того, в
состав фагоцитарьюй NADPH-оксидазы входят три цитоплазматических белка
р47'''^'"', р67'''^°'' и Rac, выполняющие регуляторную функцию при активации этого
мембранного комплекса [Meyer J.W. et al., 1999]. В функционировании и актива-
ции фагоцитарной NADPH-оксидазы также принимают участие мембранный GTP-
связывающий белок Rap-IA и белки из семейства малых GTP-связывающих цито-
зольных белков р2Г^'^' и р2Г^'^^ [Dusi S. et al., 1995]. При стимуляции фагоцитов
происходит быстрая самосборка из мембрашштх и цитозольных компонентов
 19
NADPH-оксидазного комплекса, осуществляющего перенос электрона с цитозоль-
ного NADPH на Ог с образованием Ог'".
В настоящее время подобные NADPH-оксидазе ферменты, не связанные с
фагоцитозом, выявлены и в других клетках. Так, например, образование АФК с
участием NADPH-оксидазы обнаружено в нейроэпителиальных тельцах легкого и
клетках каротидного синуса [Marshall С. et al., 1996; Riesco-Fagundo A.M. et al.,
2001; Streller T. et al., 2002]. Мембранно-связанная ферментная система, сходная
по свойствам с NADPH-оксидазой была обнаружена и в гладкомышечных клетках
сосудов [Zulueta J.J. et al., 1995; Meyer J.W. et al., 1999]. У человека в гладкомы-
шечных клетках были обнаружены белки, последовательность которых на 25-55%
идентична последовательности субъединицы gp91'''^°'' - это белки Noxl, Nox4 и
Thoxl [Suh Y. et al., 1999; KalininaN. et al., 2002]. Анализ структуры gp9lP''°'' и его
гомологов показал, что локализация этих белков внутри клетки различается, что
может свидетельствовать о разной функции NADPH-оксидаз, состоящих из этих
пептидов. Так, например, в нейтрофилах и макрофагах phox-пептиды находятся в
цитоплазме, собираясь в активный ферментный комплекс после активации этих
клеток [Chen Q. et al., 2003], а гиперпродукция 02"°, осуществляемая посредством
gp91'''^"''-зависимой NADPH-оксидазы играет важную роль в реализации бактери-
цидного, цитотоксического и иммунорегуляторного действия нейтрофилов и мак-
рофагов [Бургасов П.Н., Румянцев С.Н., 1985; Коган А.Х., Попова Е.Н., 1996; Ве-
личковский Б.Т., 2001]. В отличие от нейтрофилов эндотелиальные клетки содер-
жат уже сформированную gp91'''^""-зависимую NADPH-оксидазу, обладающую
низкой конститутивной активностью и локализованную в перинуклеарном ком-
партменте цитоплазмы [Li J.M. et al., 2003]. Подобное расположение этого фер-
мента позволяет предполагать, что продуцируемые им АФК принимают у^шстие в
регуляции апоптоза эндотелиальпых клеток сосудов [Bhunia А.К. et al., 2002], ан-
гиогенеза [Hsich Е. et al., 2000], выхода ионов Са^^ [Ни Q. et al., 2002], нитрирова-
ния внутриклеточных белков [Fries D.M. et al., 2003] и экспрессии потенциалчув-
ствительных генов [Kalinina N. et al., 2002]. Структурный анализ белков Noxl и
Nox4 показал, что NADPH-оксидазы, содержащие эти пептиды, также находятся в
цитозоле и, следовательно, тоже принимают участие в генерации АФК внутри
клетки. Напротив, белок Thoxl локализован на плазматической мембране клеток и
 20

Thoxl-зависимая NADPH-оксидаза продуцирует Ог'" во внеклеточное пространст-

во [Kuga S. et al., 1996].
Другой специализированной на образовании АФК ферментативной систе-
мой является ксантиноксидаза, которая состоит из двух близких по структуре
молибдеп- и железо-содержащих нестабильных цитозольных ферментов: собст-
венно ксантиноксидазы и ксантиндегидрогеназы. Оба фермента локализуются в
большинстве органов, обладают широкой субстратной специфичностью и участ-
вуют во многих окислительных реакциях, в том числе в метаболизме пуринов (ги-
поксантина и ксантина) с образованием мочевой кислоты, а также в окислении
жирных кислот, глутатиона, адреналина [Биленко М.В., 1989]. Структурно ксан-
тиноксидаза состоит из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой по
145 kDa, каждая субъединица содержит 1 атом молибдена и 4 атома железа. Огра-
ниченный протеолиз фермента трипсипом приводит к образованию трех фрагмен-
тов с молекулярной массой 20, 40 и 85 kDa. Fe2S2 центры располагаются в низко-
молекулярном фрагменте 20 kDa, атом молибдена - в высокомолекулярном фраг-
менте 85 kDa, FAD - во фрагменте 40 kDa [Ашауа Y. et al., 1990].
В физиологических условиях в мозге, почках, легких, селезенке и печени
крыс [Kovij А. et al., 1992], а у человека - в клетках печени, тонкого кишечника и
стенок артерий [Moriwaki Y. et al., 1993] большая часть фермента (до 90%) нахо-
дится в дегидрогеназной форме и лишь 10% в оксидазной, но в сердце содержание
ксантиндегидрогеназы и ксантиноксидазы приблизительно равно. Окисление ги-
поксантина до мочевой кислоты с помощью ксантиндегидрогеназы происходит в
присутствии NAD (реакция 4), с помош,ью ксантиноксидазы - без NAD, но это
приводит к образованию Ог"", Н2О2 и 0Н° (реакция 5). Роль ксантиноксидазы в
образовании АФК может быть обусловлена, также способностью этого фермента
повышать уровепь свободного железа в плазме крови путем его мобилизации из
ферритипа печени [Kovij А. et al., 1992].
KcaiiTiiii-
дегидрогеназа

Ксантин + Н2О + NAD^ => мочевая кислота + NADH + Н^ (4)

Ксаитиноксидаза

Ксантин + Н2О + 202 => мочевая кислота + 202'° + 2ЬГ (5)

 21
В условиях повышенного уровня свободнорадикального окисления, в част-
ности при ишемии, ксантиндегидрогеназа может модифицироваться двумя раз-
личными способами, осуществляющимися с различной скоростью. В условиях
низкой концентрации О2 в тканях, в частности при ишемии, окисление SH-rpynn
приводит к образованию дисульфидных связей в молекуле ксантиндегидрогеназы,
что изменяет характер катализируемой ею реакции окисления гипоксантина и
ксантина: она превращается в ксантиноксидазу и начинает продуцировать Ог'", то
есть приводит к увеличению внутриклеточного уровня АФК. Иной путь модифи-
кации ксантиндегидрогеназы осуществляется при активации Са^^-кальмодулин-
зависимых протеаз и ограниченного протеолиза фермента, что также приводит к
переходу ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу [Биленко М.В., 1989; Болды-
рев А.А., 2003]. Первый путь занимает десятки секунд и реализуется при даже не-
значительном избытке АФК, Второй путь занимает минуты и осуществляется в
случае, когда нарушение мембранной структуры клеток под действием АФК при-
водит к повышению внутриклеточной концентрации кальция.
Превращение ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу также может проис-
ходить при увеличении в клетке концентрации субстратов реакции - ксантина и
гипоксантина, которое обусловлено усилением при ишемии деградации аденило-
вых нуклеотидов и накоплением в ткани продуктов их раснада - пуриновых осно-
ваний [Kuzmin А. I. et al., 2000].
К ферментам, обеспечивающим образование АФК, относятся также микро-
сомальные системы транспорта электронов, а именно ферменты Р-450-зависимой
монооксигепазной системы, которые локализованы в мембранах эндоплазмати-
ческого ретикулума печени и участвуют в детоксикации ксенобиотиков и эндо-
генных токсических продуктов. Основными белковыми компонентами данной
системы являются цитохром Р-450 и NADPH-цитохром Р-450-редуктаза [Биленко
М.В., 1989]. Цитохром Р-450 играет важную роль в окислении ненолярных, низ-
комолекулярных химических соединений, как нопадающих в организм извне (ле-
карственные вещества, яды, нищевые добавки, атмосферные загрязнения), так и
образующихся в клетке (холестерин, насыщенные и ненасыщенные жирные ки-
слоты, стероидные гормоны, простагландины и др.) [Archakov A.I., Bachmanova
G.I., 1990]. Продукты окисления этих субстратов в дальнейшем или используются
 22
В качестве регуляторов в системах метаболизма клеток, или выводятся из организ-
ма.
Важную роль в образовании АФК при гидроксилировании ксенобиотиков
системой микросомальных монооксигеназ играет цитохром Р-450, последователь-
но образующий с гидрофобным субстратом ряд фермент-субстратных комплексов.
В настоящее время выделяют два пути образования АФК с участием цитохрома Р-
450: при распаде окси- и пероксикомплексов цитохрома Р-450 и в результате авто-
окисления оксицитохрома Р-450 [Archakov A.I., Zhukov А.А., 1989; Карузина И.И.
и др., 1995].
В физиологических условиях образование АФК системой микросомальных
монооксигеназ регулируется целым рядом факторов антиоксидантной защиты, та-
ких как СОД, каталаза, глутатионпероксидаза, а-токоферол, глутатион и др. [Ни-
коноров А.А. и др., 2003]. При нарущении сбалансированности систем генериро-
вания и инактивации АФК упорядоченная структура монооксигеназного комплек-
са может быть разрушена, и ее компоненты в отсутствие нормального субстрата
могут атаковать полиненасыщенные жирные кислоты окружающих мембран. При
этом возможно образование токсичных липоперекисей, а в последующем - вто-
ричных продуктов перекисного окисления липидов (триеновые коньюгаты, карбо-
нильные соединения) [Биленко М.В., 1989]. Подобная ситуация возникает, напри-
мер, при избыточной продукции катехоламинов мозговым слоем надпочечников
при различных экстремальных воздействиях. В этом случае в результате автоокис-
ления адреналина в микросомах печени образуется новышенное количество Ог'" и
инициируется свободнорадикальное окисление нолиненасыщенных жирных ки-
слот микросомальных мембран с последующим повреждением их структуры и
функций [Деев Л.И. и др., 1983]. Так, было показано, что 6-часовой эмоциональ-
но-болевой стресс, экстремальная физическая нагрузка сопровождаются активаци-
ей перекисного окисления липидов в микросомах печени с последующим сниже-
нием, как активности, так и количества цитохрома Р-450 [Никоноров А.А., 1990;
Никоронов А.А., 2002]. Так как реакции микросомального окисления наиболее ак-
тивно протекают в печени, то предполагается, что для данного органа микросомы
 23
являются главным источником АФК, и в частности Ог"" [Bondy S.C., Naderi S.,
1994].
Помимо рассмотренных выше ферментных механизмов образования АФК, в
1слетке одноэлектронное восстановление кислорода наблюдается в реакциях с лег-
ко окисляющимися сосдинсииями (например, при окислении катехоламинов в
присутствии ионов железа, при окислении полувосстановленных флавинов, семи-
хинонов и гемового железа молекулярным кислородом). В качестве восстановите-
лей 02 могут выступать ионы металлов переменной валентности, NADPH и др.
Например, образование 02*° наблюдается при окислении арахидоновой кислоты по
цикло- и липоксигеназному путям, где в качестве кофакторов используются
NADH и NADPH [Nascimento A.L.T.O., Cilento G., 1991]. Образование АФК в
клетке показано и при окислении собственно антиоксидантов. Так, особенностью
действия природных низкомолекулярных антиоксидантов является то, что при оп-
ределенных условиях они способны проявлять прооксидантную роль. Впервые это
было отмечено для аскорбата в условиях, при которых этот типичный антиокси-
дант в присутствии ионов железа оказался способен инициировать перекисное
окисление липидов благодаря своей способности восстанавливать трехвалентное
железо в двухвалентное. При этом молекула аскорбата переходит в окисленную
форму. Реакция является обратимой, и ее направление зависит от общего окисли-
тельно-восстановительного потенциала клетки [Владимиров Ю.А., Арчаков А.И.,
1972; Podmore I. et al., 1998]. Аналогичная двойственная роль продемонстрирована
для глутатиона и липоевой кислоты. Так, глутатион при автоокислении в физиоло-
гических концентрациях способен нродуцировать АФК и вызывать повреждение
ДПК [Thomas S. et al., 1998].

1.3. Роль свободнорадикального окислсиия в клетке.

В современной литературе не существует общепринятой точки зрения отно-
сительно роли АФК в клеточном метаболизме. До недавнего времени их роль ог-
раничивали лишь той позитивной бактерицидной функцией, которую играет 02'°,
продуцируемый NADPn-оксидазой плазматической мембраны макрофагов. В дей-
ствительности биологическая роль АФК значительно шире.
 24
Помимо указанной бактерицидной функции можно выделить, еще, по край-
ней мере, две. Во-первых, образование АФК и свободнорадикальное окисление
является естественным физиологическим процессом, постоянно протекающим в
организме. Во всех клетках и тканях, независимо от их специализации, образую-
щиеся АФК, участвуют в двух разпонаправленных физиологических процессах —
катаболизме старых и синтезе новых молекул. С помощью АФК в клетке происхо-
дит окисление тех молекул белков и липидов, которые отработали свой ресурс,
что, облегчает последующее действие ферментов деградации - фосфолипаз и про-
теаз, сродство которых намного выше к окисленному субстрату [Сазонтова Т.Г.,
1989; Ungemach F.R., 1985; Zolotarjova N.et al., 1994]. С другой стороны АФК, уча-
ствуют в постоянно протекающем синтезе новых молекул. Например, с помощью
свободнорадикального окисления полиненасыщенных жирнокислотных остатков
фосфолипидов, составляющих биологические мембраны, происходит синтез таких
физиологически активных веществ липидной природы, как лейкотриены, тром-
боксаны, простагландины [Kalsner S., 1977; Hemler М.Е. et al., 1979; Roberts A.M.
et al., 1981]. Таким образом, участвуя в катаболизме и синтезе, АФК способствуют
поддержанию функционирования клетки, а также принимают участие в ее адапта-
ции клетки к новым условиям среды, изменяя состав мембранных фосфолипидов и
обновляя эндогенный белковый спектр.
В последнее время появляются данные об информационной роли АФК, об-
разующихся в клетках в ответ на различные внешние сигналы [Болдырев А.А.,
1995; Пескин А.В., 1997; Турпаев К.Т., 2002; Powis G. et al., 1995; Hancock J., Neil
S., 1999]. Метаболизм любой клетки зависит от характера информации, посту-
пающей из окружающей среды. Носителями этой информации являются различ-
ные гормоны, нейромедиаторы, лекарственные препараты, межклеточные контак-
ты и др., со специфическими рецепторами на поверхности клетки, что в свою оче-
редь вызывает активацию систем, реализующих передачу внешнего сигнала на
уровень внутриклеточного метаболизма [Кулинский В.И., 1997; Северин СЕ. и
др., 1998; Дубинина Е.Е., 2001]. Ключевыми факторами, контролирующими функ-
ционирование этих систем, являются вторичные мессенджеры. Известно, по край-
ней мере, несколько таких соединений: два циклических нуклеотида - цикличе-
ский аденозинмонофосфат (сАМР) и циклический гуанозинмонофосфат (cGMP),
 25

