PORTOFOLIO PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

Makalah ini disusun untuk Memenuhi Sebagian Tugas Mata Kuliah Praktek Mikrobiologi

Disusun oleh: 1. Enggar Bagus Rakasiwi 2. Fathurrohman 3. Mega Ayu Anggraeni 4. Nurfidya Intan Permana 5. Septyana Elizabeth 6. Tika Merdiana 7. Tria Risky Pambudi 11.012 11.016 11.028 11.031 11.039 11.041 11.042

AKADEMI ANALIS FARMASI DAN MAKANAN PUTRA INDONESIA MALANG 2012

BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Sediaan farmasi seperti kosmetik, makanan serta obat-obatan merupakan bahan-bahan yang digunakan dan erat kaitannya dengan kebutuhan manusia yang harus dipenuhi bagi pemeliharaan, pertumbuhan. Oleh karena itu, berbagai sediaan farmasi sangat dibutuhkan oleh setiap manusia agar segala kebutuhannya dapat terpenuhi dengan baik. Namun sediaan farmasi juga dapat berperan sebagai sarana pengganggu kesehatan bagi manusia karena dapat terkontaminasi oelh cemaran fisik, kimia maupun mikroba. Hampir semua bahan dari sediaan farmasi tercemar oleh berbagai mikroorganisme dari lingkungan sekitarnya. Beberapa jenis mikroba yang terdapat pada bahan pangan adalah Salmonella sp, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, kapang, kamir serta mikroba patogen lainnya. Pencemaran mikroba pada bahan dari sediaan farmasi merupakan hasil kontaminasi secara langsung maupun tidak langsung dengan sumbersumber pencemaran mikroba, seperti tanah, air, udara, debu, saluran pencernaan dan pernafasan manusia maupun hewan. Hanya sebagian saja dari berbagai sumber pencemar yang berperan sebagai sumber mikroba awal yang selanjutnya akan berkembang biak pada bahan sediaan farmasi tersebut, tetapi apabila kondisi lingkungan memungkinkan mikroba untuk tumbuh dan berkembang lebih cepat, maka bahan dari sediaan farmasi akan rusak karenanya. Keamanan bahan-bahan yang digunakan pada sediaan farmasi sangat pentig dalam menjamin bahan-bahan tersbut aman dan layak untuk dikonsumsi. suplai bahan-bahan baku sediaann farmasi yang aman tidak hanya melindungi kesehatan masyarakat Indonesia, tetapi juga meningkatkan kualitas generasi muda dengan sediaan farmasi yang aman dan layak untuk dikonsumsi. indonesia telah memiliki standar nasional yang berkaitan dengan keamanan produk-produk sediaan farmasi tersebut, yaiu Standar Nasional Indonesia (SNI). Standar ini memuat bagaimana memproduksi produk sediaan farmasi yang benar, bagaimana mengukur cemaran dan menyajikan batas maksimum cemaran yang diperbolehkan. Standar ini diharapkan dapat memberikan jaminan keamanan produk sediaan farmasi Indonesia.

1.2 Rumusan Masalah 1. Apakah dalam sampel sediaan farmasi yang berupa sirup suspensi ibuprofen, mayonaise dan bedak tabur merk viva terdapat cemaran mikroba? 2. Bagaimana cara mengidentifikasi adanya cemaran mikroba dalam sediaan farmasi berupa sirup suspensi ibuprofen , mayonaise dan bedak tabur merk viva ? 3. Berapa banyak koloni yang ditemukan dalam percobaan identifikasi cemaran mikroba dalam sirup suspensi ibuprofen ,mayonaise dan bedak tabur merk viva? 1.3 Tujuan 1. Untuk mengetahui ada tidaknya cemaran mikroba dalam sampel yang diteliti berupa sirup suspensi ibuprofen ,mayonaise dan bedak tabur merk viva. 2. Untuk mengetahui cara dentifikasi cemaran mikroba pada sampel yang diteliti berupa berupa sirup suspensi ibuprofen ,mayonaise dan bedak tabur merk viva. 3. Untuk mengetahui banyaknya koloni cemaran mikroba pada sampel yang diteliti berupa sirup suspensi ibuprofen ,mayonaise dan bedak tabur merk viva.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Tinjauan Produk Dalam pengujian mutu sutu produk sediaan farmasi yang meliputi makanan, minuman, kosmetik dan obat-obatan diperlukan berbagai uji yang mencakup uji fisik, uji kimia, uji mikrobiologi dan uji organoleptik. Uji mikrobiologi merupakansalah satu uji yang penting, karena selain dapat menduga daya tahan simpan suatu produk farmasi, juga dapat digunakan sebagai indikator sanitasi atau indikator keamanan produk farmasi tersebut. Pengujian

