TECNICAS ANALITICAS PARA LA DETECCION DE GLUTEN EN ALIMENTOS I.

RESUMEN Las personas celiacas sufren de intolerancia al gluten, conjunto de protenas presentes en el trigo, la cebada, el centeno y la aveca. La esxposcion de los celiacos a estas protenas ocasiona atrofia en las vellosidades intestinales y una absorcin inadecuada de los nutrientes de los alimentos. El tratamiento de esta enfermedad consiste en suprimir el gluten de la dieta de por vida. El gluten esta presente en los productos elaborados con los cereales mencionados previamente, pero tambin en muchos otros alimentos donde es utilizado como espesante para dar textura a ciertos alimentos, como fuente de protenas vegetales, como sustituto de las protenas animales para reducir costos, etc. La legislacin europea actual obliga a incluir en la lista de ingredientes de un alimento la presencia del gluten en su produccin, as como la presencia de otros alrgenos conocidos (lactosa, protenas de huevo, etc). Las tcnicas analticas de deteccin de gluten son las herramientas con las que cuentan las asociaciones de celiacos para la industria agroalimentaria para realizar un control de la presencia de gluten en los alimentos. La deteccin de gluten presenta ciertas complicaciones y actualmente se investiga sobre las modificaciones que sufren el gluten durante la elaboracin de los productos alimenticios y la deteccin final de sus fragmentos txicos, con el objetivo de mejorar los mtodos de deteccin. Aproximadamente una de cada 100 personas sufre esta enfermedad, aunque no todo los afectados desarrollan los sntomas, lo que dificulta el diagnostico. Las asociaciones de celiacos asesoran sobre la dieta sin gluten y el manejo de la enfermedad, y son de gran ayuda para la superacin de los problemas sociales, profesionales y psiclogos, que conlleva el mantenimiento estricto de una dieta sin gluten de por vida. Solo en la asociacin de Madrid, ingresan mas de 700 nuevos socios por ao.

II.

INTRODUCCION La enfermedad celiaca (EC) es una patologa gastrointestinal de origen autoinmune que consiste en una intolerancia permanente al gluten. El gluten es un conjunto de protenas vegetales de reserva presentes en los cereales. Las protenas toxicas para los pacientes celiacos son protena del gluten denominadas prolaminas (fracciones del gluten solubles en alcohol), que se encuentran en el trigo, la cebada el centenos y la avena. Las prolaminas, reciben un nombre diferente dependiendo del cereal del que procedan: gliadinas (trigo), hordeinas (cebada), secalinas (centeno), aveninas (avena). Existen dudas en cuanto a la toxicidad de la avena, ya que este cereal tiene un contenido de prolamina inferior al de los cereales antes mencionados. Es deseable, por tanto, la ampliacin del conocimiento en cuanto a la posible toxicidad de la avena.

Por otro lado, estudios recientes tambin confirman que las gluteninas ( fracciones del gluten insolubles en alcohol) son toxicas para los celiacos. La ingesta de gluten por el enfermo celiaco provoca una lesin progresiva de las vellosidades intestinales, cuya consecuencia mas importante es la disminucin de la absorcin de nutrientes. La sintomatologa abdominal, vomitos, dolor abdominal recurrente, cambios de carcter, falta de apetito, anemia y retraso del crecimiento en nios. Sin embargo, los sntomas pueden estar ausente, lo que dificulta el diagnostico. Aproximadamente una de cada cien personas padecen de esta enfermedad, siendo la enfermedad crnica intestinal mas frecuente en espaa. Su base gentica justifica que puede haber ms de un paciente celiaco dentro de una misma familia. Se puede presentar tanto en nios como en adultos y es dos veces mas frecuente en el sexo femenino que en el masculino. Solo una de cada siete personas afectadas presenta los sntomas mencionados, mientras las seis restantes no presentan sntoma aparente alguno pero si una lesin de las vellosidades. Este estado silente de la enfermedad puede hacer que el diagnostico se retrase y que aparezcan complicaciones, ya que el riesgo de desarrollar enfermedades autoinmunes (diabetes, tiroiditis, artritis reumatoide, ect.) y/o linfoma aumenta con el tiempo de exposicin al gluten Mediante un examen clnico cuidadoso y una analtica de sangre, que incluya los marcadores serolgicos de enfermedad celiaca (anticuerpos antitransglutaminasa tisular) se establece el diagnostico de sospecha de la enfermedad. El conocimiento reciente de diferentes formas clnicas de enfermedad celiaca (clsica, atpica, silente, latente, potencial, etc.), ha venido a demostrar que no siempre se puede establecer un diagnostico clnico o funcional de la enfermedad celiaca. Por ellos, para el diagnostico de certeza de la enfermedad celiaca es imprescindible realizar una biopsia intestinal. Para realizar esta prueba es necesario que no se haya retirado el gluten de la dieta. } Una vez diagnostica la enfermedad, el tratamiento consiste en seguir una dieta estricta sin gluten de manera permanente. Con este tratamiento se repara la mucosa intestinal y los sntomas desaparecen. En la actualidad se investiga sobre otros tratamientos muy prometedores, pero el nico existente hoy di es el seguimiento de la dieta exenta de gluten. Por el motivo, los mtodos de deteccin de gluten en los alimentos constituyen una herramienta bsica para el control de la enfermedad.