продукты фосфоинозитидного обмена - 1,3-фосфоинозитолтрифосфат и диа-

цилглицерол, различные протеинкиназы. Кроме того, показано, что действие ряда
физиологически активных веществ (в частности, цитокинов, факторов роста) осу-
ществляется либо через активацию процессов генерации АФК и повышение их
уровня в тканях, либо через ингибирование компонентов антиоксидантной защи-
ты.
Все это позволяет рассматривать АФК в качестве вторичных мессенджеров,
участвующих в передаче сигналов в физиологических условиях от различных
межклеточных сигнальных молекул и их мембранных рецепторов на контроли-
рующие экспрессию генов внутриклеточные регуляторные системы [Sen С.К.,
Packer L., 1996; Sun Y., Oberley L.W., 1996; Kamata H., Hirata H., 1999].
Имеются экспериментальные данные о непосредственном участии физиоло-
гических концентраций АФК в передаче сигнала от клеточной мембраны на мета-
болические процессы. В их числе - влияние на состояние Са-каналов, которое со-
провождается освобождением кальция из эндотелиальных клеток сосудов [Dreher
D., Junod A.F., 1995], саркоплазматического ретикулума миоцитов [Kawakami М.,
ОкаЬе Е., 1998; Menshikova E.V., Salama G., 2000; Morad М., Suzuki Y.J., 2000]; ак-
тивация потенциал-зависимых калиевых каналов и изменение мембранного потен-
циала [Зоров Д.Б., 2003]; регуляция активности протеинфосфатаз и МАР-киназ
[Тапака К. et al., 2001; Meng Т.С. et al., 2002; Haddad J.J., Land S.C, 2002].
Другой мишенью действия АФК в качестве вторичных мессенджеров в
клетке является фосфолипаза Аг. Хорошо известно, что окисление мембранных
фосфолипидов приводит к образованию гидроперекисей, которые могут изменять
физические свойства мембраны и инактивировать белки. Изменение мембранных
структур является важным фактором для активации фосфолипаз как Са-
зависимых, так и Са-независимых, что приводит к освобождению таких сигналь-
ных молекул как арахидоновая кислота, диацилглицерол и 1,3-
фосфоинозитолтрифосфат, опосредованно влияющих на Са-гомеостаз клетки [Ду-
бинина Е.Е., 2001; Elliott S.J. et al., 1992].
В качестве вторичных мессенджеров АФК активируют различные факторы
транскрипции, например фактор АР-1 (Activator Protein-1), представляющий собой
комплекс белков семейств Jun и Fos (гены, их кодирующие, - c-jun c-fos, относят-
 26
ся к числу протоонкогенов) и фактор транскрипции - NF-kB, участвующий в за-
щите клеток при различных патологических состояниях, в частности от окисли-
тельного стресса [Jones O.T.G., Hancock J., 2000; Michiels С. et al., 2002].
Фактор транскрипции NF-kB контролирует экспрессию многих десятков ге-
нов, действие которых направлено на повышение устойчивости клеток к стрессор-
ным воздействиям, на подавление апоптоза и регуляцию процессов клеточного
иммунитета. Активация его нроисходит под действием воспалительных цитокинов
и эндотоксинов различной природы. В неактивном состоянии фактор NF-kB пред-
существует в клетке в форме тримера, включающего субъедипицы Rel (р65), NF-
kB 1 (р50) и 1кВ. Последняя субъединица является ингибирующей и препятствует
перемещению NF-kB из цитоплазмы в ядро. Фосфорилирование 1кВ по остаткам
серина вызывает диссоциацию этой субъединицы из комплекса с NF-kB и ее по-
следующую протеолитическую деградацию [Jones O.T.G., Hancock J., 2000; Mi-
chiels С. ct al., 2002]. Удаление субъединицы IkB приводит к активации фактора
NF-kB (р65/ р50 димер) и его перемещению в ядро [Michiels С. et al., 2002]. Вме-
сте с тем показано, что фактор NF-kB по принципу обратной связи участвует в ре-
гуляции транскрипции гена, кодирующего субъединицу IkB, и способствует вос-
становлению исходного уровня собственного ингибитора.
В активном состоянии фактор транскрипции NF-kB обладает повышенной
чувствительностью к АФК, что обеспечивает его регуляцию различными антиок-
сидантами, например, тиоредоксином. Тиоредоксин - это низкомолекулярный (12
kDa) тиолсодержащий белок, который может находиться в клетке в восстановлен-
ном или окисленном состоянии в зависимости от присутствия в цитоплазме вос-
становителей (например, глутатиона) или АФК, являясь, таким образом, внутри-
клеточным сенсором свободных радикалов. Тиоредоксин снособен поддерживать
в активном состоянии многие клеточные белки [Powis G. et al., 1995], что было по-
казано, в частности, для NF-kB [Турнаев К.Т., 2002]. В редокс-зависимой регуля-
ции NF-kB участвует цитоплазматическая тиоредоксинпероксидаза, которая
окисляет тиоредоксин в реакции с Н2О2 [Nordberg J., Amer E.S., 2001]. Нри накоп-
лении в клетках окисленного тиоредоксина происходит активация NF-kB, а увели-
чение внутриклеточного уровня восстановленного тиоредоксина приводит к его
ингибированию [Michiels С. et al., 2002].
 27
Таким образом, активация NF-kB с помощью не только провосналительных
стимулов, но и в результате редокс-сигнализации, обеспечивает экспрессию раз-
личных белков, в числе которых могут быть факторы пролиферации, адгезии или
воспаления, и тем самым играет важную роль в регуляции иммунных, воспали-
тельных ответов клетки, а также в регуляции клеточной пролиферации.
Дав}ю известно, что избыточный уровень АФК и чрезмерная активация сво-
боднорадикального окисления в живой клетке могут выступать как повреждаю-
щий фактор, нарушая структуру и функционирование внутриклеточных компо-
нентов, включая ДНК, что является причиной развития самых разных патологиче-
ских состояний. Усиление свободнорадикальных процессов является одним из па-
тогенетических звеньев неврологических и психических поражепий ЦНС, воспа-
лительных процессов любого генеза, радиационных поражений, онкозаболеваний,
сердечно-сосудистой и бронхолегочной патологий, химических интоксикаций и
т.д.
Механизм генерации АФК нри всех этих заболеваниях носит общий харак-
тер. Некоторые отличительные особенности можно выявить только на начальных
стадиях. Например, пусковым фактором активации свободнорадикальных процес-
сов при воспалении является «дыхательный взрыв», который развивается в ре-
зультате чрезмерно высокой активности фагоцитирующих клеток, при гипоксии
или ишемии - нарушение электрон-транспортной функции дыхательной цепи ми-
тохондрий, при химических поражениях - активация системы микросомального
окисления. Таким образом, нричины, вызывающие чрезмерную активацию сво-
боднорадикальных процессов, могут быть разными, но изменения на молекуляр-
ном уровне носят однотипный характер и приводят к одинаковым результатам
[Дубинина Е.Е., 2001; Сергиенко В.И., Панасенко О.М., 2004].

1.4. Роль активных форм кислорода в редокс-сигиализации.

Из работ последних лет стало очевидным, что АФК играют важную роль на
начальных этапах внутриклеточной сигнализации, которая является многокомпо-
нентной системой передачи сигнала к клеточному ядру, и получила название рс-
докс-сигиализации по начальному звену, г1увствительному к изменению уровня
свободнорадикального окисления [Скулачев В.П., 2001; Semenza G.L., 1999; Chan-
 28
del N.S., Schumacker P.T., 2000]. Редокс-сигнализация в настоящее время активно
изучается в связи с участием АФК в нередаче различных сигналов в клетку, а так-
же актуальностью нроблемы оценки и тестирования тех условий, в которых фи-
зиологический внешний сигнал нреобразуется в сигнал, ведущий к развитию но-
вреждений.
Основным инициатором редокс-сигнальной цени является нереход из вос-
становленного в окисленное состояние (и наоборот) белковых сульфгидрильных
грунн, окисление которых происходит благодаря генерации АФК либо снаружи
клетки, например, нри автоокислении катехоламинов, либо внутри нее, например,
в митохондриях или нри работе системы ксантин/ксантиноксидаза и др. [Скулачев
В.П., 2001; Kovij А. et al., 1992; Beyer R.E., 1992]. В настоящее время известен ряд
медиаторов и соответствующих им рецепторов, благодаря взаимодействию кото-
рых осуществляются различные специфические реакции. Типичным нримером яв-
ляются различные гормоны, цитокины, факторы роста, катехоламины [Ткачук
В.А., 1983; 1998; 2000]. Однако для огромного количества действующих агентов,
как внешнего, так и внутреннего происхождения (действие гипоксии, высоких и
низких температур, различных окислителей и восстановителей) определенных ре-
цепторов не обнаружено. Тем не менее, клеточный ответ на эти воздействия раз-
вивается и без участия снецифических реценторов, именно благодаря редокс-
сигнализации. Кроме того, даже те медиаторы, которые имеют строго специфиче-
ские рецепторы, проявляют параллельный, неспецифический эффект через акти-
вацию АФК и редокс-сигнализацию.

Реакция клетки на внешний сигнал различается в зависимости от его интен-

сивности или от чувствительности самой клетки к действию АФК. Кроме того,
существует несколько стадий клеточного ответа, из которых начальная не связана
с индукцией генетического аппарата, а изменяет активность уже существующих
систем, то есть носит регуляторный характер. Следующая стадия клеточного отве-
та связана с редокс сигнальным нутем, с номощью которого внешний сигнал пере-
дается к ядру. В этом случае активируются гены, и начинается синтез мРНК и со-
ответствующих защитных белков [Applegate L.A. et al., 1991; Graven A.A. et al.,
1993; Baumer A.T. et al., 2000]. При таком развитии событий ответ клетки будет
физиологическим, компенсаторным.
 29
Если интенсивность свободнорадикального сигнала слишком велика, а ско-
рость компенсаторных реакций низкая, например, снижается содержание глута-
тиона и тиоредоксина, то в ядре включается программа синтеза не защитных бел-
ков, а, напротив, специальная программа гибели самой клетки - апоптоз [Проску-
ряков С.Я. и др., 2002; Carmody R.J., Cotter T.G., 2001]. В этом случае повреждение
клеточных структур развивается опосредованно, через активацию генома. При
этом гибнет только часть клеток, а другие нолучают возможность выжить в небла-
гоприятных условиях, что для организма в целом является компенсаторным меха-
низмом.
Однако уровень АФК может повыситься еще значительнее, что приведет к
быстрому разрушению клеточных структур. В данном случае оно не опосредуется
гепомом. При этом повреждаются мембранные структуры, повышается уровепь
свободного, внутриклеточного Са^"^, который прямо активирует протеазы и фос-
фолипазы - и в результате клетка гибнет. Такой процесс называется некрозом. Ин-
тересно, что при этом все предыдущие стадии также включаются, то есть активи-
руется и физиологический ответ, и апоптотический, но они не успевают реализо-
ваться, поскольку происходит более быстрый процесс - разрушение клеточных
структур в результате прямого повреждающего действия АФК [Сазонтова Т.Г.,
Архипенко Ю.В., 2004]. Так, на модели экспериментальпого сахарного диабета у
крыс было показано, что кроме активации некротической гибели секретирующих
клеток поджелудочной железы инициируются и программы клеточной выживае-
мости [Pavlovic D. et al., 2000]. При этом экспрессировались белки, поддерживаю-
щие редокс-гомеостаз клетки - Мп-СОД, гем-оксигеназа, индуцибельная NO-
синтаза и белки теплового шока - nSP70 и nSP27 [Avogaro А. et al., 2003]. Для
HSP27 показано, что этот белок при различных повреждающих воздействиях мо-
жет поддерживать окислительно-восстановительный баланс клетки за счет увели-
чения содержания внутриклеточного восстановленного глутатиона [Arrigo А.Р.,
1998]. Кроме того, белки теплового шока имеют две функции в реализации про-
граммы клеточной гибели, которые могут проявляться на разных стадиях реакции
клетки на острое повреждающее воздействие. Так, до пеобратимой фазы HSP70 и
27 (как и другие стресс-белки) играют защитную роль, а в необратимой, по-
 30
видимому, секретируются как маркеры и катализаторы некроза [Проскуряков С.Я.
и др., 2002].
АФК образуются при самых различных воздействиях на организм и клетку.
Стресс, гипоксия, гипероксия, воспаление, высокие и низкие температуры, физи-
ческая нагрузка, практически все патологические состояния сопровождаются, по-
мимо специфического ответа, повышением уровня АФК. Поэтому одним из уни-
версальных механизмов защиты организма является синтез неспецифических фак-
торов — антиоксидантов и других протекторных белков.

Рецепторы Рецепторы
(cross-talk)

Редокс- Протеинтиро- Киназные

сигнализация зинкиназа каскады

МАРК
ERK
SAPK
Резистентность
Факторы
транскрипции

Синтез
Стресс-белков

Рис. 1. Роль АФК в активации синтеза защитных белков

[Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В., 2004].

В ответ на внешний сигнал в клетке повышается стационарный уровень

АФК, одним из тех путей, которые рассмотрены ранее. Это является сигналом для
мобилизации метаболических возможностей клетки для адаптации к новым усло-
виям - происходят окислительно-восстановительные модификации сульфгидриль-
ных групп сенсорных белков, от которых затем сигнал передается по уже извест-
ным регуляторным каскадам, работающим и при активации специфических рецеп-
торов. Индуцируются киназные каскады, включая активацию МАР-киназ, таких
как extra cellular signal-regulated kinase - ERK и стресс-активируемая протеинкина-
 31
за - SAPK [Kamata Н., Hirata Н., 1999; Taylor W.R. et al., 2000; Tanaka K. et al.,
2001; Haddad J.J,, Land S.C, 2002], изменяется работа ионных каналов и т.д., что в
свою очередь нриводит к нередаче сигналов следующим внутриклеточным медиа-
торам (рис. 1).
Одним из важнейших следствий инициации редокс-сигнализации и АФК-
опосредованной передачи сигнала является активация ядерных факторов транс-
крипции, которые чаще всего находятся в неактивном состоянии в цитозоле кле-
ток до тех пор, пока в их молекуле не произойдет АФК-индуцированное отщепле-
ние ингибиторного домена [Michiels С. et al., 2002; Liu Q. et al., 2004]. После этого
ядерные факторы транскрипции оказываются способными индуцировать много-
численные гены. К настоящему времени наибольшее значение придают следую-
щим факторам транскрипции -NF-kB [Flohe L, et al., 1997], AP-1 [Maulic N. et al.,
1999], HIF (гипоксия индуцированный фактор) [Wiener СМ. et al., 1996; Semenza
G.L., 2000].
Ядерные факторы транскрипции принимают непосредственное участие в ак-
тивации генов, кодирующих защитные системы в клетке - ряд неспецифических
молекул таких, как ферменты антиоксидантной защиты, простагландины, кри-
сталлины, белки семейства HSP и другие белки срочного ответа, которые могут
синтезироваться в ответ на гипоксию, стресс, ишемию, реперфузию [Nanji А.А. et
al., 1995; Maulic N. et al., 1999; Peng J. et al., 2000]. Кроме того, синтезируются спе-
цифические молекулы с шапероновой активностью по отношению к конкретным
белкам клетки, как показано, например, для специфического шаперона Са-насоса
саркоплазматического ретикулума [Bhattacharyya D., Sen Р.С., 1998], либо белки,
специфически синтезирующиеся в ответ на действие конкретного фактора, на-
пример, в ответ на гипоксию [Graven А.А. et al., 1993; Ryter S.W., Tyrrell R.M.,
2000]. Так, при действии гипоксии па культуру астроцитов крысы показана ин-
дукция синтеза «гипоксического» белка с молекулярной массой 150 kDa [Kuwa-
bara К. et al., 1996]. Важно, что индукция синтеза этого белка не происходила при
действии на культуру астроцитов теплового шока, перекиси водорода и других со-
единений, а проявлялась только при гипоксии и последующем возврате к нормок-
сии. Кроме того, увеличение синтеза 150 kDa белка через 3 ч после гипоксическо-
го воздействия проходило на фоне повышения уровня АФК.
 32
Таким образом, в результате каскада редокс-сигнализации клетка насыщает-
ся молекулами, которые повышают ее защиту от самых разных повреждающих эк-
зогенных и эндогенных факторов, действие которых опосредованно повышением
уровня АФК и индукцией свободнорадикального окисления.
Чем выше защитный барьер клетки, тем большую защиту будут иметь кле-
точные структуры от действия повреждающих факторов. При этом наиболее дей-
ственным барьером будет являться не внещний, созданный с помощью экзогепных
добавок, подавляющих свободнорадикальное окисление, а именно эндогенный
уровень защиты, то есть сформировавшийся в самой клетке [Сазонтова Т.Г., Ар-
хипенко Ю.В., 2004; Sazontova T.G., 2002]. Так, было показано, что ингибирование
свободнорадикального окисления с помощью добавки внешних антиоксидантов не
приводит к активации защитных систем организма и не оказывает длительного
протекторного эффекта. Впервые это продемонстрировано на примере чрезмерных
добавок антиоксидантов в диеты, обогащенные субстратами перекисного окисле-
ния липидов - полиненасыщенными жирными кислотами омега-3 класса (п-3
ПНЖК). Добавление к такой диете витамина Е приводило к снижению некоторых
биологических эффектов п-3 ПНЖК, в частности их кардиопротекторного дейст-
вия [Mosconi С. et al., 1988; Ни M.L. et al., 1989].
Таким образом, синтез защитных систем, и в частности, антиоксидантов
возможен только при условии активации свободнорадикального окисления в клет-
ке, в результате которого происходит индукция факторов транскрипции. В то же
время повышение уровня антиоксидантов ведет к ингибированию факторов транс-
крипции, то есть данный процесс является дискретным. Повторной активации
синтеза защитных структур можно ожидать только при повторном же действии
прооксидантов [Sazontova T.G., 2002]. Повышающийся уровень протекторных
систем, в свою очередь, начинает тормозить синтез подобных защитных молекул и
в клетке вновь создается пусть на новом уровне, но равновесное, балансное соот-
ношение про- и антиоксидантов.
В связи с этим важно, чтобы уровень АФК в клетке не рассматривался изо-
лированно от активности антиоксидантной системы и наоборот. Это связано с тем,
что: во-первых, увеличение активности ферментов антиоксидантной защиты все-
гда происходит в ответ на рост концентрации субстратов для этих ферментов, а
 33
именно, новышение уровня свободнорадикального окисления; во-вторых, как низ-
кий уровень нро- и антиоксидантных факторов, так и высокий уровень тех и дру-
гих могут дать одинаковое абсолютное значение соотношения между ними и, в-
третьих, нри оценке состояния соотношения нро- и антиоксидантов в клетке все-
гда целесообразно оценить какой-либо функциональный нараметр, нанример ра-
боту мембранно-связанных систем, резистентность которых неносредственно за-
висит от интенсивности свободнорадикального окисления на уровне мембран и
состояния защитных систем [Sazontova T.G., 2002].