mikrobiologi diantaranya meliputi uji kualitatif untuk menentukan mutu dan daya tahan suatu produk, uji kualitatif bakteri patogen untuk menentukan tingkat keamanannya, dan uji

bakteri indikator untuk mengetahui tingkat sanitasi produk tersebut. Tabel Spesifikasi Persyaratan Mutu Mayonaise No 1 1.1 1.2 1.3 1.4 2 3 4 5 6 7 8 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 9 Jenis Uji Keadaan Bau Rasa Warna Tekstur Air, b/b Protein, b/b Lemak, b/b Karbohidrat, b/b Kalori Pengawet Cemaran logam Timbal (Pb) Tembaga (Cu) Seng (Zn) Timah (Sn) Raksa (Hg) Cemaran arsen (As) mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg Maks 1,5 Maks 10,0 Maks 10,0 Maks 10,0 Maks 0,03 Maks 0,1 % % % % K cal/100g Satuan Persyaratan Normal Normal Normal Normal Normal Maks 30 Maks 0,9 Min 65 Maks 4 Min 600 Sesuai SNI 01-0222-1995

10 10.1 10.2 10.3 10.4

Cemaran mikroba ALT Bakteri bentuk coli E.coli Salmonella Koloni/g APM/g Koloni/10g Koloni/25g Maks 104 Maks 10 Negatif Negatif

Tabel Spesifikasi Persyaratan Mutu Kosmetik 1. Persyaratan cemaran mikroba Persyaratan Kosmetika untuk: i. Anak dibawah 3 tahun Pengujian ii. Area sekitar mata iii. Membran mukosa Angka lempeng total Kosmetika selain untuk: i. Anak dibawah 3 tahun ii. Area sekitar mata iii. Membran mukosa

Tidak lebih dari 5x102 koloni/g Tidak lebih dari 103 koloni/g atau koloni/ml atau koloni/ml

Angka khamir

kapang

dan Tidak lebih dari 5x102 koloni/g Tidak lebih dari 103 koloni/g atau koloni/ml atau koloni/ml

P.aeruginosa

Negatif per 0,1 g atau 0,1 ml Negatif per 0,1 g atau 0,1 ml sampel (contoh uji) sampel (contoh uji)

S.aureus

Negatif per 0,1 g atau 0,1 ml Negatif per 0,1 g atau 0,1 ml sampel (contoh uji) sampel (contoh uji)

C.albicans

Negatif per 0,1 g atau 0,1 ml Negatif per 0,1 g atau 0,1 ml sampel (contoh uji) sampel (contoh uji)

2. Persyaratan cemaran logam berat Jenis cemaran Merkuri (Hg) Timbal (Pb) Arsen (As) Persyaratan Tidak lebih dari 1mg/kg atau 1mg/L (1 ppm) Tidak lebih dari 20 mg/kg atau 20 mg/L (20 ppm) Tidak lebih dari 5 mg/kg atau 5 mg/L (5 ppm)