III.

FUNDAMENTO TEORICO EXTRACION Y DETECION DE GLUTEN EN ALIMENTOS El consumo de productos manufacturados conlleva asumir riesgos potenciales a los que los pacientes celiacos, ya que el gluten puede ser aadido a un producto como ingrediente, activo, o bien este puede contenerlo por razones tecnolgicas del proceso de fabricacin. Po lo tanto el gluten puede estar presente no solo en los productos elaborados a partir de las harinas de trigo, cebada, centeno y avena, como pan, pastas, pasteles y galletas, sino tambin en embutidos y derivados crnicos, salsas, aperitivos, como golosinas, comidas preparadas, etc, e , incluso , en ciertos medicamentos. El proceso competo de la cuantificacin del gluten presente en un alimento puede resumirse en el esquema de la firgura 1. Una de las etapas criticas es la extraccin del gluten del alimento. Durante el proceso de elaboracin, los alimentos se someten a tratamientos trmicos y a otros procesos que pueden modificar la estructura del gluten. Esta modificacin y la heterogeneidad de los alimentos suponen una barrera para la correcta extraccin del gluten de los alimentos

IV.

OBEJTIVOS Analizar las tcnicas idneas para la deteccin de gluten en los alimentos Comprobar la utilizacin de las enzimas en las tcnicas comentadas en la investigacin realizada MATERIALES Y METODOS 1. ENSAYO INMUNOENZIMATICO ELISA a. Tcnica de ELISA b. Tipos de ensayos de ELISA: -Ensayo tipo sndwich -Ensayos competitivos c. Otros mtodos para la deteccin de gluten -Mtodo de Skerrit

V.

-Mtodo basado en el anticuerpo R5 -Mtodo Skerrit y Hill MATERIAL Y EQUIPO Tubos de ensayo Microceldas Placas Balanza analtica Ensayo inmunoenzimatico ELISA Espectrofotmetro ELISA tipo sndwich Lector LISA Incubadora REACTIVOS Catalizador (enzima)

2. TECNICA DE PCR MATERIAL Y REACTIVO PCR cuantitativo Fragmento presente en gliadinas, secalinas, etc para detectarse ADN.

3. BIOSENSORES Y LAB-ON-A-CHIP MATERIALES Y EQUIPO Biosensor Elemento de reconocimiento biolgico(ac. Nucleico, enzima, anticuerpo) Capilares microscpicos.

4. Tiras inmunocromatograficas MATERIAL Y EQUIPO Tiras inmunocromatograficas Balanza Tubos de ensayo OBJETIVO GENERAL Disear y desarrollar un producto de panificacin que cumpla con las caractersticas sensoriales y nutritivas destinado a personas con enfermedad celiaca.