Глава 2. Современные представления о стратегии защиты клеток от неблаго-

приятных факторов.
По самым современным нредставлениям одним из основных молекулярных
механизмов новышения неснецифической резистентности организма нри нерио-
дически действующем факторе, будь то гиноксия, гинероксия, стресс, физическая
нагрузка или введение в диету нрооксидантов, является нериодически новторяю-
щаяся ограниченная генерация АФК, которая ведет к индукции защитных систем в
клетке [Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В., 2004]. Одним из важных следствий огра-
ниченного новышения уровня свободнорадикального окисления является актива-
ция различных ядерных факторов транскринции, в частности HIF. Этот ядерный
фактор транскринции является Ог-регулируемым, и увеличение или снижение его
экспрессии в клетке регистрируют ири изменяющемся уровне кислорода, в част-
ности нри гиноксических и гинероксических состояниях [Wiesener M.S. et al.,
1998; Bilton R.L., Booker G.W., 2003; Hosford G.E., Olson D.M., 2003; Forkel J. et al.,
2004]. Конечным итогом активации HIF является синтез множества защитных
белков, среди которых находятся антиоксидантные белки, гем-оксигеназа, фер-
менты гликолиза, эритроноэтин, ферритин, факторы роста и др. Недавними иссле-
дованиями также было показано, что in vivo HIF-1 регулирует экспрессию генов,
ноддерживающих циркадный ритм [Chilov D. et al., 2001] и вовлечен в механизмы
устойчивости сердца [Kawata Н. et al., 2001] и мозга [Bergeron М. et al., 1999] к
ишемическим и реперфузионным повреждениям.
 34
2.1. Роль гипоксией иидуцирусмого фактора - HIF-1
в синтезе защитных систем в клетке.
HIF-1 - фактор транскрипции, играющий важную роль в регуляции кисло-
родного гомеостаза в клетке. В настоящее время известно около 60 различных ге-
нов, активируемых с номощью HIF-1, которые кодируют белки, участвующие в
поддержании важных физиологических функций в организме, таких как ангиоге-
нез, эритропоэз, гликолиз, транспорт железа и клеточную пролиферацию [Semenza
G.L., 2002].
HIF-1 - представляет собой гетеродимерный, редокс-чувствительный белок,
состоящий из индуцибельной кислородчувствительной а-субъединицы (HIF-la,
Mr 120 kDa) и конститутивно экспрессированного фактора ARNT (Aryl Hydrocar-
bon Receptor Nuclear Translocator), известного как субъединица HIF-1 р (Mr 91-94
kDa) [Wang G.L. et al., 1995]. Обе субъединицы принадлежит к семейству основ-
ных белков, имеющих структуру «спираль-петля-спираль» (bHLH) и содержат до-
мен Per/Amt/Sim (PAS) [Crews S.T., Fan СМ., 1999; Semenza G.L., 2000]. Кроме
субъединицы HIF-la описаны и другие белки семейства bHLH - это HIF-2a и HIF-
За [Еша М. et al., 1997; Tian Н. et al., 1997; Gu Y. Z. et al., 1998].
Регуляция HIF-1 в физиологических условиях. Ноказано, что при нор-
мальном уровне кислорода содержание HIF-la в клетке минимально [Heidbreder
М. et al., 2003], за счет протеасомной деградации этой субъединицы. В нервичной
структуре HIF-la обнаружен Ог-зависимый домен деградации (ODD), которая ре-
гулируется гидроксилированием с помощью фермента пролил-4-гидроксилазы
(PHD), двух его остатков пролина (Рго-402 и Рго-564) в присутствии кислорода, 2-
оксоглутарата, витамина С и железа [Ivan М. et al., 2001; Jaakkola P. et al., 2001].
Кроме того, происходит гидрокснлирование остатка аспарагина (Asn-803) в С-
терминальном т/?ш/с-активационном домене (C-TAD), что приводит к подавлению
транскрипционной активности HIF-la. Фермент, отвечающий за эту модифика-
цию называется ингибиторным фактором HIF-la (FIH-1) и является аспарагил-
гидроксилазой [Safran М., Kaelin Jr. W.G., 2003]. После гидроксилирования остат-
ков пролина в ODD и остатка аспарагина в C-TAD происходит связывание субъе-
диницы HIF-la с белком VHL (Von Hippel-Lindau), которое делает доступной эту
 35
субъединицу для протеасомной деградации [Tanimoto К. et al., 2000; Yu F, et al.,
2001] (рис. 2).

НОРМОКСИЯ ГИПОКСИЯ

PHD FIII-l PHD FIH-l

(активные) (неактивные)

i
*, 2-оксоглутарат, витамин С

Pro-гидрокснлнро- А$п-г11дрокс11Л11ро-
ванне (Рго-402 и ваиие (Asn-803 в
Рго-564 в ODD) C-TAD)

Сукцинат
Сукцмнат Аккумуляция
СОг
HIF-la
+
димеризация с
HIF-ip

Связывание с pVHL
i
Коактиваторы транскрии-
ции СВР/рЗОО, SRC-1, TIF-2

Протеасомпая
деградация HIF-la Связываиис с ДНК
HIF-завнсимых генов

i
Биосинтез защнтиых белков
(физнологичеекий ответ на гипокеию)

Рис. 2. Регуляция активности HIF-la при нормоксии и гипоксии.

Примечание: СВР - CREB binding protein (CREB - cyclic AMP-response element); SRC-1 -
steroid receptor coactivator-1; TIF-2 - transcription intermediary factor-2.

PHD и FIH-l являются диоксигеназами, содержащими Fe (II) связанное с

двумя аминокислотными остатками гистидина и аспарагином [Wenger R.H., 2002].
В настоящее время открыто и описано три изоформы фермента PHD - PHD-1,
PHD-2 и PHD-3 [Cioffi C.L. et al., 2003]. Показано, что в различных клетках чело-
века все три изоформы PHD распределены неодинаково. Так, высокий уровень
 36
мРНК PHD-3 зарегистрирован в сердце, а низкий в печепи, скелетных мышцах и
жировой ткани. В кардиомиоцитах уровень мРНК всех трех изоформ PHD прибли-
зительно одинаков, а в эндотелиальных н гладкомышечных клетках аорты макси-
мальный уровень мРНК зарегистрирован для PHD-1 и PHD-2 и минимальный для
PHD-3 [Cioffi C.L. et al., 2003]. Кроме того, с помощью конфокальной флуорес-
центной микроскопии было показано, что PHD-1 локализована только в ядре кле-
ток, РЬШ-2 и FIH-1 находятся в цитоплазме, а PHD-3 равномерно раснределена в
цитоплазме и ядре клеток [Metzen Е. et al., 2003].
При нормальном содержании кислорода в клетке регуляция активности HIF-
1а может происходить под действием инсулина [Zelzer Е. et al., 1998], цитокинов,
в частности TNF-a и интерлейкина lp [Hellwig-Burgel Т. et al., 1999], ангиотензи-
на II [Page Е. L. et al., 2002] и NO [Brune В. Zhou J., 2003; Brune B. et al., 2003]. В
условиях гипоксии NO оказывает противоположное действие и ингибирует этот
фактор транскрипции.
Регуляция HIF-1 при гииоксии. При снижении уровня кислорода проис-
ходит ингибирование PHD и FIH-1 и подавление протеасомной деградации niF-
1а, что приводит к его стабилизации и транслокации в ядро. После этого niF-la в
ядре связывается с субъединицей HIF-ip, с кофакторами транскрипции - CREB-
связывающим белком (СВР), рЗОО, TIF2 (transcription intermediary factor-2), SRC-1
(steroid receptor coactivator-1) и с ДНК niF-зависимых генов (рис. 2) [Kallio P.J. et
al., 1998; Carrero P. et al., 2000]. Кроме того, показано, что активация HIF-1 при ги-
поксии также происходит с помощью фосфорилирования с участием МАРК или
фосфатидилинозитол-3-киназы [Richard D.E. et al., 1999; Zhong Н. et al., 2000]. Ка-
ждый этап активации HIF-1 может контролироваться концентрацией кислорода,
факторами роста, гормонами (в частности, глюкокортикоидами) и другими факто-
рами [Wenger R.H., 2002]. Такой обмен информацией с другими каскадами пере-
дачи сигналов (cross-talk - перекрестный разговор) позволяет клеткам оптимально
реагировать на гипоксическое воздействие, то есть происходит активация более
широкого спектра генов и синтеза защитных белков в ответ на гипоксию.

После активации фактор транскрипции HIF-1 способен связываться с HIF-

зависимыми генами, экспрессия которых играет важную роль в регуляции метабо-
 37
лизма, ангиогепеза, пролиферации и выживании клеток в условиях гипоксическо-
го воздействия. К ним относятся гены для фактора роста эндотелия сосудов
(VEGF), транспортеров глюкозы (GLUT1), эритроноэтина и ряда гликолитических
ферментов (табл. 1).

Таблица 1.
Роль HIF и HIF-зависимых генов в регуляции гомеостаза клетки нри гипоксии.
Процессы НШ-зависимые гены Экспрессия
Регуляция транспорта Ог:
Эритропоэз Эритроноэтин t
Ангиогенез VEGF,VEGFR-1 и 2 t
Сосудистый тонус Эндотелин-1, iNOS, НОх-1 t
Энергетический обмеи:
Лактатдегидрогеназа т
Фосфоглицераткиназа-1 t
Альдолаза А и С t
Ферменты гликолиза: Фосфофруктокиназа L и С t
Пируваткиназа М t
Енолаза А t
Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа t
Транснорт глюкозы Транснортеры глюкозы - GLUT-1 и 3 t
Синтез катехоламинов Тирозингидроксилаза t
Обмен железа Трансферрин, рецептор трансферрина t
Церулоплазмин t
Метаболнзм гема НОх-1 t
Факторы роста TGF-P, PGF, PDGF-P, ANGPT-1 и 2, HGF t
Регуляцня аноптоза Ингибиторы: Вс1-2, МсП T
Стимуляторы: В ах T
Регуляция активности HIF p35srj t
Примечание: TGF - transforming growth factor; PGF - placental growth factor; PDGF - piate-
let-derived growth factor; ANGPT - angiogenic factor angiopoietin; HGF - hepatocyte growth
factor.

Роль АФК в регуляция HIF-1. Важную роль в стабилизации HIF-la играют

концентрация кислорода и уровень АФК в клетке [Yang Z.Z. et al., 2003]. Субъе-
диница HIF-la содержит негемовое железо (два атома Fe(II) на одну молекулу
белка) и активный остаток цистеина, которые образуют железосерный кластер,
выполняющий функцию рецептора АФК [Srinivas V. et al., 1998]. При гипоксии, в
частности в митохондриях возрастает образование АФК, под действием которых
происходит окисление и диссоциация связанных с HIF-la ионов железа [Schroedl
С. et al., 2002; Hoppeler Н. et al., 2003]. Эта модификация подавляет протеолитиче-
 38

скую деградацию HIF-la и делает возможным связывание ее с субъединицей HIF-

lp и перемещение в ядро.
В отличие от активирующего действия на HIF-la, оказываемого АФК мито-
хондриалъного происхождения, АФК, генерируемые ксантиноксидазой или
NADPH-оксидазами, подавляют этот фактор. Так, например, на первичной куль-
туре интерстициальных клеток мозгового слоя почки крысы показано, что инкуба-
ция этих клеток с системой генерирующей Ог"" - ксантин/ксантиноксидазой, ин-
гибировала повышение уровня HIF-la и снижала уровень мРНК гем-оксигеназы-1
при гипоксии (10 мм рт.ст., 2 ч) [Yang Z.Z. et al., 2003]. С другой стороны, добав-
ление в среду инкубации клеток мозгового слоя почки водорастворимых антиок-
сидантных соединений, обладающих СОД-подобным действием, приводило к
нормализации уровня HIF-la и гем-оксигеназы в этих клетках.
В других экспериментах, показано, что использование ингибитора NADPH-
оксидазы, основного фермента образующего Ог'" в интерстициальных клетках
мозгового слоя почки, приводило к повышению уровня HIF-la при гипоксии, что
прямо указывало на важную роль NADPH-оксидазы в регуляции экспрессии это-
го фактора [Yang Z.Z. et al., 2003]. Предполагают, что NADPH-оксидаза в нефаго-
цитирующих клетках является сенсором кислорода и участвует в регуляции про-
теасомной деградации HIF-la при гипоксии через образование АФК [Zhu Н. et al.,
1999; 2002]. Так, 02*°, образованный в NADPH-оксидазной реакции активирует
пролил-4-гидроксилазу в цитозоле, что приводит к гидроксилированию остатков
пролина в HIF-la и его дальнейшей протеолитической деградации [Reinheckel Т.
et al., 2000; Zhu Н. et al., 2002].
На культуре эпителиальных клеток легкого человека были получены проти-
воположные данные [Goyal Р. et al., 2004]. Так, показано, что увеличение образо-
вания АФК при гипоксии (1% кислорода, 2 ч) NADPH-оксидазой приводило к
увеличению уровня HIF-la, которое сопровождалось ипдукцией экспрессии гем-
оксигеназы-1 в эпителиальных клетках легкого. Добавление каталазы ингибирова-
ло это повышение уровня HIF-la и экспрессию HIF-зависимых генов [Goyal Р. et
al., 2004]. Эти данные свидетельствуют, что NADPH-оксидаза в эпителиальных
клетках легкого участвует в регуляции экспрессии HIF-la при гипоксии через по-
 39