2.2 Parameter Uji Cemaran Mikroba A. Uji Angka Lempeng Total Metode kuantitatif yang digunaan untuk mengetahui jumlah mikroba yang ada pada suatu sampel, umumnyadikenal dengan Angka Lempeng Total (ALT). Uji Angka Lempeng Total dan lebih tepatnya ALT aerob mesofil atau anaerob mesofil menggunakan media padat dengan hasil akhir berupa koloni yang dapat diamati secara visual berupa angka dalam koloni (cfu) per ml/g atau koloni/100ml. Cara yang digunakan antara lain dengan cara tuang sebar, cara tetes dan cara sebar. Prinsip pengujian ALT menurut metode analisis mikrobiologi yaitu pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil setelah cuplikan diinokulasi pada media lempeng agar dengan cara tuang dan diinkubasi pada suhu yang sesuai. Pada pengujian Angka Lempeng Total digunakan PDF (Pepton Dilution Fluid) sebagai pengencer sampel dan menggunakan PCA (Plate Count Agar) sebagai media padatnya. Hasil pengamatan dan perhitungan yang diperoleh dinyatakan sesuai persyaratan sebagai berikut: 1. Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 25-250. Jumlah koloni rata-rata dari kedua cawan dihitung lalu dikalikan dengan faktor pengencernya. Hasil dinyatakan sebagai Angka Lempeng Total dari tiap gram atau tiap ml sampel. 2. Bila salah satu dari cawan petri menunjukkan jumlah koloni kurang dari 25 atau lebih dari 250, dihitung jumlah rata-rata koloni. Kemudian dilakukan faktor pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai angka lempeng total dari tiap gram atau tiap ml sampel. 3. Jika terdapat cawan-cawan dari dua tingkat pengenceran yang berurutan menunjukkan jumlah koloni antara 25-250, maka dihitung jumlah koloni dari masing-masing tingkat pengenceran, kemudian dikalikan dengan faktor penegncerannya. Apabila hasil perhitungan pada tingkat yang lebih tinggi diperoleh jumlah koloni rata-rata lebih besar dari dua kali jumlah koloni ratarata pengenceran dibawahnya, maka ALT dipilih dari tingkat pengenceran yang lebih rendah. Bila hasil perhitungan pada tingkat pengenceran lebih tinggi diperoleh jumlah koloni rata-rata kurang dari dua kali jumlah rata-raa pada pengenceran dibawahnya maka ALT dihitung dari rata-rata jumlah koloni kedua tingkat pengenceran tersebut.

4. Bila tidak ada satupun koloni dari cawan maka ALT dinyatakan sebagai < 1 dikalikan faktor pengenceran terendah.

Keuntungan dari metode pertumbuhan agar atau metode uji angka lempeng total adalah dapat mengetahui jumlah mikroba yang dominan. Keuntungan lainnya dapat diketahui adanya mikroba jenis lain yang terdapat dari contoh. Adapun kelemahan dari metode ini adalah: 1. Kemungkinan terjadinya koloni yang berasal lebih dari satu sel mikroba seperti pada mikroba yang berpasangan, rantai atau kelompok sel. Kemungkinan ini akan memperkecil jumlah sel mikroba yang sebenarnya. 2. Kemungkinan adanya jenis mikroba yang tidak dapat tumbuh karena penggunaan jenis media agar, suhu, pH, atau kandungan oksigen selama masa inkubasi. 3. Kemungkinan ada jenis mikroba tertentu yang tumbuh menyebar diseluruh permukaan media agar sehingga menghalangi mikroba lain. Hal ini akan mengakibatkan mikroba lin tersebut tidak terhitung. 4. Perhitungan dilakukan pada media agar yang jumlah populasi mikrobanya antara 30-300 koloni. Bila jumlah populasi kurang dari 30 koloni akan menghasilkan perhitungan yang kurang teliti secara statistik, namun bila lebih dari 300 koloni akan menghasilkan hal yang samakarena terjadi persaingan diantara koloni. 5. Perhitungan populasi mikroba dapat dilakukan setelah masa inkubasi yang umumnya membutuhkan waktu 24 jam atau lebih.