1. ENSAYO INMUNOENZIMATICO ELISA La tcnica ELISA consiste en un ensayo basado en el principio inmunolgico del reconocimiento y unin de los Anticuerpos a las molculas que reconocen como extraas (antgenos). En el caso de la deteccin de gluten se utilizan anticuerpos que reconocen fragmentos presentes en las protenas del gluten (antgeno). Existen distintos tipos de ensayos ELISA, siendo los ms utilizados en la deteccin de gluten los ensayos tipo sandwich y los ensayos competitivos. En el ELISA tipo sndwich se utilizan dos anticuerpos, el anticuerpo primario y el anticuerpo secundario, unido a la enzima. En este ensayo se establece la unin directa del gluten a los dos anticuerpos, quedando el antgeno atrapado entre ambos (ver Figura 2). En el ELISA competitivo se incuba la muestra con el anticuerpo para despus aadir esta preparacin sobre una superficie recubierta de antgeno (por ejemplo, gliadinas de trigo) de tal forma que se une a la superficie el anticuerpo libre no unido al gluten de la muestra. Finalmente se detecta la cantidad de anticuerpo libre; cuanto ms anticuerpo libre es detectado, menos cantidad de gluten contiene la muestra. Para la deteccin de gluten se han propuesto distintos anticuerpos y mtodos de deteccin. A continuacin se tratar el mtodo de Skerrit y el mtodo basado en el anticuerpo R5. El mtodo propuesto por Skerrit y Hill se valida de acuerdo a la sensibilidad original de este mtodo y optimiza hasta conseguir sensibilidades de 20 ppm. El mtodo detecta prolaminas del trigo y centeno resistentes a alta temperatura, que pueden ser extradas del alimento despus de ser cocinadas sin perder su capacidad de unin al anticuerpo. El mtodo propuesto por el grupo del Dr. Mndez (CNB-CSIC, Madrid) est basado en el anticuerpo R5, que reconoce un fragmento de 5 aminocidos ampliamente repetido en el gluten. Este mtodo permite la deteccin de gluten de trigo, centeno y cebada, incluso despus del tratamiento de los alimentos con calor. Para detectar gluten de avena, el mismo grupo ha desarrollado un ensayo ELISA especfico para avena. La sensibilidad de este mtodo es de 3 ppm de gluten, siendo por ello particularmente apropiado para el anlisis de gluten en el intervalo de baja concentracin (20-200 ppm).

Puntos fuertes Simple en su realizacin. Rapidez: tiempo medio del ensayo ELISA en placa de, aproximadamente, 2 horas. Econmico, verstil y robusto. Alta sensibilidad (3 ppm de gluten). La deteccin se realiza por medio de dispositivos pticos. No produce reacciones cruzadas frente a prolaminas no txicas de maz o arroz. Puntos dbiles Pueden producirse falsos negativos cuando se desnaturalizan las protenas por cambios de presin, temperatura o concentracin de sales. Posibilidad de reacciones cruzadas entre protenas estrechamente relacionadas . TENICA DE PCR La Tecnologa de PCR o reaccin en cadena de la polimerasa consiste en la obtencin de mltiples copias de un fragmento especfico de cido desoxirribonucleico (ADN) situado entre regiones de secuencia conocida a partir de una muestra compleja de ADN. Mediante PCR se puede detectar gluten de manera indirecta. Esta tcnica detecta el ADN responsable de la sntesis de las protenas del gluten, proceso conocido como expresin gnica y que constituye la base del funcionamiento de todos los seres vivos. Si en el diseo del ensayo PCR se utiliza un fragmento presente en gliadinas, secalinas, hordenas y aveninas puede detectarse el ADN de todos los cereales con prolaminas txicas. TECNICAS CROMATOGRAFICAS La cromatografa es un mtodo fsico de separacin, en el que los componentes se distribuyen en dos fases, la fase mvil y la estacionaria. El anlisis de muestras alimentarias puede realizarse mediante cromatografa lquida, en la que la fase mvil es un lquido, por tanto los componentes de la muestra deben ser solubles en ese lquido. Las especies separadas se pueden caracterizar mediante los detectores apropiados. Mediante cromatografa se puede detectar la presencia en alimentos de pptidos y protenas en general y de gluten en particular y se puede tambin cuantificar su concentracin. La separacin puede realizarse en funcin de la carga, el tamao, la hidrofobicidad.