вышение уровня АФК. Механизм действия АФК на уровень HIF-la в эпителиаль-

ных клетках легкого также включает АФК-зависимую активацию пролил- и аспа-
рагил-гидроксилазы. Кроме того, показано, что АФК могут непосредственно регу-
лировать взаимодействие HIF-la с CREB-связывающим белком и рЗОО [Ema М. et
al., 1999].
Ткансспецифичность индукции HIF-1. Изменение активности транскрип-
ции HIF-la при физиологическом уровне кислорода и при гипоксии в клетке, не-
обходимое для поддержания нормального гомеостаза тканей зависит от типа орга-
на и клеток. Так, например высокий уровень мРНК HIF-1 при нормоксии обнару-
жен в мозге (кора, гиппокамп) и легких, причем в мозге высоко экспрессированы
субъединицы HIF-la и HIF-ip, тогда как в легком HIF-2a [Ema М. et al., 1997;
Heidbreder М. et al., 2003; Hosford G.E., Olson D.M., 2003]. Самый низкий уровень
мРНК субъединиц HIF-la, HIF-2a и HIF-3a зарегистрирован в сердце и печени.
Умеренная нормобарическая гипоксия (10% О2, 30 или 120 мин) приводила
к увеличению мРНК всех субъединиц HIF-a в коре мозга, гиппокампе, легких,
сердце и печени [Heidbreder М. et al., 2003]. Интересно, что наибольший уровень
экспрессии мРНК при такой гипоксии был зарегистрирован для субъединицы HIF-
За во всех изу^шнных органах, кроме печени. Авторы считают, что субъединица
HIF-3a является индуцибельным компонентом HIF-системы, который быстро ак-
тивируется на уровне мРНК даже при умеренной гипоксии.
Нри более тяжелых гипоксических воздействиях важную роль в защите от
повреждения играет увеличение уровня субъединиц HIF-la и HIF-2a, при этом
также показаны различия в их экспрессии, в зависимости от типа клеток. Так, на-
пример, в цитозоле печени и почек крыс максимальный уровень HIF-la зарегист-
рирован через 1 час действия системной гипоксии (острая кровопотеря), который
возвращался к базальному уровню через 4 часа после окончания гипоксического
воздействия. В то же время, в мозге максимальный уровень экспрессии HIF-la за-
регистрирован через 5 часов, а его возвращение к базальному уровню отмечено
лишь через 12 часов после окончания гипоксического воздействия [Stroka D.M. et
al. 2001]. На модели ишемического повреждения почки крысы было ноказапо уве-
личение экспрессии HIF-la в эпителиальпых клетках проксимальных и дисталь-
 40

ных канальцев почки, а HIF-2a в эндотелиальных клетках и фибробластах юк-

стагломерулярного аппарата почки. При этом показано, что повышение уровня
HIF-la сопровождалось экспрессией гем-оксигеназы-1 и CLUT1, а HIF-2a экс-
прессией эритропоэтина [Rosenberger С. et al., 2001].
Таким образом, HIF является важным фактором транскрипции, участвую-
щим в адаптации организма к сниженному уровню кислорода. В целом, изменение
уровня кислорода в клетке является сигнальным механизмом, приводящим к экс-
прессии и активации редокс-чувствительных и Ог-регулируемых факторов транс-
крипции, которые в свою очередь регулируют транскрипцию различных индуци-
бельных гипоксией генов. Эти молекулярные изменения в генетическом аппарате
клетки приводят к формированию каскадов биохимических и физиологических
ответов, позволяющих выжить оргапизму в гипоксических условиях.

2.2. Система антиоксидантной защиты клетки.

Система антиоксидантов - один из наиболее важных внутриклеточных спо-
собов поддержания физиологического уровня АФК и недопущения повреждений,
обусловленных цитотоксическим действием свободных радикалов. Каждая клетка
обладает целым комплексом белковых и небелковых соединений, обладающих ан-
тиоксидантной способностью, активация которых зависит от типа и степени по-
вреждения. Увеличение активности системы антиоксидантной защиты всегда свя-
зано с ростом концентрации субстратов для антиоксидантов, а именно, повышени-
ем уровня АФК и продуктов свободнорадикального окисления. Именно они явля-
ются сигналом к увеличению синтеза новых молекул антиоксидантов и появляют-
ся при различпых повреждающих воздействиях па организм - остром стрессе,
ишемии, гипоксических воздействиях, температурпом шоке и т.д. [Сазонтова Т.Г.,
1998].
Биохимические механизмы антиоксидантной защиты организма представ-
ляют собой сложную систему, в которой выделяют 4 главных звена:
- ферменты антиоксидантной защиты;
- низкомолекулярные антиоксиданты, синтезируемые в организме;
 РОССИЙСКАЯ
ГОСУДАРСТВЕННАЯ
41 БИБЛИОТЕКА

- естественные антиоксиданты, поступающие в организм с пищей (аскорби-

новая кислота - витамин С, а-токоферол - витамин Е, рутин - витамин Р, флава-
ноиды, Р-каротин и другие каротиноиды, предщественники группы витаминов А.
Кроме витаминов и их предщественников, к этой же категории веществ могут
быть отнесены химические элементы, входящие в состав активных центров анти-
оксидантных ферментов, например, селен);
- снецифические белки и пептиды, которые связывают иопы переходных
металлов, катализирующие реакции свободнорадикального окисления (ферритин -
в клетках, трансферрин и церулоплазмин - в плазме, карнозин - в мыщцах и др.).
Согласованная работа этих механизмов поддерживает на постоянном уров-
не, как образование, так и превращения свободных радикалов и других потенци-
ально опасных соединений [Владимиров Ю.А. и др., 1991; Владимиров Ю.А.,
1998; Величковский Б.Т., 2001].
Ферменты аитиоксидантной защиты. В процессе эволюции в клетках для
защиты от АФК выработались специализированные системы ферментов антиокси-
дантной защиты, к которым относятся СОД, катализирующая реакцию дисмута-
ции супероксидного анион-радикала в Н2О2, каталаза, разлагающая перекись во-
дорода, глутатион-зависимые нероксидазы и трансферазы, удаляющие органиче-
ские нерекиси. СОД и каталаза не нуждаются в кофакторах, что делает их работу
автономной, не зависящей от функционирования других клеточных структур. В то
же время для работы глутатион-зависимых ферментов необходим восстановлен-
ный глутатион, который синтезируется (преимущественно в печени) глутатион-
синтетазой или восстанавливается в реакции с глутатионредуктазой [Кулинский
В.И. и др., 1990]. Ферменты антиоксидантной защиты характеризуются: 1 - высо-
кой специфичностью действия, направленного против определенных форм АФК и
2 - специфичностью клеточной и органной локализации [Sies Н., 1991].
Супероксиддисмутаза - находится «у самых истоков» образования АФК и
представляет наиболее важный уровень клеточный защиты [Fridovich I., 1995]. В
организме человека и животных выделяют 3 изоформы фермента: цитозольная -
Си,7п-С0Д, митохондриальная - Мп-СОД и внеклеточная (экстрацеллюлярная)
высокомолекулярная форма - Э-СОД (Си,2п-С0Д). Каждый изозим кодируется
 42

определенным геном, расположенным у человека на хромосомах 21q21, 6q27 и 4р

соответственно [Захарова М.Н. и др., 1999].
Си,7п-СОД содержится в ядре, цитоплазматическом матриксе, пероксисо-
мах и межмембранном пространстве митохондрий [Wanders R.J.A., Denis S., 1992].
Молекулярная масса Си,7п-С0Д 31 kDa, молекула состоит из двух идентичных
субъединиц, связанных дисульфидным мостиком. Каждая субъединица содержит
один атом Си^"^ и один атом Zn^"^. Считается, что атом цинка необходим для стаби-
лизации молекулы фермента, в то время как медъ принимает непосредственное
участие в дисмутации супероксидного анион-радикала [Зенков Н.К. и др., 2001].
Мп-СОД локализована в митохондриях, имеет молекулярную массу около
40 Ша и состоит из 4 субъединиц, содержащих ион марганца в активном центре.
Характерной особенностью Мп-СОД является ее высокая резистентностъ к дейст-
вию перекиси водорода, а также индуцибельностъ. Так, например, было показано,
что в фибробластах человека под действием ионизирующей радиации в 2 раза по-
вышается скорость транскрипции мРНК Мп-СОД и в 3 раза - ее стабильность
[Akashi М. et al., 1995].
Э-СОД - является важным ферментом антиоксидантной защиты межкле-
точных жидкостей [Marklund S.L., 1984]. Молекулярная масса Э-СОД составляет
135-147 kDa. Активный центр фермента содержит по 4 атома Си^^ и Zn^"^. Харак-
терной особенностью Э-СОД является наличие гепарин-связывающего участка в
молекуле фермента, который содержит группы положительно заряженных амино-
кислот, а также наличие участка для гликозилирования [Folz R.J. et al., 1997; Zelko
I.N. et al., 2002]. Несмотря на то, что максимальная активность Э-СОД регистриру-
ется во внеклеточной жидкости, показана экспрессия этого фермента в фибробла-
стах, эндотелиальных клетках сосудов [Folz R.J. et al., 1997]. Т. Ookawara и др.
[2003] показали, что при усилении свободнорадикального окисления Э-СОД спо-
собна перемещаться в клеточное ядро, что может играть важную роль в защите ге-
нома от повреждений вызванных повышенным уровнем АФК.
Особенностью функционирования СОД является то обстоятельство, что в
присутствии избыточного количества Н2О2 она может образовывать гидроксиль-
ный радикал [Fridovich I., 1999], который атакует саму белковую молекулу СОД,
приводя к ее фрагментации и потере активности. Таким образом, для эффективной
 43
работы этот фермент, вероятно, нуждается в присутствии низкомолекулярных ан-
тиоксидантов, либо согласованной работы с пероксидазами.
Одним из главных ферментов, связанных с метаболизмом Н2О2, является ка-
талаза. Каталаза — это железосодержащий протопорфирин с молекулярной мас-
сой около 250 kDa, обладающий двойной функцией - каталазной и пероксидазной
[Sando Т. et al., 1984; Eriksson А. М. et al., 1992]. При высоких концентрациях Н2О2
в клетке нреобладает каталазная активность фермента, а при низких концентраци-
ях - пероксидазный путь расщепления перекиси водорода. Имеются данные, что
каталаза может также неспецифически стимулировать распад гидроперекисей ли-
пидов. В организме человека и животных максимальное содержание каталазы об-
наружено в эритроцитах, печени и почках, а низкий уровень фермента зарегистри-
рован в сердце и особенно в мозге. В клетках каталаза локализована преимущест-
венно в пероксисомах, и низкий уровень ее обнаруживают в цитозоле и в мито-
хондриях [Sando Т. et al., 1984; Radi R. et al., 1991; Eriksson A. M. et al., 1992]. Ка-
талаза относится к ферментам, которые наиболее длительно сохраняют свою вы-
сокую активность, и скорость ее реакции зависит лищь от скорости диффузии суб-
страта к активному центру фермента [Antunes F. et al., 2002]. В то же время во вне-
клеточных жидкостях каталаза быстро теряет свою активность в результате дейст-
вия протеолитических ферментов.