B.

Uji MPN Coliform Bakteri coliform adalah golongan bakteri intestinal, yaitu hidup dalam saluran pencernaan manusia. Bakteri coliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri patogenik lain. Lebih tepatnya, sebenarnya bekteri coliform fekal adalah bakteri indikator adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan coliform fekal menjadi indikator penecemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkolerasi positif dengan keberadaan bakteri patogen. Selain itu, mendeteksi coliform jauh lebih murah, cepat dan sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain. Contoh bakteri coliform adalah Escherichia coli dan Enterobacter aerogenes.

Coliform adalah kelompok bakteri gram negatif berbentuk batang yang pada umumnya menghasilkan gas jika ditumbuhkan dalam medium laktosa. Salah satu anggota kelompok coliform adalah E.coli dan karena E.coli adalah bakteri coliform yang ada pada kotoran manusia maka E.coli sering disebut sebagai coliform fekal. Pendekatan lain untuk numerasi bakteri hidup adalah dengan metode MPN. MPN didasarkan pada metode statistik (teori kemungkinan). Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri coliform yang merupakan kontaminan. Ciri utamanya yaitu bakteri gram negatif, batang pendek, tidak membentuk spora, memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi dalam waktu 24 jam inkubasi pada suhu 37oC. Prinsip pengujian angka paling mungkin (MPN) coliformm menurut metode analisis mikrobiologi yaitu pertumbuhan bakteri coliform setelah cuplikan diinokulasi pada media cair yang sesuai, dengan mengamati adanya reaksi fermentasi dan pembentukan gas dalam tabung durham. Pada pengujian MPN coliform digunakan PDF (Pepton Dilution Fluid) sebagai pengencer, Mac Conkey Broth (MCB) dan Brilliant Green Lactose Bile 2% Broth (BGLB) sebagai media cairnya. C. Uji Salmonella Salmonella adalah suatu genus bakteri enterobakteria gram-negatif berbentuk tongkat yang menyebabkan tifus, paratifus dan penyakit foodbone. Spesies-spesies Salmonella dapat bergerak bebas dan menghasilakn hidrogen sulfida. Prinsip pengujian deteksi Salmonella menurut Metode Analisis Mikrobiologi yaitu ada empat tahap untuk mendeteksi adanya Salmonella: 1. Pra pengkayaan dalam media cair non selektif yang diinkubasi pada 37 1oC selama 18 2 jam. 2. Pengkayaan dalam media cair selektif yang diinkubasi pada 41,5 1o C selama 24 3 jam dalam RVS cair dan 37 1o C selama 243jam MKTTn cair. 3. Inokulasi dan identifikasi dalam 2 media padat selektif, media selektif pertama diinkubasi pada 37 1oC selama 24 3 jam dan dengan media yang digunakan. 4. Konfirmasi terhadap identitas Salmonella dengan uji biokimia dan serologi.

Pada pengujian deteksi Salmonella digunakan Buffered Peptone Water (BPW) sebagi media cair non selektif. Muller Kaufimann Tetrathionate Novobiocin Broth