Puntos fuertes Gran capacidad para la separacin de distintos pptidos. Puntos dbiles Se requiere mucho tiempo para el anlisis. Difcil de automatizar para muchas muestras. BIOSENSORES Y LAB-ON-A-CHIP Un biosensor es un dispositivo compacto de anlisis que incorpora un elemento de reconocimiento biolgico (cido nucleico, enzima, anticuerpo) asociado a un sistema que procesa la seal producida por la interaccin entre el elemento de reconocimiento y la muestra. Los biosensores pueden reconocer la presencia, actividad o concentracin de una molcula biolgica. Esta tecnologa de anlisis est en desarrollo para su aplicacin en la deteccin de gluten respondiendo a la creciente demanda de las empresas alimentarias de desarrollar nuevos mtodos de deteccin de gluten ms rpidos y baratos. Son tecnologas que pueden integrarse en los procesos de produccin de las empresas de alimentacin. Los lab-on-a-chip integran varias funciones en un mismo dispositivo, convirtindose en autnticos laboratorios en un chip. La tecnologa subyacente en estos dispositivos es la tecnologa microfludica, que estudia la manera de controlar y manipular con precisin volmenes de fluidos en la escala del microlitro y nanolitro. Mediante distintos fenmenos de presin, magnetismo, etc. se consigue mover la muestra por canales y capilares microscpicos. En el anlisis de gluten estos dispositivos aportan muchas ventajas, por ejemplo, se integra la extraccin y deteccin del gluten con un tiempo total de anlisis que no supera los 15 minutos.

Puntos fuertes Extraccin y deteccin de gluten integrada en el dispositivo. Extraccin y deteccin se llevan a cabo en pocos minutos. Dispositivo desechable y porttil. Manejo sencillo. Automatizables y miniaturizables. Pueden ser implantados en las empresas productoras. Puntos dbiles Al ser desechables, se Positivo puede realizar un solo anlisis por dispositivo. Alto coste. TIRAS INMUNOCROMATOGRAFICAS La deteccin de gluten mediante tiras inmunocromatogrficas es un mtodo muy sencillo y rpido, similar a los test de embarazo. El gluten debe extraerse de la muestra de alimento utilizando una disolucin de extraccin. Despus de la extraccin, la muestra se aplica sobre la tira, donde se encuentran los anticuerpos que reconocen el gluten unidos a esferas coloreadas de ltex. El gluten unido a estos anticuerpos se desplaza a travs de la tira en un proceso cromatogrfico de separacin. Finalmente, el gluten y el anticuerpo unido se inmovilizan en una regin de la tira, donde se puede detectar la presencia del gluten como una banda coloreada. Las tiras permiten detectar el gluten sin necesitar complejo material de laboratorio, de tal manera que las empresas que disponen de laboratorio con pequeas infraestructuras para tratamiento de muestras pueden realizar el anlisis fcilmente. La deteccin ofrece un resultado positivo o negativo para el gluten pero no permite conocer su concentracin.
Negativo

2. INTERPRETACION DE RESULTADOS El ensayo inmunoenzimtico ELISA. Es de ms rpido y practico de realizar, ya que es ms econmico y verstil. Tambin por su alta sensibilidad este es de gran precisin y no produce reacciones cruzadas frente a prolaminas. Pero entre sus desventajas se encuentra el hecho que puede producir negativos falsos cuando se desnaturalizan protenas. Y la posibilidad de reacciones cruzadas entre protenas relacionadas. Tcnica PCR. Una gran ventaja es su alta sensibilidad, pudiendo identificar la especie de origen del gluten, lo que sirve para detectar el origen de una contaminacin cruzada. Y el ADN es menos susceptible a sufrir una degradacin durante los procesos. Sin embargo este mtodo requiere ms tiempo y un personal cualificado para este anlisis. Y es una tcnica indirecta para la deteccin de gluten, ya que solo cuantifica el ADN que codifica para el gluten. Tcnicas cromatogrficas. Pueden separar una gran cantidad de distintos pptidos entre otros componentes. Pero esta tcnica requiere mucho tiempo para los anlisis, y se presenta una gran dificultad si se trata de automatizar para el anlisis de muchas muestras. Biosensores y lab-on-a-chip. El dispositivo tiene integrado la extraccin y deteccin del gluten por lo que se lleva a cabo en pocos minutos, este dispositivo a la ves es compacto y desechable, de fcil manejo y automtico. Sin embargo al ser desechable, cada dispositivo solo puede realizar un solo anlisis, por lo implica un alto coste. Tiras inmunocromatogrficas. Es el mtodo ms simple, rpido de todos y se califica a simple vista. Sin embargo no nos permite saber la concentracin de gluten de la muestra 3. APORTES