Другим ферментом, контролирующим уровень Н2О2 в клетке, является глу-

татиоипероксидаза, локализованная в цитозоле и матриксе митохондрий. Наибо-
лее высокую активность глутатионпероксидазы регистрируют в тканях нечени,
ночки и эритроцитах. Глутатионпероксидаза катализирует реакции разложения
перекисей более широкого спектра. Помимо Н2О2 она способна восстанавливать
гидроперекиси жирных кислот, а также перекиси белкового или нуклеинового
нроисхождения [Кулинский В.И., 1999]. Глутатионпероксидаза способствует раз-
ложению Н2О2 и других гидроперекисей в реакции окисления-восстановления глу-
татиона [Кулинский В.И., Колесниченко Л.С., 1990]. В регуляции этой реакции
могут участвовать также аскорбат, тиоредоксин, NADH и даже ионы йода или
хлора. Восстановление окисленного глутатиона, образующегося в глутатионпе-
роксидазной реакции, осуществляется в сопряженной системе NADPH — глутати-
онредуктаза. Восстановленный NADPH, который необходим для работы глутати-
 44
онредуктазы, происходит главиым образом из пентозофосфатного шунта [Зенков
Н.К. и др., 2001]. Сродство глутатионпероксидазы к Н2О2 выше, чем у каталазы,
поэтому она более эффективно работает при низких концентрациях перекиси во-
дорода, в то же время в защите клеток от окислительного стресса, вызванного вы-
сокими концентрациями Н2О2, ключевая роль принадлежит каталазе [Scott M.D. et
al., 1991].
Кроме глутатионнероксидазы в клетках млекопитающих выявлено целое
семейство многофункциональных белков - глутатионтрансфсраз, основная
функция которых защита клеток от ксенобиотиков и продуктов перекисного окис-
ления линидов посредством их восстановления [Кулинский В.И., Колесниченко
Л.С., 1990; Кулинский В.И., 1999]. Глутатионтрансферазы локализованы преиму-
щественно в цитозоле клеток [Колесниченко Л.С, Кулинский В.И., 1989].
Восстановленный глутатион, глутатионпероксидаза, глутатионтрансферазы,
глутатионредуктаза и NADPH образуют глутатионовую антиоксидантную систе-
му, в которой глутатионредуктаза и NADPH необходимы для восстановления
окисленного глутатиона.
В носледние годы открыто новое семейство ферментов антиоксидантной
защиты - пероксирсдоксипы, которые обнаружены в различных организмах от
бактерий до человека. Пероксиредоксины характеризуются как нероксидазы, вос-
станавливающие Н2О2 и органические гидронерекиси с помощью тиоредоксина,
глутатиона или других молекулярных доноров электронов. Молекула ферментов
пероксиредоксинов в своей структуре имеет цистеиновые остатки, благодаря ко-
торым фермент может быстро переходить из окисленного в восстановленное со-
стояние. Показано, что пероксиредоксины могут играть важную роль в антиокси-
дантной защите клеток и редокс-сигнализации, в частности влияют на связывание
различных гормонов со своим рецептором, фосфорилирование белков, экспрессию
генов и на нроцессы апоптоза [Wong С.-М. et al., 2000].
Антиоксидантная система клетки включает больщое количество низкомо-
лекулярных компонентов, активных в водной и линидных фазах. В ее состав
входят фенольные антиоксиданты, серосодержащие соединения, каротиноиды и
витамины А, С, и Е [Воскресенский О.Н. и др., 1982; Абрамова Ж.И., Оксенгенд-
 45
лер Г.И., 1985]. Все эти соединения определенным образом взаимодействуют, что
позволяет говорить о системной организации антиоксидантной системы.
Важную роль в защите клеток от окислительных повреждений играет вита-
мин Е (а-токоферол), как эндогенного, так и экзогенного происхождения. Показа-
но, что этот антиоксидант при его потреблепни с пищей в больших количествах
накапливается в мембранах клеток печени. Это позволило предположить, что пе-
чень являясь эндогенным депо витамина Е, обладает наивысшей защитой от сво-
боднорадикального окисления. Однако, многочисленными исследованиями пока-
зано, что липиды печени легко окисляются и, более того, имеют более высокую
чувствительность к АФК-индуцированному окислению по сравнению с другими
органами. Оказалось, что печень, в отличие от любого другого органа, хотя и запа-
сает витамин Е в микросомальных мембранах, но не использует его как антиокси-
дант [Diplock А.Т. et al., 1994]. При индукции свободнорадикального окисления в
разных органах наблюдают различную по длительности, но обязательно присутст-
вующую лаг-фазу, в течение которой не происходит наконления свободноради-
кальных продуктов, но максимально иснользуется весь запас витамина Е в мем-
бранах данной ткани. Аналогичная картина зарегистрирована в митохондриях пе-
чени, где витамин Е используется как антиоксидант, ингибируя свободноради-
кальное окисление. Однако в микросомах печени, содержащих основной запас ви-
тамина Е, активация окисления происходит мгновенно, без наличия лаг-фазы, то
есть на начальном этапе окисления витамин Е не используется, что подтверждает-
ся отсутствием уменьшения его концентрации при индукции свободнорадикально-
го окисления. При дальнейшем развитии свободнорадикального окисления вита-
мин Е начинает перераспределяться из депо через кровяное русло в сердце и дру-
гие органы для нредупреждения АФК-опосредованных повреждений [Antosiewicz
J. et al., 1994]. Даже в отсутствие получения экзогенного витамина Е этот процесс
может протекать интенсивно, но еще более усиливается в нрисутствии пищевого
источника этого антиоксиданта. Так, было показано, что первоначальное введение
п-3 ППЖК приводит к быстрому переходу а-токоферола из крови в сердце для
предотвращения в первую очередь возможных АФК-опосредованных поврежде-
ний мембран миокарда. При увеличении дозы поступающих с пищей п-3 ПНЖК,
способных встраиваться в мембраны сердца [Chamock J.S. et al., 1986; Marangoni
 46
F. et al., 1992], резерва витамина E в крови оказывается недостаточно и к этому
процессу подключается печень, в результате чего уровень витамина Е в печени
резко снижается, В итоге сердечная ткань активно защищается организмом от сво-
боднорадикального окисления, в то время как печень отдает свой мембранный ан-
тиоксидант и может быть подвержена более интенсивному АФК-опосредованному
повреждению, что было показано на крысах при диете с ПНЖК [Сазонтова Т.Г,,
Архипенко Ю.В., 1997]. Таким образом, печень регулирует пул витамина Е в ор-
ганизме, являясь эндогенным источником этого антиоксиданта для других органов
и тканей, где возникает риск развития свободнорадикальных повреждений. Благо-
даря начальной задержке использования витамина Е в месте его депонирования, то
есть в печени, и быстрой доставке антиоксиданта через кровь с помощью токофе-
ролтранспортирующих белков [Fechner Н. et al., 1998; Shaw Н.М., Huang C.J.,
1998] в сердце и другие органы, витамин Е проявляет свои антиоксидантные свой-
ства во всем организме.
Витамин Б, обладающий линофильными свойствами, действует главным об-
разом в составе мембран клеток и внутриклеточных органелл, а также липопро-
теинов плазмы крови, препятствуя дальнейщим свободнорадикальным реакциям,
связанным с участием липидных радикалов [Донченко Г.В., 1988; Осипов А.Н. и
др., 1990]. Например, витамин Е восстанавливает пероксильные радикалы, пре-
вращаясь при этом в менее реакционноспособный феноксильньш радикал. В таком
состоянии он может находиться в мембране до тех пор, пока не будет восстанов-
лен аскорбатом в исходное состояние. Антиоксидантное действие витамина Е
может быть обусловлено не только его непосредственным взаимодействием со
свободными радикалами, но и способностью связывать ионы лселеза, играющие
важную роль в инициации процессов свободнорадикального окисления в качестве
центров образования радикалов [Капралов А.А. и др., 1993]. Другой механизм
действия витамина Е на свободнорадикальные процессы связан с повыщением в
его присутствии уровня антиоксидантов. Так, показано, что витамин Е увеличива-
ет активность СОД, а также может стабилизировать активность глутатионперок-
сидазы и каталазы [Донченко Г.В., 1988; Le et al., 1995].
Помимо прямой и опосредованной антиоксидантной функции витамин Е
выступает как мембранный стабилизатор, что не менее важно для поддержания
 47
соотношения про- и антиоксидантных факторов в клетке. Молекула витамина Е
содержит длинную боковую изонреноидную цепь, которая позволяет ей встраи-
ваться в липидный бислой мембран. Действие витамина Е на структуру и функции
липидного бислоя может быть опосредовано, по крайней мере, тремя различными
механизмами: его непосредственным влиянием на структуру и физические свойст-
ва липидов мембраны, регуляцией свободнорадикального окисления в мембранах,
а также взаимодействием со свободными жирными кислотами и лизофосфолипи-
дами - продуктами гидролиза липидов фосфолипазами, которые способны моди-
фицировать структуру мембран [Капралов А.А. и др., 1993; Капралов А.А. и др.,
2003].
Витамин С (L-аскорбиновая кислота) - является одним из важных природ-
ных антиоксидантов, обеснечиваюших окислительно-восстановительный метабо-
лизм клетки. Витамин С обиаружен практически во всех тканях млекопитаюших,
однако больше всего его содержится в надпочечниках, гипофизе и вилочковой же-
лезе. Низкий уровень содержания аскорбиновой кислоты зарегистрирован в пече-
ни, селезенке, поджелудочной железе и головном мозге [Niki Е., 1991].
Витамин С обладает способностью инактивировать различные свободные
радикалы, например, восстанавливать Ог"" до Н2О2, которая далее может подвер-
гаться разложению пероксидазами. Наиболее важным считают способность вита-
мина С восстанавливать токоферильный радикал, и тем самым участвовать в реге-
нерации фонда важнейшего липидного антиоксиданта организма - витамина Е.
Эта реакция является ключевой в антиоксидантной зашите, поскольку она обеспе-
чивает связь между водорастворимыми и липидными антиоксидантами [Гераси-
мов A.M. и др., 1998].
Важную роль в антиоксидантной зашите организма играют легкоокисляю-
шиеся пептиды, в состав которых входит 8Н-содержаш;ая аминокислота - цисте-
ин. Особое место среди этих соединений занимает глутатиои - трипептид, обра-
зованный аминокислотами - цистеином, глутаминовой кислотой и глицином. Бла-
годаря наличию в своем составе цистеина, это вешество очень быстро переходит
из окисленного в восстановленное состояние [Кулинский В.И., Колесниченко Л.С.,
1990]. Глутатион является одним из основных растворимых антиоксидантов клет-
ки и его концентрация у большинства видов позвоночных нревышает уровень дру-
 48
гих растворимых антиоксидантов, таких как витамин С, мочевая кислота [Lopez-
Torres М. et al., 1993]. Основной антиоксидантный эффект глутатиона реализуется
носредством его участия в работе антиоксидантных ферментов, таких как глутати-
оннероксидаза и глутатионтрансферазы. Являясь субстратом для этих ферментов,
глутатион в восстановленной форме может выстунать донором атомов водорода
для Н2О2 и линидных нерекисей. Вместе с тем глутатион, как другие SH-
содержащие белки, является акцентором АФК и тем самым ингибирует свободно-
радикальное окисление в клетке [Кулинский В.И., Колесниченко Л.С, 1990].
В настоящее время к числу низкомолекулярных антиоксидантов относят и
ряд других соединений, в числе которых различные каротиноиды, мелатонин, ди-
нентид карнозин, N-ацетилцистеин, линоевая кислота. Так, например, ноказано,
что мелатонин (гормон энифиза, синтезируемый из серотонина в ночное время су-
ток) помогает in vivo защищать клеточные компоненты, включая ДНК, белки и
липиды. Этот защитный эффект проявляется не только в способности мелатонина
нейтрализовать свободные радикалы, но и в стабилизации активности ферментов
антиоксидантной защиты, в частности глутатионпероксидазы и СОД [Слепушкин
В.Д. и др., 1999; Тодоров И.Н., Тодоров Г.И., 2003]. Кроме того, до сих пор не вы-
явлено условий, при которых мелатонин мог бы выстунать как прооксидант [Reiter
R.J. et al., 1998], в связи с этим он практически нетоксичен для животных и чело-
века.
Важное условие эффективного защитного действия антиоксидантной систе-
мы заключается в синхронном взаимодействии всех компонентов, а также лабиль-
ной адантации системы в зависимости от типа повреждающего воздействия и
уровня свободных радикалов в клетке. Так, нанример, в клетках с высоким уров-
нем свобод1юрадикальных процессов скорость реакций, катализируемых глутати-
онпероксидазой, повышается при экзогенном увеличении концентрации витамина
Е [Le С. et al., 1995]. При другом виде повреждения, а именно при действии эндо-
токсина на организм, при котором увеличивается уровень АФК, происходит по-
вышение активности СОД и глутатионпероксидазы, большее в пероксисомах, чем
в цитоплазме и митохондриях [Dhaunsi G. et al., 1993]. При чрезмерной активации
свободнорадикального окисления, например, при ишемии и реперфузии, наблюда-
ется ингибирование ферментов антиоксидантной защиты (в частности, каталазы) в
 49
пероксисомах [Maulic N. et al., 1994], что может быть связано с прямым их повре-
ждением. Главным в реализации антиоксидантного ответа является также дозиро-
ванность окислительного стресса, то есть необходимость, с одной стороны, акти-
вировать защитные системы, а с другой - не сорвать адаптационный процесс и не
вызвать истощения.

2.3. Гсм-оксигеназа: функция, регуляция, биологическая роль.

Помимо активации антиоксидантной системы клетки окислительный стресс
индуцирует синтез других белков, способных взаимодействовать не только со сво-
бодными радикалами и продуктами свободнорадикального окисления. Так, важ-
ным следствием активации свободнорадикального окисления является массиро-
ванный синтез защитных белковых соединений, и, в частности, белков теплового
шока (HSP), выполняющих важные функции в клетке, главной из которых являет-
ся сохранение структуры белков при их синтезе, транспортировке и функциониро-
вании [Nover L., Scharf K.-D., 1997]. Увеличение синтеза HSP имеет триггерное
влияние на защитную систему клетки: активация синтеза этих белков важна для
подготовки клеток к длительным повреждающим воздействиям [Rokutan К. et al.,
1998].
Важная особенность защиты клетки от АФК-индуцированных повреждений
состоит в быстром включении различных протекторных компонентов. Так, на-
пример, в ответ на гипоксию происходит активация таких белков, как ферменты
гликолиза, эритропоэтин, гем-оксигеназа, онкопротеины c-fos и c-jun, белки теп-
лового шока, тирозингидроксилаза. Однако большинство из них индуцируются не
только при гипоксических состояниях, но и при стрессорных, температурпых воз-
действиях. Более того, некоторые из них являются мессенджерами внутриклеточ-
ной сигнализации. Поэтому так важно определить среди них наиболее значимые,
специфические при гипоксических воздействиях. Среди наиболее специфических
«гипоксических» белков особое внимание исследователей привлекает гем-
оксигеназа, изменение уровня которой коррелирует с содержанием кислорода во
всех тканях.
Гем-оксигеназа (НОх) была впервые обнаружена в 1968 г. в печени и оха-
рактеризована как фермент, участвующий в деградации гема с образованием би-
 50
ливердина, СО и свободного железа [Tenhunen R. et al. 1968, 1969], Показано, что
НОх обладает разными функциями, в том числе регуляторными, но первостепен-
ной является поддержание нормального уровня гема в клетке [Maines M.D., 2000].
Благодаря этому в тканях всегда присутствует определенный уровень конститу-
тивной формы - НОх-2, а при дополнительных нагрузках, связанных с повышен-
ной продукцией АФК синтезируется индуцибельная форма этого белка.
Биологическая роль молекулы гема в клетке. Гем входит в состав раз-
личных белков, играющих важную роль в биологических процессах. В настоящее
время к ним относят: 1. Гемоглобин, который обладает способностью обратимо
связывать кислород и транспортировать его в системе кровообращения. 2. Миог-
лобин, находящийся в мышечных клетках и необходимый для обмена кислорода в
них. 3. Цитохромы - соединения, функционирующие как переносчики электронов
в окислительно-восстановительных реакциях. 4. Ферменты антиоксидантной за-
щиты, такие как каталаза, пероксидазы, супероксиддисмутаза. 5. Белки, участ-
вующие в образовании N 0 из L-аргинина — NO-синтазы эндотелиальная (eNO-
синтаза), индуцибельная (iNO-синтаза) и нейрональная (nNO-синтаза). 6. Раство-
римая гуанилатциклаза, катализирующая биосинтез циклического 3', 5'-
гуанозинмонофосфата (cGMP) из гуанозинтрифосфата (GTP).
Таким образом, гем в составе различных белков участвует в биологических
окислительных процессах, выполняет другие жизненные функции клетки и спо-
собствует поддержанию гомеостаза всего организма. Однако «свободный» гем яв-
ляется прооксидантом, и его накопление вызывает изменение соотношения между
про- и антиоксидантами в клетках как за счет непосредственного участия гема в
окислительно-восстановительных реакциях, так и за счет высвобождения Fe^"^ из
«свободного» гема и новышения его содержания [Ryter S.W, Tyrrell R.M., 2000].
Поэтому для поддержания клеточного гомеостаза концентрация гема в клетке
должна жестко регулироваться.
Гем-оксигеиазиая реакция. Защитную роль от окислительного поврежде-
ния клеток «свободным» гемом играет активация ПОх. Важно, что ПОх-система
индуцируется субстратом, то есть самим гемом, представленным в виде прото-
порфирина - PPIX-Fe(III), при расщеплении которого образуются биливердин 1Ха,
вода и монооксид углерода (СО). НОх-реакции необходимо сопряженное функ-
 51

ционирование МАОРН-цитохром-с-Р450-редуктазы, которая восстанавливает же-

лезо в геме и в комплексе НОх - гем (рис. 3). В результате действия НОх происхо-
дит высвобождение металла с переменной валентностью, который является потен-
циальным индуктором свободнорадикального окисления, что в свою очередь мо-
жет регулировать активность самого фермента.

• гемолиз Гемопротеины (миог-

Эритроциты • Гемоглобин лобин, ферменты ан-
тиоксидантной защи-
ты, цитохромы, N0-
синтаза, гуанилат-
циклаза)