(MKTTn) dan Rappapport Vassiliadis Medium + Soya (RVS) sebagai media selektif cair, Bismuth Green Agar (BGA) dan Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) media padat selektif untuk mengisolasi Salmonella. D. Uji Escherichia coli E.coli adalah gram negatif, anaerobik fakultatif dan non spora. Sel-sel biasanya berbentuk panjangnya sekitar 2 mikrometer (m) dan diameternya 0,5 (m) dengan volme sel 0,6-0,7 (m). E.coli menggunakan fermentasi asam campuran dalam kondisi anaerobik, mengasilkan laktat, suksinat, etanol, asetat dan karbondioksida. Prinsip pengujian deteksi Escherichia coli menurut Metode Analisis Mikrobiologi yaitu pertumbuhann koloni Escherichia coli pada media lempeng selektif dan dilanjutkan dengan konfirmasi melalui uji biokimia. Pada pengujian deteksi Escherichia coli digunakan Tryptic Soy Broth (TSB) sebagai media cair atau penegncer dan Eosyn Methylen Blue (EMB) sebagai media lempang selektif. Escherichia coli merupakan bakteri gram negatif berbentuk batang, uji indol positif dan mampu memfermentasi berbagai karbohidrat seperti glukosa, laktosa, mannitol dan arabinosa. Ada tiga media yang dapat digunakan untuk membedakan Escherichia coli dan mikroba lainnya yaitu media Eosin Methylene Blue mempunyai keistimewaan mengandung laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasi laktosa seperti Escherichia coli dengan mikroba yang tidak memfermentasi laktosa seperti S.aureus, P.aeruginosa dan Salmonella. Mikroba yang memfermentasi laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelapdengan kilap logam, sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Adanya Eosin Methylene Blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun demikian jika media ini digunakna pada tahap awal, karena mikroba lain juga tumbuh terutama P. Aeruginosa dan Salmonella dapat menimbulakn keraguan. Bagaimanapun media Eosin Methylene Blue sangat baik untuk mengkonfirmasi bahwa kontaminan tersebut adalah E.coli. E. Uji Kapang Kapang adalah kelompok mikroba yang tergolong dalam fungi, ilmu yang mempelajari mengenai fungi disebut mikologi. Fungi adalah organisme heterotrofik, untuk nutrisinya memerlukan senyawa organik. Beberapa fungi hidup dari benda organik mati yang terlarut, mikroorganisme ini disebut saprofit. Segi positif dari fungi berperan penting dalam industri fermentasi dan produksi antibiotik seperti penisilin. Tetapi segi negatifnya yaitu sebagai parasit pada tumbuh-tumbuhan, hewan dan manusia. Fungi

lebih besar dari bakteri, ukuran fungi berkisar 1-5 m, lebar dan panjangnya 5-30 m atau lebih. Fungi dapat mensintesa protein dengan mengambil sumber karbon dari karbohidrat (glukosa, sukrosa dan maltosa), sumber nitrogen dari bahan organik atau bahan anorgani (ammoniium dan nitrat) dan mineral dari substratnya. Fungi atau kapang adalah fungi multiseluler yang mempunyai filamen. Kapang adlaah mikroorganisme aerobik sejati. Heterotrop, suhu optimum kapang saprofitik 22-30oC dan kapang patogen 30-37oC. Kapang berlawanan dengan bakteri dan khamir, seringkali dapat dilihat dengan mata. Sifat pertumbuhan yang khas adalah berbentuk kapas dan biasnya terlihat pada kertas-kertas yang basah, kulit-kulit yang sudah usang, dinding basah, buah-buahan yanng membususk dan bahan pangan lainnya seperti keju dan selai. Pertumbuhan dapat berwarna hitam, putih atau berbagai macam warna. Secara biokimia kapang bersifat aktif karena terutama merupakan organisme saprofitik. Organisme ini dapat memecah bahanbahan organik kompleks menjadi yang lebih sederhana termasuk pembusukan daun-daun dan bahan lain dalam tanah. Kegiatan yang sama dapat menyebabkan pembusukan pada pangan yang terjadi dimana-mana.