4. CONCLUSIONES

Los enfermos celacos sufren intolerancia al gluten, protena vegetal presente en algunos cereales como trigo, cebada, centeno y, posiblemente, avena. El nico tratamiento disponible para estos enfermos es una dieta sin gluten de por vida que revierte los sntomas de la enfermedad. El gluten est presente en los alimentos elaborados con estos cereales pero tambin forma parte de muchos otros alimentos, e incluso medicamentos, donde esta protena cumple funciones diversas, espesante, fuente de protena vegetal, etc. Adems, puede aparecer en ciertos alimentos simplemente por contaminacin cruzada. Debido a ello, es importante el desarrollo y la mejora continua de las tcnicas analticas para la deteccin de esta protena en los alimentos, que ofrecen un servicio bsico a las empresas alimentarias, asociaciones de celacos y a los propios pacientes. La tcnica de deteccin idnea es aquella que presenta una alta sensibilidad, selectividad y fiabilidad. A lo largo del presente informe se ha realizado una descripcin de las principales tcnicas utilizadas, hoy en da, para la deteccin del gluten. Tambin se han analizado otras tcnicas que se encuentran en fase de desarrollo y son muy prometedoras. Se ha realizado un anlisis de los retos y perspectivas de la deteccin del gluten en alimentos, a la vez que se ha incluido informacin acerca del diagnstico y la terapia de la enfermedad celaca. En los anexos del informe se encontrar informacin relativa al entorno cientfico, tecnolgico y empresarial implicado en la deteccin de gluten y estudio de la enfermedad celaca. El entorno cientfico en Espaa, en este campo, cuenta con grupos de referencia en el desarrollo de mtodos de deteccin de gluten. Varios equipos de investigacin espaoles centran su investigacin en otros aspectos relacionados con el gluten y la enfermedad celaca, como el estudio de la gentica de la enfermedad, investigacin de organismos probiticos para restablecer el equilibrio intestinal, mejora gentica de cereales y desarrollo de nuevos productos de panificacin sin gluten. Toda la informacin relativa a las patentes detectadas ms relevantes en distintas reas, como la deteccin y extraccin del gluten y el diagnstico y la terapia de la enfermedad celaca se presenta en el anexo III. El anlisis de esta informacin permite concluir que las solicitudes de tecnologas relacionadas con la deteccin de gluten estn, mayoritariamente, basadas en la utilizacin de anticuerpos anti-gliadina. No obstante, una solicitud de la Universidad de Leipzig, en Alemania, describe pptidos cortos con capacidad de unin a la gliadina que pueden ser utilizados para la deteccin de gluten como alternativa a los anticuerpos.

La inhibicin de la enzima transglutaminasa ha originado la solicitud de diversas patentes sobre compuestos inhibidores de esta enzima y tambin sobre el uso de pptidos que pueden ser modificados por la enzima como tratamiento para la enfermedad. Los pptidos asociados a los receptores de las clulas T del sistema inmune, pptidos de unin a la prolamina, tambin han sido propuestos como terapia. De la Universidad de Stanford en Estados Unidos proviene una solicitud que reivindica el efecto de una enzima prolil endopeptidasa en la degradacin de pptidos txicos del gluten. La enzima podra ser administrada oralmente para atenuar la toxicidad del gluten en el paciente. Por ltimo, en el anexo IV se recopila la informacin de varias empresas facilitando los servicios que prestan y los productos que comercializan. Dentro de esta relacin de empresas figuran varios de los laboratorios de anlisis autorizados por la Federacin de Asociaciones de Celacos de Espaa (F.A.C.E). Esta Federacin gestiona la marca de garanta Controlado por F.A.C.E. Los productos acreditados con esta marca de garanta pueden contener como mximo

20 ppm de gluten. Otras empresas, que figuran en el citado anexo, ofrecen otros servicios o productos, como la comercializacin de reactivos, kits y tiras de deteccin de gluten. 5. BIBLIOGRAFIA 6. La dieta sin gluten . abril del 2013 [en lnea]. http://www.infoalimentacion.com/documentos/la_dieta_sin_gluten.htm 7. ANEXOS