Гем

NADPH
Гем-оксигеназа

ЫАОРН-цитохром-с-Р450-редуктаза

"^ NADP

2+
Fe

СО

Биливердин
NADPH
Биливердин-
редуктаза
NADP

Билирубин

Рис. 3. Превращение «свободного» гема в реакции, катализируемой гем-

оксигеназной системой [по H.J. Vreman, 1998].
К моменту поступления гема из гемовых белков в гем-оксигеназную систему железо
обычно окисляется в ферри-форму (гем превращается в гемин). При участии NADPH-
цитохром-с-Р450-редуктазы железо гема восстанавливается в ферро-форму. Далее при
участии NADPH кислород присоединяется к а-метенильиому мостику между I и II пирроль-
ными кольцами гема и ферро-форма железа снова окисляется в ферри-форму. В результа-
те этой реакции образуются супероксидный анион-радикал, Н2О2 и гидроксильные ради-
калы, атакующие а-метенильный мостик гема. Дальнейшая деградация гема связана с
разрывом а-метенильного мостика и высвобождением иона железа, выделением молекулы
СО и образованием в результате раскрытия тетра пи рольного кольца эквимолярного коли-
чества биливердина 1Х-а. Последний восстанавливается в присутствии NADPH и биливер-
динредуктазы в билирубин. В этой реакции сам гем участвует в роли катализатора.
 52
Биологическая роль иродуктов НОх-рсакции. Продукты НОх-реакции
обладают важными регулирующими и защитными функциями в организме [Abra-
ham N.G. et al., 1988; Motterlini R. et al., 2000].
Билирубин, образующийся из биливердина с помощью биливердин-
редуктазы, является довольно мощным антиоксидантом. В своей работе Stocker R.
и др. [1987] показали, что in vitro билирубин в микромолярных концентрациях
(0,5-1 мкМ) эффективно препятствует развитию свободнорадикальных реакций,
связанных главным образом с участием липидных радикалов. На модели ишемии
изолированного сердца было показано, что перфузия сердца билирубином улуч-
шает состояние постишемического миокарда [Clark J.E. et al., 2000]. Кроме того,
Dore S. и др. [1999] показали, что увеличение образования билирубина после акти-
вации НОх-2, конститутивной изоформы гем-оксигеназы, защищает нервные
клетки от повреждений, вызванных Н2О2, то есть окислительным стрессом.
На другой модели окислительного стресса с использованием гладкомышеч-
ных клеток и глюкозооксидазы в качестве источника АФК, также был показан за-
щитный эффект повышенной продукции билирубина от свободнорадикальных по-
вреждений [Clark J.E. et al., 2000]. Клетки обрабатывали гемином в концентрации
100 мкМ, который активировал НОх-1 и, в конечном счете, приводил к образова-
нию билирубина в клетках. Через 4 часа после такой обработки был зарегистриро-
ван высокий уровень защиты гладкомышечных клеток от АФК-индуцированных
повреждений. Использование ингибитора НОх протопорфирина олова (SnPPIX)
позволило подтвердить, что имепно образование билирубина в НОх-реакции огра-
ничивает повреждение клеток, вызванное окислительным стрессом. Так, SnPPIX в
концентрации 40 мкМ снижал образование билирубина до контрольных значений
в гладкомышечных клетках, обработанных гемином и отменял цитопротекторный
эффект против повреждений, вызываемых глюкозооксидазой. Защитный эффект
билирубина при окислительном стрессе был подтвержден и при непосредственном
введении билирубина в культуру гладкомышечных клеток, что снижало токсиче-
ские эффекты действия высоких концентраций глюкозооксидазы [Clark J.E. et al.,
2000].
 53
Таким образом, как экзогенное введение билирубина, так и увеличение его
образования в результате активации НОх может защищать клетки от новреждений,
вызываемых окислительным стрессом.
Другой продукт НОх-реакции - СО - оценивается в настоящее время, как
важный клеточный мессенджер с различными физиологическими функциями
[Suematsu М,, Ishimura Y., 2000]. Сигнальная роль СО напоминает передачу сигна-
лов оксидом азота, только в отличие от NO, который образует нероксинитриты
при взаимодействии с Ог'", СО не образует радикалы. Показано, что СО участвует
в регуляции сосудистого тонуса и водно-солевого гомеостаза [Motterllini R. et al.,
1998; Sammutl.A., 1998].
Важнейшим следствием НОх-реакции является высвобождение железа из
гема - кофактора многочисленных клеточных ферментов и редокс-зависимых
белков [Immenshuh S., Ramadori G., 2000], и нрямого участника активации свобод-
норадикального окисления [Ryter S.W Tyrrell R.M., 2000]. Поэтому его избыточное
количество в свободном состоянии является цитотоксичным, от чего клетка за-
щищается индукцией синтеза железо-связывающих белков - трансферрина и фер-
ритина. Так, на культуре клеток фибробластов кожи было показано, что синтез
железо-связывающего белка ферритина зависит от увеличения активности НОх-1
во время клеточного ответа на окислительный стресс, и таким образом предот-
вращает цитотоксичность, вызванную избыточным уровнем железа [Vile G.F., Tyr-
rell R.M., 1993]. Обратная ситуация сниженного уровня ПОх, как было показано
например, на дефицитных по ПОх-1 мышах, одновременно приводит к перегрузке
печени железом и в то же время к железодефицитной анемии [Poss K.D., Tonegawa
S., 1997].
Таким образом, экснрессия гена ПОх-1 играет важную регуляторную роль в
физиологической регуляции гомеостаза железа, утилизации «свободного» гема и
тем самым, снижении чрезмерной активации свободнорадикальных процессов. На
примере НОх ярко проявляется дуализм регуляции гомеостаза. Так, активация
НОх-системы приводит к высвобождению АФК-индуцирующих факторов, но од-
новременно запускает ряд механизмов, ограничивающих свободнорадикальное
окисление. К наиболее важным из них относятся образование билирубина, обла-
 54
дающего антиоксидантными свойствами и индукция синтеза Ре-связывающих
белков.
Изоформы гем-оксигеназы. Молекулярные свойетва. Обнаружено и
описано три изозима НОх: индуцибельная форма - НОх-1 и две конститутивные
формы - НОх-2 и НОх-3 [Maines M.D. et al., 1986; Maines M.D., 1988; McCoubrey
W.K. et al., 1997]. HOx-1 и HOx-2 катализируют одинаковые биохимические реак-
ции, но различаются по первичной структуре, молекулярному весу (НОх-1 ~ 30-33
kDa, НОх-2 ~ 36 Ша), термостабильности, а также но механизмам их регуляции
[Maines M.D., 1988; Maines M.D., 1992]. В то же время НОх-3 является гомологом
НОх-2, однако обладает низкой активностью [McCoubrey W.K. et al., 1997].
Изозимы НОх кодируются разными генами. Так, у человека ген для НОх-1
локализован в хромосоме 22ql2, а для НОх-2 в хромосоме 16р13, что определяет
различие в белковом составе этих изозимов, а также в первичной структуре НОх-1
(289 аминокислотных остатков) и НОх-2 (315 аминокислотных остатков) [Maines
M.D., 1992]. В структуре всех изозимов НОх существует участок, имеющий срод-
ство к гему - так называемый гидрофобный каталитический карман, который рас-
положен в центральной части оксигеназ и состоит из 24 аминокислот. Он ответст-
венен только за деградацию гема. Нри этом в каталитическом центре НОх наибо-
лее важную роль играет остаток гистидина (гистидин 132 в НОх-1, 151 в НОх-2 и
128 в НОх-3) [Maines M.D., 2000]. Показано, что этот остаток гистидина необхо-
дим для ферментативной активности НОх-2, хотя функция соответствующего гис-
тидина в НОх-1 спорна [McCoubrey W.K., Maines M.D., 1993; Matera К.М. et al.,
1997].
НОх-1 и НОх-2 (НОх-3) используют одинаковый субстрат и катализируют
одну и туже реакцию. В связи с этим возникает вопрос - почему в процессе эво-
люции появились разные изоформы этого фермента. На основе того, что известно
о регуляции активности НОх-1 и НОх-2, их распределении в клетках и времени
ответа на стимул, можно предположить, что конститутивная форма НОх-2 отвеча-
ет за клеточный гомеостаз при физиологических условиях (так как не обладает
способностью к быстрой индукции в ответ на стимул), а НОх-1 (способная быстро
индуцироваться) - при патологических изменениях уровня кислорода, АФК или
нри действии избыточного количества «свободного» гема. Другое объяснение су-
 55
ществования разных изоформ НОх может быть получено при анализе различий в
первичной структуре этих белков.
Изучение первичной структуры НОх показало, что НОх-2 и НОх-3, в отли-
чие от НОх-1, помимо каталитического кармана имеют дополнительный специфи-
ческий участок, который является цистеин-пролиновым дипептидом, окруженным
сверху заряженными аминокислотами, а снизу гидрофобными остатками [McCou-
brey W.K. et al., 1991 П; 1997b]. Этот участок обнаружен у небольшой группы бел-
ков и известен как «гем регуляторный участок» (HRM). НОх-2 и НОх-3 имеют по
две копии HRM. Исследования с использованием метода направленного мутагене-
за показали, что мутации в HRM не существенны для изменения активности НОх-
2 в отношении деградации гема в отличие от мутации гистидина 151, которая
инактивирует фермент [McCoubrey W.K. et al., 1997a]. Два HRM HOx-2 участвуют
в связывании гема с высоким сродством, но не вовлечены в реакцию деградации
гема. Исследования с использованием доноров N 0 [Ding Y. et al., 1999] показали,
что HRM НОх-2 взаимодействует с оксидом азота. Это привело к предположению,
что НОх-2 может функционировать помимо прочего и как внутриклеточная «ло-
вушка» для N0. Эта функция выявлена и у НОх-3 и фактически она может быть
основной функцией НОх-3 в клетке, так как этот белок, обладая более низкой ка-
талитической активностью, только в крайних случаях участвует в деградации гема
[McCoubrey W.K. et al., 1997b]. Нредложенный механизм взаимодействия НОх-2
(и НОх-3) с N 0 аналогичен механизму взаимодействия гемоглобина с N0, кото-
рый также является «ловушкой» для оксида азота. Связывая и инактивируя N0,
НОх-2 и НОх-3 могут служить буфером и принимать участие в регуляции биоло-
гических функций N0 в клетке, а присутствие конститутивной НОх-2 во всех ти-
пах клеток подтверждает эту гипотезу [Но К.М. et al., 1999].
Кроме HRM в структуре НОх-2 была обнаружена кислород-чувствительная
последовательность - 5'TTTTGCA3' [Lee-Huang S. et al., 1993]. Наличие кислород
чувствительного элемента и HRM в НОх-2 дают возможность предположить, что
конститутивная форма этого фермента может функционировать как
гем/кислородный сенсор и участвовать в регуляции экспрессии генов, которые ин-
дуцируются АФК, гемом или Fe, например генов ферритина, iNO-синтазы и НОх-1
[MainesM.D., 1997].
 56
При окислительном стрессе происходит увеличение уровня «свободного»
гема, который может связываться с HRM в НОх-2 с образованием АФК. Увели-
чение уровня АФК, в свою очередь, приводит к активации транскринции генов для
НОх-1 и iNO-синтазы, через факторы транскрипции NF-kB и АР-1. Гены и, НОх-1,
и iNO-синтазы имеют участки для связывания с NF-kB и АР-1 в промоторной об-
ласти [Tacchini L. et al., 1995; Menegazzi М. et al., 1996]. Гипотезу о том, что НОх-
2 может функционировать, как сенсор кислорода подтверждают данные о высоком
ее уровне в норме в эндотелии кровеносных сосудов и каротидных тельцах [Ewing
J.F. et al., 1994; Zachary R. et al., 1996].
Регуляция транскрипции геиа гем-оксигеиазы. Транскрипция гена НОх-1
регулируется интенсивностью свободнорадикального окисления [Ryter S.W., Tyr-
rell R.M., 2000] и индуцируется прооксидантными факторами (например, ультра-
фиолетовым излучением, металлопорфиринами, гемином и воспалением) [Clark
J.E. et al., 2000; Ryter S.W., Tyrrell R.M., 2000; Hanselmann C. et al., 2001]. Это при-
вело к появлению гипотезы о том, что НОх -1 обеспечивает защиту клеток во вре-
мя окислительного стресса. Кроме того, АФК-опосредовапная индукция гена НОх-
1 может увеличиваться и при спижении уровня антиоксидантов в клетке, например
восстановленного глутатиона. Было показано, что снижение уровня эндогенного
восстановленного глутатиона при окислепии сульфгидрильных групп в этом три-
пептиде коррелирует с ипдукцией НОх-1 и белков теплового шока [Calabrese V. et
al., 1998].
В работе Gonzales S. с соавт. [2002] было показано, что индукция НОх -1
защищает клетки мозга от окислительного стресса. Так, через 1 и 3 часа после
инъекции гемипа животным в мозге было зарегистрировано увеличение концен-
трации Н2О2 и снижение уровня восстановленного глутатиона. В свою очередь
через 6 часов после активации НОх-1 гемином было обнаружено увеличение
уровня Fe-связывающего белка - ферритина и антиоксиданта - билирубина, что в
результате приводило к снижению уровня свободнорадикального окисления в моз-
ге. На модели ишемического (45 мин ишемии) и ренерфузионного (2 часа репер-
фузии) повреждения печени Ito К. с соавт. [2002] показали, что увеличение экс-
прессии НОх-1 также защищает клетки печени от окислительного стресса. За три
дня до моделирования ищемии и реперфузии крысам проводили удаление селе-
 57
зенки, которое увеличивало уровень НОх-1 в печени. Повышенный уровень НОх-
1 защищал печень этих животных от ишемических/реперфузионных повреждений,
что проявлялось в снижении ишемической зоны и уровня маркеров клеточного
повреждения в сыворотке крови - аланин-трансаминазы и аспартат-трансаминазы.
Введение ингибитора НОх-1 протопорфирина цинка (ZnPPIX) отменяло этот за-
щитный эффект. Эти данные свидетельствуют, что экспрессия гена НОх-1 играет
важную роль в защите клеток и чрезвычайно чувствительна к изменению соотно-
шения про- и антиоксидантных факторов в клетке.
Снособность гена НОх-1 к индукции с помощью различных факторов объ-
ясняется конфигурацией его гена. В промоторной области гена НОх-1 обнаружена
последовательность нескольких регуляторных элементов. Она включает АР-1, АР-
2 и NF-kB связывающие участки [Lavrovsky Y. et al., 1994], два металл-
регулируемых элемента [Alam J. et al., 1994], участки, регулируемые тепловым
шоком и гемом [Muller R.M. et al., 1987]. Нромоторная область гена НОх-1 также
содержит антиоксидантный регуляторный элемент с последовательностью амино-
кислот, сходной с последовательностью антиоксидантных ферментов [Choi A.M.,
Alam J., 1996]. A для ответа на гипоксию имеется фрагмент из 163 пар оснований,
содержащий два HIF-1-связывающих участка, которые вызывают транскрипцию
гена НОх-1 [Bunn H.F., Poyton R.O., 1996; Lee P.J. et al., 1997]. Были обнаружены и
другие регуляторные элементы в гене НОх-1, функция которых еще до конца не
выяснена.
Промоторная область гена для НОх-2 содержит регуляторный элемент толь-
ко для стероидных гормонов, в частности для глюкокортикоидов [Maines M.D.,
1997].
Данные о том, что экспрессия гена НОх-1 вызывается агентами, увеличи-
вающими образование АФК, а скэвенджер АФК, типа N-ацетилцистеина, ингиби-
рует индукцию НОх-1 при окислительном стрессе [Lautier D. et al., 1992], указы-
вают на то, что увеличение АФК внутри клетки играет важную роль в регуляции
экспрессии гена НОх-1 [Immenschuh S., Ramadori G., 2000]. Предполагается, что
изменение соотношения про- и антиоксидантных факторов в клетке приводит к
изменению активности определенных регулирующих протеинкиназ и протеин-
фосфатаз, которые участвуют в регуляции экспрессии гена [Finkel Т., 1998]. В на-
 58
стоящее время известно, что АФК могут непосредственно модулировать редокс-
состояние цистеиновых остатков ядерных факторов транскрипции, что играет
важную роль в процессах их связывании с ДНК [Flohe L. et al., 1997]. После этого
ядерные факторы транскрипции оказываются способными индуцировать много-
численные гены, в том числе и ген НОх-1. Хотя редокс передача сигнала, по-
видимому, играет главную роль в регуляции НОх-1, различные пути внутрикле-
точной сигнализации также вовлечены в регуляцию гена НОх-1. К ним относятся
митоген-активированные протеинкиназы [Elbirt К.К. et al., 1998; Oguro Т. et al.,
1998], протеинкиназа С [Alam J., Den Z., 1992; Muraosa Y., Shibahara S., 1993; Alam
J. et al., 1995; Terry CM. et al., 1999], сАМР-зависимая протеинкиназа A [Durante
W. et al., 1997; Immenschuh S. et al., 1998; Kiemer A.K. et al., 2003], cGMP-
зависимая протеинкиназа G [Immenschuh S. et al., 1998; Polte T. et al., 2000] и про-
теинфосфатазы [Koizumi Т. et al., 1995; Negishi M. et al., 1995; Immenschuh S. et al.,
2000].
Распределение разных изоформ гем-оксигепазы в тканях. Все ткани
млекопитающих содержат различные уровни активности НОх.
Так, например, Scapagnini G. с соавт. [2002] показали, что в мозге присутст-
вуют три изоформы НОх, которые распределены неравномерно: Н0х-2>Н0х-
1>Н0х-3. Высокий уровень НОх-1 и НОх-2 обнаружен в мозжечке и гиппокампе.
НОх-3 была обнаружена в гиппокампе, мозжечке и коре мозга. В печени обнару-
жены две изоформы НОх - НОх-1 и НОх-2 [Bauer М., Bauer I., 2002]. НОх-2 в
норме преобладает в эндотелиальных и гладкомышечных клетках сосудов, каро-
тидных тельцах [Ewing J.F. et al., 1994; Zachary R. et al., 1996]. Предполагается, что
внутриклеточный «свободный» гем должен подвергаться разложению НОх непо-
средственно в той ткани, в которой и образовался. Это предпочтительней, чем экс-
портирование в сыворотку и последующее разложение в печени [Ryter S.W., Tyr-
rell R.M., 2000]. Высокий уровень НОх активности обнаружен в печени, ночках,
селезенке, семенниках, а также в мозге и легких [Maines M.D., 1988; Dennery Р.А.
et al., 1993; Rodgers Р.А. et al., 1995].
Было показано, что в разных тканях активность НОх сопряжена с работой
других ферментов. Например, в почках повышение активности НОх-1 индуцирует
синтез эритропоэтина, а в гладкомышечных клетках NO-синтазы индуцируют
 59
НОх-1 [Motterlini R.et al., 2000]. Недавно было ноказано, что активность НОх-1 в
головном мозге крыс сонряжена с работой важного антиоксидантного фермента -
Мп-СОД [Colombrita С. et al., 2003]. При этом гены для НОх-1 и Мп-СОД имеют
разный уровень экспрессии в мозге крыс - Мп-СОД > НОх-1. Высокий уровень
НОх-1 и Мп-СОД обнаружен в гиппокампе, мозжечке и коре головного мозга. Ис-
следования с помощью конфокальной микроскопии показали, что в сердце НОх-1
помимо цитозоля локализована и в саркоплазматическом ретикулуме, что свиде-
тельствует о важной роли НОх-1 в регуляции Са -гомеостаза в миокарде [Соте-
lussen R.N.M., Kjiowlton А.А., 2002].
Индукция гем-оксигеназы-1 при различных натологических состояни-
ях. Данные о роли гем-оксигеназной системы при гипоксических состояниях раз-
рознены и зачастую противоречивы. Это может быть связано со значительными
методическими трудностями изучения данной проблемы на уровне целого орга-
низма, в связи, с чем взаимозависимость НОх-системы и процессов свободноради-
кального окисления изучалась в основном на культуре клеток.
Гипоксия. Motterlini R. с соавт. [2000] на культуре эндотелиальных клеток
аорты быка показали, что тяжелая гипоксия (РОг < 2 мм рт.ст.) вызывает увеличе-
ние активности и экспрессии НОх-1 через 12 ч действия гипоксии и это увеличе-
ние достигает максимума через 24 ч. В этих же клетках показано изменение уров-
ня индуцибельной и конститутивной NO-синтазы. Зарегистрировано увеличение
экспрессии и активности iNO-синтазы через 6 и 12 ч гипоксии, которое начало
уменьшаться через 18 и 24 ч. Важно подчеркнуть, что уже через 6 ч гипоксии экс-
прессия iNO-синтазы была максимальна, тогда как никаких изменений в активно-
сти и экспрессии НОх-1 в этот период времени не было обнаружено (рис. 4). Кро-
ме того, белок конститутивной NO-синтазы, который в эндотелиальных клетках
высоко экспрессирован при нормоксии, в условиях гипоксии снижался время-
зависимо. Эти данные показывают, что индукция iNO-синтазы при гипоксии про-
исходит очень быстро и предшествует как увеличению экспрессии белка НОх-1 и
его уровня, так активности НОх, хотя держится непродолжительное время, в от-
личие от экспрессии НОх-1.
Нндукция iNO-синтазы сопровождалась окислением глутатиона и образова-
нием S-нитрозотиолов. Важно, что индукция iNO-синтазы и НОх-1 взаимозави-
 60
сима, поскольку инкубация эндотелиальных клеток аорты быка со специфическим
ингибитором iNO-синтазы или скэвенджером NO значительно препятствовала
увеличению активности НОх-1, вызванной гипоксией.