BAB III METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Alat dan Bahan 3.1.1 Alat yang digunakan 1. timbangan analitik 2. Inkubator 3. Stomacher 4. Gelas Ukur 5. Cawan Petri 6. Tabung Reaksi 7. Rak Tabung 8. Autoclave 9. Tabung durham 10. Blue tip 11. Mikropipet 3.2 Prosedur Kerja 3.2.1 Pembuatan media a. Pembuatan media Buffered Pepton Water Timbang pepto sebanyak 20 gram dan dimasukkan kedalam beaker glass dan dilarukan (dihomogenisasi) dengan aquadest sebanyak 1000 ml, kemudian dipanaskan diatas hot plate sampai mendidih, larutan didinginkan dan dipndahkan kedalam tabung masing-masing sebanyak 9 ml, kemudian disterilisasi menggunakan autoclave pada temperatur 121o C selama 15 menit. b. Pembuatan media Plate Count Agar (PCA) PCA ditimbang sebanyak 22,5 gram, dimasukkan kedalam beaker glass dan dilarutkan (dihomogenisasi) dengan aquadest sebanyak 1000 ml, kemudian dipanaskan diatas hot plate sampai mendidih,disterilisasi dengan autoclave pada temperatur 121o C selama 15 menit. c. Pembuatan media Levine Eosin Methylene Blue Agar L-EMB ditimbang sebanyak 37,5 gram dan dimasukkan kedalam beaker glass dilarutkan (dihomogenisasi) dengan aquadest sebanyak 1000 ml, kemudian dipanaskan diatas hot plate sampai mendidih, larutan didinginkan dan dipindahkan kedalam tabung masing-masing sebanyak 15 ml, kemudian disterilisasi menggunakan autoclave pada temperatur 121o C selama 15 menit.

d. Pembuatan media Potato Dextrose Agar PDA ditimbang sebanyak 39 gram dan masukkan dalam bekaer glass dilarutkan (dihomogenisasi) dengan aquadest sebanyak 1000 ml, kemudian dipanaskan diatas hot plate sampai mendidih, larutan didinginkan dan dipindahkan kedalam tabung masing-masing sebanyak 15 ml, kemudian disterilisasi menggunakan autoclave pada temperatur 121o C selama 15 menit. e. Pembuatan media Nutrient Agar NA ditimbang sebanyak 23 gram dan masukkan dalam bekaer glass dilarutkan (dihomogenisasi) dengan aquadest sebanyak 1000 ml, kemudian dipanaskan diatas hot plate sampai mendidih, larutan didinginkan dan dipindahkan kedalam tabung masing-masing sebanyak 15 ml, kemudian disterilisasi menggunakan autoclave pada temperatur 121o C selama 15 menit. f. Pembuatan media Lactose Broth LB ditimbang sebanyak 39 gram dan masukkan dalam bekaer glass dilarutkan (dihomogenisasi) dengan aquadest sebanyak 1000 ml, kemudian dipanaskan diatas hot plate sampai mendidih, larutan didinginkan dan dipindahkan kedalam tabung masing-masing sebanyak 15 ml, kemudian disterilisasi menggunakan autoclave pada temperatur 121o C selama 15 menit. g. Pembuatan media Manitoll Salt Agar MSA ditimbang sebanyak 111 gram dan masukkan dalam bekaer glass dilarutkan (dihomogenisasi) dengan aquadest sebanyak 1000 ml, kemudian dipanaskan diatas hot plate sampai mendidih, larutan didinginkan dan dipindahkan kedalam tabung masing-masing sebanyak 15 ml, kemudian disterilisasi menggunakan autoclave pada temperatur 121o C selama 15 menit. h. Pembuatan Bacto Pepton Larutkan 1 gram dan ditambah 9 ml NaCl kedalam 1 liter air destilasi (aquadest) atau air deionsasi.Panaskan dengan air mendidih atau aliran uap hingga homogen. Sterilisasi kedalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121oC.