170 1
DiNO-синтаза
160 - • НОх-1

150 -

140 -

130 -

120 •

110 •

100
6ч 12ч 18ч 24 ч
Гипоксия (2 мм рт.ст.)

Рис. 4. Влияние гипоксии на экспрессию iNO-синтазы и НОх-1 в эндотелиальных

клетках аорты быка [по данным Motterlini R. et al., 2000].

Экзогенное введение антиоксидантных ферментов (СОД, каталазы) не предот-

вращало увеличение активности НОх, что свидетельствует о других ее защитных
функциях кроме антиоксидантной, однако предшественник синтеза глутатиона и
донор тиоловых групп, N-ацетилцистеин, полностью отменял индукцию НОх-1.
Имеются данные о том, что восстановленная форма глутатиона является не
только важным внутриклеточным антиоксидантом, функция которого связана с
поддержанием соотношения про- и антиоксидантных факторов в клетке, но и яв-
ляется модулятором экспрессии гена НОх-1 при гипоксии in vitro и in vivo. Так,
показано, что снижение уровня восстановленного глутатиона и окисление сульф-
гидрильных групп коррелирует с индукцией НОх-1 и других белков срочного от-
вета, в частности HSP70 [Ohlmann А. et al., 2003]. Кроме того, восстановленный
глутатион и тиоловые группы способны связывать NO, приводя к образованию и
накоплению S-нитрозоглутатиона и S-нитрозотиолов, обладающих важными фи-
зиологическими функциями в клетке (регуляция уровня N0, модуляция активно-
сти ферментов, посттрансляционная модификация белков).
 61
Однако, в работе Motterlini R. с соавт, [2000] обнаружено, что вызванное ги-
поксией увеличение активности НОх-1 в эндотелии происходило в присутствии S-
нитрозоглутатиона и при повышенном уровне окисленного глутатиона. Это позво-
ляет предположить, что окисление внутриклеточного глутатиона и образование
S-нитрозотиолов также вносит вклад в механизм регуляции экспрессии НОх-1 при
гипоксии.
Minamino Т. с соавт. [2001] на трансгенных мышах, обладающих повышен-
ным уровнем экспрессии НОх-1, показали, что исходно повышепный уровень экс-
прессии и активности НОх-1 в легких при хронической гипоксии предотвращает
воспаление обоих легких, гипертрофию стенок сосудов и гипертонию. Авторы
предполагают, что НОх-1 обладает противовоспалительными свойствами, так как
повышенная экспрессия НОх-1 значительно снижала индукцию воспалительных
цитокинов в легких при гипоксии. В экспериментах на трансгенных и нетранс-
генных мышах было показано, что периодическая длительная гипоксия (пормоба-
рическая гипоксия, 8-10% О2, 5-7 недель) вызывает в легких нетрансгенных мы-
шей значительную экспрессию воспалительных цитокинов - интерлейкинов (IL-
1в, IL-6), хемоаттрактантного белка моноцитов (МРС-1), воспалительного белка
макрофагов (MIP-2). Важно, что индукция IL-lb, IL-6, МРС-1 и MIP-2 была значи-
тельно подавлена после гипоксии в легких трансгенных мышей [Minamino Т. et al.,
2001].
В процессе воспаления легких цитокины вызывают активацию лейкоцитов,
которые нарабатывают различные прооксиданты и протеолитические ферменты,
на начальных стадиях воспалительного процесса обладающие защитным эффек-
том, но в больших количествах приводящие к сужению сосудов и повреждению
легкого. Кроме того, воспалительные цитокины непосредственно вызывают изме-
нения в просвете сосудов и участвуют в тромбогенезе [Schecter A.D. et al., 1997;
АИ М.Н. et al., 1999]. НОх-1 может подавлять эти процессы и защищать эндотелий
и гладкомышечные клетки сосудов от окислительного стресса [Platt J.L., Nath
К.А., 1998], прежде всего через ингибирование адгезии лейкоцитов, вызванную
прооксидантпыми стимулами.
Механизм защиты, обеспечиваемый НОх-1, может зависеть от продуктов ее
реакции: СО, который функционирует как вазодилататор, и билирубина, обла-
 62
дающего антиоксидантными свойствами. В последнее время стало известно, что
СО и билирубин могут проявлять защитный эффект при развитии воспалительно-
го процесса. Так, было показано, что in vivo и in vitro СО при низких концентраци-
ях дифференцировано и избирательно ингибирует экснрессию воспалительных
цитокинов, таких как TNFa, IL-ip, MIP-2 и увеличивает экснрессию IL-10, обла-
дающего способностью ингибировать воспаление [Otterbein L.E. et al., 2000; Moore
B.A. et al., 2003]. Кроме того, показано, что биливердин и билирубин также опо-
средованно ингибируют воспалительный ответ. Так, билирубин ингибирует экс-
прессию IL-2, киллерную активность лимфоцитов и клеточную цитотоксичность
[Nakagami Т. et al., 1993].
Ишемия/реперфузия. Maines M.D. с соавт. [2001] при исследовании уровня
транскрипции НОх-1 и НОх-2 при 30 мин ишемии и 24 ч реперфузии почки, пока-
зали увеличение уровня НОх-1 в ночке в 2,5 раза и снижение уровня НОх-2 через
4 ч после воздействия. Через 24 ч после воздействия сниженный уровень НОх-2
сохранялся. В сердце нри ишемии почки также существенно увеличивался уровень
мРНК НОх-1 и снижался уровень НОх-2. Предварительное введение а-фенил-N-t-
бутилнитрона (PBN) крысам за 30 мин до ишемии/реперфузии увеличивало уро-
вень мРНК НОх-1 и защищало от уменьшения уровня мРНК НОх-2 как в почке,
так и в сердце животных. Возможно, что это эффект связан со способностью PBN
действовать в качестве «ловушки» свободных радикалов - гидроксильного ради-
кала, супероксидного анион-радикала и тем самым препятствовать прямому взаи-
модействию АФК с клеточными комнонентами, в том числе отвечаюшими за
транскрипцию гена.
Выраженный защитный эффект индукции НОх-1 был показан и на модели
ишемического и реперфузионного повреждения миокарда [Masini Е. et al., 2003].
Предварительное введение крысам индуктора НОх-1 гемина (за 18 ч перед ишеми-
ей/реперфузией) значительно уменьшало размер зоны инфаркта, возникновение
реперфузионных аритмий, накопление ТБК-активных нродуктов свободноради-
кального окисления и новышение концентрации Са в миокарде, вызванных 30
мин ишемией и 60 мин реперфузией. Эти положительные эффекты были нредот-
вращены ингибитором НОх-1 протопорфирином Zn, который вводили крысам за
24 ч до ишемии/реперфузии и за 6 ч перед введением гемина.
 63
Lakkisto P. с соавт. [2002] на модели инфаркта миокарда также ноказали, что
индукция НОх-1 может играть важную роль в защите кардиомиоцитов от повреж-
дений. Оказалось, что через день после моделирования инфаркта миокарда уро-
вень мРНК НОх-1 был увеличен в 3,9 раза в пограничной (периинфарктной) с ин-
фарктной зоной области по сравнению с ложнооперированными животными. Че-
рез неделю после моделирования инфаркта миокарда уровень НОх-1 оставался
увеличенным в периинфарктной области в 5 раз. Кроме того, авторы зарегистри-
ровали увеличение уровня НОх-1 (4,6 раза) в отдаленных от инфарктной зоны об-
ластях сердца. Через 4 недели после инфаркта миокарда зарегистрировано воз-
вращение уровня НОх-1 к контрольным значениям. Эти результаты показывают,
что индукция НОх-1 играет важную роль в сердце на начальных стадиях инфаркта
миокарда [Lakkisto Р. et al., 2002]. Ноказано, что повышенный уровень экспрессии
НОх-1 вносит вклад в нормализацию сердечной деятельности, в уменьшение зоны
инфаркта миокарда и снижение воспалительного и окислительного повреждений
ткани сердца [Chen Y.H. et al., 2003].
Гипсроксия. В последнее десятилетие появились данные о механизмах ин-
дукции НОх-1 не только при действии гипоксии, но и при увеличенном уровне ки-
слорода, например, в случае гипербарической оксигенации [Lee P.J. et al., 1996;
Rothfuss A. et al., 2001; Tahep LD. et al., 2001]. Lee P.J. с соавт. [1996] на трансфе-
цированных эпителиальных клетках легкого человека, обладающих повышенным
уровнем экспрессии НОх-1, показали, что индукция НОх-1 при гинероксии (95%
Ог и 5% СОг) защищает клетки от окислительного стресса. В работе были исполь-
зованы две линии эпителиальных клеток легкого - А549-А4 (обладают повышен-
ным уровнем экспрессии НОх-1) и А549-пео (клетки с нормальным уровнем НОх-
1). Действие гипероксии на клетки А549-пео приводило к морфологическим из-
менениям, которые проявлялись в вакуолизации цитоплазмы и разрыве клеточных
мембран на 3-й сутки гипероксии и в отделепии клеток от подложки на 5-ые сутки
непрерывной гипероксии.
В то же время, непрерывная гипероксия не оказывала подобного действия па
клетки с высоким уровнем экснрессии НОх-1, то есть на клетки А549-А4, у кото-
рых увеличена выживаемость в 4 раза (60% нротив 15%) через 3 дня, в 10 раз
(65% нротив 6%) через 4 дня и в 30 раз (35% против 1%) через 5 дней действия не-
 64
прерывной гипероксии по сравнению с клетками А549-пео. Интересно, что такое
повышение устойчивости клеток А549-А4 к действию окислительного стресса,
вызванного гипероксией, наблюдалось на фоне снижения роста этих клеток, что
является давно известным фактом в отношении Н2О2. Так, показано, что 78% кле-
ток А549-А4 находилось в фазе G1 клеточного цикла и только 13% этих клеток в
фазе S.
Селективный ингибитор НОх-1 протопорфирин олова (SnPPIX) в клетках с
повышенной экспрессией НОх-1 (А549-А4) отменял замедление клеточного роста
и снижал выживаемость этих клеток при действии гипероксии. Авторы объясняют
защитный эффект индукции НОх-1 при гипероксии образованием продуктов НОх-
реакции. Например, индукция синтеза ферритина в результате высвобождения же-
леза при деградации гема НОх-1 может приводить к ограничению участия Fe^^ в
реакции Фентона, и таким образом снижать свободнорадикальное окисление в
клетке. Замедление роста клеток с высоким уровнем НОх-1 (А549-А4) связывают с
повышенной индукцией защитных белков в ущерб структурным - стрессорных
генов GADD153, GADD45 (growth arrest and DNA damage-inducible) и белков теп-
лового шока. Нродукты этих генов участвуют не только в замедлении клеточного
роста, но и в репарации повреждепного ДНК при окислительном стрессе. Таким
образом, замедление роста клеток при действии гипероксии в клетках с повышен-
ной индукцией НОх-1 необходимо для того, чтобы клетки имели возможность
восстановить повреждение в ДНК до входа в S фазу клеточного цикла.
На культуре клеток лимфоцитов человека Rothfuss А. и др. [2001; 2002] по-
казали, что однократное действие гипероксии (гипербарическая оксигенация 1,5
ата, 1 час) на клетки приводило к индукции НОх-1 и защищало изолированные
лимфоциты человека от окислительного повреждения ДНК новторным действием
гипероксии (гипербарическая оксигенация 3 ата, 2 ч) или обработкой Н2О2. Обра-
ботка клеток ингибитором НОх-1 мезонорфирином олова (SnMPIX) приводила к
отмене защитного эффекта индукции НОх-1 при гипероксии.
Нодобный прекондиционирующий эффект гинероксии был получен и на
модели ишемии (25 мин) и реперфузии (60 мин) сердца [Tahep Id.P. et al., 2001]. В
данном исследовании крыс подвергали действию гипероксии (> 95% О2) в течение
60 или 180 мин, а затем через 24 ч после действия гипероксии на изолированных
 65
сердцах моделировали ишемические/реперфузионные повреждения. Авторы пока-
зали, что предварительное действие гипероксии защищало сердца крыс от ишеми-
ческих/реперфузионных повреждений, что проявлялось в снижении зоны инфарк-
та миокарда, в улучшении сердечной деятельности. Валено, что применяемое пре-
кондиционирующее воздействие оказывает нормализующее действие на сердеч-
ную деятельность крыс при ишемии/реперфузии сердца за счет синтеза защитных
систем, таких как антиоксидантные ферменты, НОх-1, HSP70 и eNO-синтаза.
Роль индукции НОх-1 в развитии аиоптоза клеток при различных по-
вреждающих воздействиях. В последнее время в литературе обсуждается роль
индукции НОх-1 при различных новреждающих воздействиях в регуляции апоп-
тотической гибели клеток, однако эти данные противоречивы.
На модели компрессионной травмы снинного мозга было показано, что уве-
личение экспрессии НОх-1 происходит вместе с увеличением уровня cGMP
[Maines M.D. et al., 2001]. Увеличение продукции CO в результате гем-
оксигеназной реакции активизировало cGMP-зависимые каскады клеточной сиг-
нализации, включая пути, затрагивающие апоптоз клеток, в частности индукцию
проапоптотических белков р53 и Вах. Кроме того, повыщенное образование АФК
при компрессионной травме снинного мозга приводило к активации МАРК-
зависимых сигнальных путей, которые участвуют в активации процесса апоптоза.
Увеличение апоптоза клеток, зависимое от активации р38 МАРК было таюке заре-
гистрировано в эпителиальпых клетках почки липии HeLa [Nemoto S. et al., 1998],
кардиомиоцитах [Wang Y. et al., 1998]) и лимфоидных клетках Jurkat Т [Huang S. et
al., 1997; Nemoto S. et al., 1998]. Активация аноптотических генов является защит-
ным эффектом, так как вторичным нроявлением повреждений в случае серьезной
травмы является некротическая гибель клеток, которая вызывает воспаление в со-
седних клетках [Maines M.D. et al., 2001]. В отличие от некротических клеток
апоптотические клетки подвергаются ауторазрушению и не вызывают поврежде-
ние тканей и гибель соседних клеток. Увеличение аноптотической гибели клеток
при индукции НОх-1 было также зарегистрировано у мышей, получающих мор-
фий [Patel К. et al., 2003]. Авторы показали, что в/б введение мышам морфия уве-
личивает экспрессию НОх-1 и апоптоз в брюшных макрофагах. Введение ингиби-
тора НОх-1 ZnPPIX снижало развитие апоптоза макрофагов. Нредполагают, что
 66
апоптотический эффект НОх-1 связан с повышенным уровнем внутриклеточного
Fe, активирующего образование АФК.
С другой стороны было показано антиапоптотическое действие НОх-1 на
модели воспалительного повреждения печени [Sass G. et al., 2003]. Введение жи-
вотным липополисахарида или TNF-a вызывало развитие апоптоза в клетках пече-
ни. Однако предварительная индукция НОх-1 гемином предотвращала развитие
апоптоза в клетках печени, что проявлялось, в частности, в ингибировании актив-
ности каспазы-3. Этот защитный эффект авторы связывают с образованием про-
дуктов гем-оксигеназной реакции (СО и билирубина), а также с индукцией синтеза
ферритина.
Кроме того, антианоптотический эффект НОх-1 также был показан на куль-
туре эндотелиальных клеток аорты быка [Brouard B.S. et al., 2000] и гранулярных
клеток мозжечка трансгенных мышей [Chen К. et al., 2000]. Так, на культуре эндо-
телиальных клеток аорты быка было показано увеличение апоптоза при инкубации
клеток с TNF-a, а добавление в среду культивирования гемина увеличивало экс-
прессию НОх-1 и защищало эндотелиальные клетки от развития апоптоза [Brouard
B.S. et al., 2000]. Авторы показали, что антиапоптотический эффект НОх-1 пе за-
висел от активации гуанилатциклазы и образования cGMP, и коррелировал с уве-
личением уровня СО в клетках. В работе также показано, что механизм антианон-
тотического действия НОх-1 включает активацию сигнальных путей, зависимых
от рЗ 8 МАРК.
На гранулярных клетках мозжечка диких и трансгенных мышей, характери-
зующихся высоким уровнем мРНК НОх-1 и гем-оксигеназной активности, а также
низкой концентрацией внутриклеточного кальция, показан нейропротекторный
эффект индукции НОх-1 при окислительном стрессе [Chen К. et al., 2000]. Так,
инкубация нейронов мышей дикого тина с глутаматом (30 мкМ или ЗмМ) приво-
дила к увеличению числа клеток с фрагментированной мембраной и конденсиро-
ванным хроматином в ядре, однако в нейронах трансгенных мышей зарегистриро-
ваны меньшие повреждения. Нейропротекторный эффект высокого уровня НОх-1
также проявлялся снижением гибели нейронов у трансгенных мышей при индук-
ции окислительного стресса Н2О2. В нейронах трансгенных мышей блокирована
 67
ядерная локализация белка-супрессора опухоли р53 и повышен уровень экспрес-
сии антиапоптотического белка Вс1-2 [PanahianN. et al., 1999].
Таким образом, разнонаправленный эффект действия индукции НОх-1 на
развитие апоптоза (активация или подавление) в клетках может быть связан с раз-
ным уровнем экспрессии и активности НОх-1, образования продуктов НОх-
реакции, а также с разными повреждающими воздействиями, применяемыми на
различных типах клеток и видах животных.
Роль индукции НОх-1 в регуляции артсриальиого давления. Большой
интерес представляют данные об участии системы НОх - гем - СО в регуляции
артериального давления в норме и во время различных повреждающих воздейст-
вий (ишемия/реперфузия, септический шок, гипертония, инфаркт миокарда) [Chen
Y.H. et al., 2003; Ndisang J.F. et al., 2003], поскольку АФК-опосредованная актива-
ция НОх-1 и экснрессия конститутивной НОх-2 приводит к образованию повы-
шенного уровня СО [Maines M.D., 2000]. Marks G.S. с соавт. [1991] обратили вни-
мание на химическое нодобие между СО и N 0 и предположили, что СО может
быть физиологическим регулятором, родственным N0. СО, подобно N0, может
стимулировать активность фермента гуанилатциклазы, связываясь с гемом на его
активном участке, который превращает GTP в cGMP. Молекулярными мишенями
cGMP служат протеинкиназы, фосфодиэстеразы и ионные каналы [Maines M.D.,
2000]. Важным аспектом cGMP-сигнальной системы является взаимодействие
НОх-1, NO-синтазы и гуанилатциклазы, которое управляется через N0, как индук-
тора НОх-1 [Maines M.D. et al., 1993] и СО, как ингибитора NO-синтазы и экспрес-
сии мРНК НОх-1 [Yee E.L. et al., 1996]. И водорастворимая гуанилатциклаза, и
NO-синтаза - гемопротеины, простетическая группа гема которых, вероятно, явля-
ется субстратом для НОх-1 [Schwartsburd P.M., 2001]. Таким образом, НОх-1 мо-
жет играть роль прямого регулятора гуанилатциклазы и NO-синтазы, которые в
свою очередь регулируют ее активность.
Показано, что стресс (в частности, введение стероидных гормонов, темпера-
турный стресс) вызывает снижение образования N0, при этом уровень cGMP в
ткани значительно не уменьшается [Maines M.D. et al., 1995; Morita Т. et al., 1995].
Последнее достигается за счет компенсаторной индукции НОх-1, которая через
образование СО способна активировать гуанилатциклазу и увеличивать уровень
 68
cGMP. Известно, что острый стресс является мощным стимулятором выхода глю-
кокортикоидных гормонов нз надпочечников, которые вызывают снижение транс-
кринции гена NO-синтазы [Hatlor Y. et al., 1997], но не оказывают заметного инги-
бирующего влияния на уровень мРНК НОх-1 [Maines M.D. et al., 1995]. По этой
причине НОх-1-зависимое регулирование CO/cGMP способно влиять на сужение
сосудов при стрессе и развитие постстрессорной гипоперфузии тканей. Введение
животным специфического ингибитора НОх-1 приводит к снижению уровня СО и
cGMP в аорте при остром стрессе и полностью восстанавливает вызванное стрес-
сом сужение сосудов [Johnson R.A. et al., 1997].
Суммируя известные данные об изменении экспрессии и активности, разных
изоформ НОх при различных натологических состояниях, можно заключить, что
регуляция НОх является центральным компонентом клеточных механизмов защи-
ты (рис. 5). Хотя активные изоформы НОх катализируют одинаковую реакцию,
НОх-1 и НОх-2 могут функционировать но-разному. НОх-1 - это стресс-
индуцированная форма, которая быстро активируется АФК и гипоксическими или
гипероксическими состояниями. Высокая индукция НОх-1 защищает клетки при
различных патологических состояниях, быстро вовлекается в инактивацию проок-
сидантного гема, образованного при денатурации гемопротеинов, и преобразует
его в билирубин, обладающего антиоксидантными свойствами и СО, который в
свою очередь является вторичным мессенджером внутриклеточной сигнализации.
Кроме того, повышенная индукция НОх-1 опосредует изменения в процес-
сах, связанных с развитием апоптоза, в частности может вызывать экспрессию
проапоптотических белков - р53, RIP, Вах и Trail и антиапоптотических белков -
Вс1-2, BC1-XL. НОХ-2 является конститутивной формой и помимо поддержания
клеточного гомеостаза гема участвует в инактивации избыточных N 0 и АФК.
НОх-2 связывает N0 с помощью «гем акцепторного участка», а ее высокий уро-
вень экспрессии в клетке позволяет образовывать внутриклеточный буфер для N0.
Таким образом, необходимо отметить полифункциональность действия раз-
ных изоформ НОх и продуктов их реакции, которое нельзя сводить только к «но-
ложительным» или только «отрицательным» эффектам. Хотя продукты гем-
оксигеназной реакции могут оказывать протекторный эффект на клетки организ-
 69

ма, в больших концентрациях они могут вызывать повреждающее действие в ки-

слород чувствительных тканях.

Повреждение клеток

t
Окислительный
стресс
воспаление, гипоксия, Ферритин Fe-ферритин (защита)
ишемия/реперфузия,
гипероксия t
Fe Повреждение
клеток

Гемопротеины Гем Гем-оксигеназа ^ Билирубин

(защита)
Защита или
повреждение

Повреждение клеток Другие защитные

эффекты
Свободнорадикальное
окисление;
Фрагментация ДНК;
Нарушение функции
митохондрий

Рис. 5. Механизмы защитного эффекта НОх от повреждений, вызванных

окислительным стрессом.

Таким образом, завершая обзор о роли свободнорадикальных процессов в

организме и основных защитных системах клетки, можно отметить следующие
неизученные вопросы.
Во-первых, мало известно относительно компонентного состава редокс-
сигнальной системы и последовательности включения ее звеньев при физиологи-
ческих условиях, а переход физиологического сигнала в патологический при ги-
поксии, практически не изучен. Поэтому, необходимо проведение комплексного
изучения механизмов индукции защитных систем клетки и их участия в регуляции
свободнорадикального окисления при различных патологических состояниях
(ишемия, гипоксия, стресс).
Во-вторых, какова динамика индукции защитных белков при гипоксических
состояниях, а также изменения устойчивости мембранных структур разных орга-
нов к действию повреждающих факторов.
 70
И, в-третьих, тканеспецифические особенности ответа на новреждающие
воздействия у крыс с генетически детерминированной различной устойчивостью к
действию разных факторов окружающей среды.

Глава 3. Современные представления о механизмах адантации к различным

факторам среды.
В настоящее время все большее значение приобретают немедикаментозные
способы коррекции патологических состояний и повышения резистентности здо-
рового организма к действию повреждаюших факторов среды, К таким методам
относятся различные виды адаптации и, прежде всего - к стрессу, физическим и
гипоксическим нагрузкам. Разрабатываются новые способы адаптации к мягким
стрессорным или гипоксическим воздействиям, а также адаптации к нескольким
факторам одновременно.
В процессе адаптации к любому фактору среды можно выделить два основ-
ных этапа: начальный этап — срочная, но несовершенная адаптация и последую-
щий этап - долговременная, устойчивая адаптация [Меерсон Ф.З., Пшенникова
М.Г., 1988]. Срочная адаптация реализуется мгновенно, но реакция организма
протекает с высокой утратой резервов, результат ее является кратковременным и
сопровождается выраженной стресс-реакцией. При этом происходит активация
адренергической и гипоталамо-гипофизарно-адреналовой систем, то есть стресс-
реализующих систем, неспецифически реагирующих в ответ на самые различные
изменения в окружающей среде. Основными медиаторами этой системы, реали-
зующими стресс-реакцию, являются катехоламины и кортикостероиды [Пшенни-
кова М.Г., 2001; Chrousos G.P., Gold P.W., 1992; Stratakis С.А., Chrousos G.P.,
1995].
В ограничении стресс-реакции важную роль играет активация стресс-
лимитирующих систем, индукция которых связана с предшествующим увеличени-
ем мощности стресс-реализующих систем. Действие стресс-лимитирующих сис-
тем заключается в ограничении эффекта стрессорных факторов и проявляется как
на центральном уровне, так и на уровне клетки. К центральным стресс-
лимитирующим системам относятся ГАМК-ергическая, опиоидергическая и до-
фаминергическая системы, системы серотонина, оксида азота и, возможью, другие
 71
системы мозга [Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г,, 1988; 1989; Меерсон Ф.З., 1993;
Пшенникова М.Г., 1994; Малышев И.Ю., Манухина Е.Б., 1998]. Кроме активации
центральных стресс-лимитирующих систем, происходит активация перифериче-
ских стресс-лимитирующих систем, ограничивающих стресс-реакцию непосредст-
венно на уровне клеток. К ним относятся системы простагландинов [Пшенникова
М.Г., 1991; Пшенникова М.Г. и др., 1992], аденозина, оксида азота [Малышев
И.Ю., Манухина Е.Б., 1998; Пшенникова М.Г. и др., 2001; 2002], ферменты анти-
оксидантной защиты, а также система неспецифических белков срочного ответа -
протоонкогенов с-тус, c-fos, белков семейства HSP и др. [Меерсон Ф.З. и др.,
1992; 1994; Пшенникова М.Г. и др., 2001].
Активация стресс-реализующих и стресс-лимитирующих систем, состав-
ляющая основу начальных стадий адаптации, ведет к формированию структурного
«следа», что происходит на второй, переходной стадии от срочного ответа к дол-
говременной адаптации. Долговременный этап адаптации возникает постепенно в
результате длительного или многократного действия на организм факторов среды.
По существу, он развивается на основе многократной реализации срочной адапта-
ции и характеризуется более совершенной, экономной реакцией организма на дан-
ный фактор среды, отсутствием выраженной стресс-реакции и возможностью
нормальной жизнедеятельности в условиях действия этого фактора [Меерсон Ф.З.,
Пшенникова М.Г., 1988; Меерсон Ф.З., 1993; Пшенникова М.Г., 1994].
Показано, что адаптация к любому фактору среды формирует два вида
структурного «следа» - специфический, зависящий от природы действующего
фактора и неспецифический, присутствующий во всех видах адаптации и обуслов-
ленный универсальной стресс-реакцией организма [Меерсон Ф.З., 1993]. В резуль-
тате функциональные системы, ответственные за адаптацию, значительно увели-
чивают свою активность за счет повышенной, избирательной активации фермен-
тов и структур, недостаток которых ограничивает функционирование клетки в но-
вых условиях. Например, показано, что адаптация к стрессорным воздействиям,
входящая как составная часть в адаптацию к любому интенсивному воздействию
среды, имеет защитные эффекты на уровне организма, органов, а также на уровне
внутриклеточных структур. В основе защитного действия адаптации к стрессу ле-
жат нейрогуморальные и клеточные регуляторные изменения, развивающиеся в
 72
организме при повторных стрессорных воздействиях, которые, во-первых, ограни-
чивают интенсивность и длительность самой стресс-реакции и, во-вторых, повы-
шают резистентность органов-мишеней к действию стрессорных гормонов и ме-
диаторов [Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г., 1988].
При адаптации к гипоксии также показано формирование специфического
структурного «следа» на разных уровнях организма. В системах транспорта ки-
слорода специфический структурный «след» проявляется в развитии коронарного
русла в легких [Ахмедов К.Ю., 1971; Агаджанян Н.А, и др., 1973], сердце и голов-
ном мозге [Meerson F.Z., Pshennikova M.G., 1979; Van Liere E.J. et al., 1985;
Obradovic D. et al., 1989; Rakusan K. et al., 1998; La Manna J.C, 1998], в увеличении
количества эритроцитов и уровня гемоглобина в крови, концентрации миоглобина
в скелетных и сердечных мышцах [Меерсон Ф.З. и др., 1986]. В регуляторных сис-
темах при адаптации к гипоксии, с одпой стороны, происходит увеличение актив-
ности ферментов, ответственных за синтез медиаторов и гормонов, а с другой -
увеличение числа рецепторов к ним в тканях [Пшенникова М.Г. и др., 1992;
Meerson F.Z. et al., 1987].