3.2.2 Prosedur Analisis Cemaran Mikroba Escherichia coli 1. Uji pendugaan coliform (presumtive test).

a. Siapkan pengenceran sampel 102 dengan cara melarutkan 1 ml larutan 10-1 ke dalam 9 ml larutan pengencer BFP. Lakukan pengenceran selanjutnya sesuai dengan pendugaan kepadatan populasi b. Pindahkan dengan menggunakan pipet steril, sebanyak 1 ml larutan dari setiap pengenceran ke dalam 3 seri tabung lauryl tryptose Broth (LTB) yang berisi tabung durham. c. Inkubasi tabung-tabung tersebut selama 48 jam 2 jam pada suhu 35oC 1oC. Perhatikan gas yang terbentuk setelah inkubasi 24 jam dan inkubasikan kembali tabung-tabung negatif selama 24 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham. d. Tentukan nilai angka paling memungkinkan (APM) berdasarkan jumlah tabung-tabung BGLB yang positif dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan (APM). Nyatakan nilainya sebagai APM/g coliform 2. Uji pendugaan Escherichia coli a. Inokulasikan dari setiap tabung LTB yang positif ke tabung-tabung EC Broth yang berisi tabung durham dengan menggunakan jarum ose,. Inkubasi EC Broth dalam waterbath selama 48 jam 2 jam pada suhu 45oC 0,5oC. Waterbath harus dalam keadaan bersih, air di dalamnya harus lebih tinggi dari tinggi cairan yang ada dalam tabung yang akan diinkubasi. b. Periksa tabung-tabung EC Broth yang menghasilkan gas selama 24 jam 2 jam, jika negatif inkubasikan kembali sampai 48 jam 2 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham. c. Tentukan nilai angka paling memungkinkan (APM) berdasarkan jumlah tabung-tabung EC yang positif dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan (APM). Nyatakan nilainya sebagai APM/g faecal coliform. 3. Uji penegasan Escherichia coli (confirmed Escherichia coli) a. Dari tabung-tabung EC Broth yang positif dengan menggunakan jarum ose gores ke LEMB agar. Inkubasi selama 24 jam 2 jam pada suhu 35oC + 1oC. b. Koloni Escherichia coli terduga memberikan ciri yang khas (typical) yaitu hitam pada bagian tengah dengan atau tanpa hijau metalik. c. Ambil lebih dari satu koloni (typical) Escherichia coli dari masing-masing cawan LEMB dan goreskan ke media PCA miring dengan menggunakan jarum tanam. Inkubasi selama 24 jam 2 jam pada suhu 35oC+ 1oC.

d. Jika koloni yang khas (typical ) tidak ada, pindahkan 1 atau lebih koloni yang tidak khas (typical) Escherichia coli ke media PCA miring. Angka lempeng total 1. Timbang 2 gram atau pipet 25 ml sampel sampel dengan cara aseptis dan masukkan kedalam kantong stomacher steril. 2. Tambahkan larutan PDF dan homogenkaan dengan stomacher selama 3 detik sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 101 dan siapkan 5 tabung atau lebih yang masing-masing telah diisi denga 9 ml PDF. 3. Hasil homogenisasi pada penyiapan sampel yang merupakan pengenceran 101 dipipet sebanyak 1 ml kedalam tabung PDF pertama, dikocok homogen hingga diperoleh pengenceran 102 dan buat higga penegenceran 106. 4. Dari setiap pengenceran dipipet 1 ml kedalam cawan petri yang dibuat duplo, kedalam setiap cawan dituangkan 15-20 ml media PDA. 5. Cawan petri segera digoyang dan diputar sedemikian rupa hingga suspens tersebar merata. 6. Cawan diinkubasi pada suhu 35-37oC selama 24-46 jam dengan posisi terbalik. Setelah itu jumlah koloni yangn tumbuh diamati dan dihitung. Uji Salmonella 1. Pipet 1 ml sampel pada setiap penegenceran kedalam cawan petri. 2. Tuangkan 15-20 ml mediaBGA (Bismuth Green Agar) atau XLD (Xylose Lysine Deoxycholate). 3. Cawan petri segera digoyang dan diputar sedemikian rupa hingga suspens tersebar merata. 4. Cawan diinkubasi pada suhu 35-37oC selama 24-46 jam dengan posisi terbalik. Setelah itu jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung. Uji Candida Albiccans 1. Buat media LB cair (Luria-Bertani) dengan melarutkan 1,0 g bacto tryptone, 0,5 g bacto yeast dan 1,0 g NaCl kedalam 100 ml aquadesr. Larutkan kemudian disterilisasi dengan autoklaf selama 30 menit. 2. Pipet 1 ml sampel kedalam 15-20 ml media LB . 3. Cawan petri segera digoyang dan diputar sedemikian rupa hingga suspens tersebar merata.

4. Cawan diinkubasi pada suhu 35-37oC selama 48 jam dengan posisi terbalik. Setelah itu jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung. Staphylocccus Aureus dan Pseudomonas Aeruginosa 1. Ke dalam 10 g atau 10 ml sampel ditambahkan medium Fluid Soybean Casein Digest sampai 100 ml, dicampur dan diinkubasi selam 24 jam pada suhu 32,5oC 2.5oC. 2. Apabila ada pertumbuhan, sebanyak satu ose suspensi koloni digesekkan pada permukaan medium Manitol Salt Agar (MSA) dan Centrimide Agar (CETA) dalam petri, masing-masing untuk diidentifikasi Staphylocccus aureus dan pseudomonas aeruginosa. Petri ditutup dan dibungkus dalam kondisi terbalik serta diinkubasi pada suhu 32,5oC 2.5oC selama 48-72 jam. 3. Apabila tidak ada pertumbuhan, sampel dinyatakan bebas Staphylocccus Aureus dan Pseudomonas Aeruginosa. Apabila ada pertumbuhan koloni pada medium MSA dengan karakteristik warna kuning dan zona kuning, dilanjutkan dengan uji koagulase. Apabila dijumpai koloni dengan zona kehijauan pada medium CETA maka dilanjutkan dengan uji oksidase dan fluorosensi di bawah sinar ultra violet. Pada Staphylococcus Aureus dengan media selektif berupa MSA menghasilkan koloni cembung, warna kuning dan warna merah berubah menjadi jernih. 4. Uji koagulase dilakukan dengan cara memindahkan satu ose koloni yang dicurigai dari media MSA kedalam tabung yang berisi 0,5 ml plasma kelinci, diinkubasi dalam tangas air pada suhu 37o . pengamatan dilakukan setiap tiga jam selama 24 jam. Uji terhadap kontrol positif dan kontrol negatif dilakukan dengan cara yang sama secara simultan. Apabila tidak terjadi koagulasi, maka sampel dinyatakan bebas Staphylocccus Aureus. 5. Uji oksidase dilakukan dengan cara meltakkan kertas saring yang telah diimpregnasi dengan larutan NN-dimetil-p-fenilendiamin dihidroklorid 1% diatas permukaan koloni yang dicurigai pada media CETA. Apabila tidak terbentuk warna pink yang berubah menjadi biru dalam waktu 20-60 detik, sampel dinyatakan bebas Pseudomonas Aeruginosa. 6. Uji fluorosensi dan piosianin dilakukan dengan cara menggesekkan koloni yang dicurigai pada permukaan media Agar Pseudomonas F (APF) dan media agar Pseudomonas P (APP) dalam petri yang ditandai untuk dibagi menjadi 4 bagian (masing-masing dapat digesekkan koloni yang dicurigai secara terpisah). Petri ditutup dan dibungkus dalam kondisi terbalik serta diinkubasi pada suhu 35o 2o C selama tidak lebih dari 3 hari. Apabila pada media APF tidak dijumpai koloni berwarna kuning

kehijauan dan berfluorosensi kekuning-kuningan dibawah sinar UV, sedangkan pada media APP tidak dijumpai koloni berwarna hijau kebiruan serta berfluorosensi kebiruan dibawah sinar UV, maka sampel dinyatakan bebas Pseudomonas Aeruginosa. Untuk penegasan hasil uji sebanyak 1 g koloni yang berpigmen dari media APF dan APP masing-masing dimasukkan kedalam tabung reaksi, ditambah 1 ml air suling dan dikocok, kemudian ditambah 1 ml kloroform dan dikocok. Fluorosensi akan larut dalam air, dan tidak larut dalam kloroform, sedangkan piosianin larut dalam air dan larut dalam kloroform.