KROMATOGRAFI CAIR-CAIR

Cair-cair kromatografi adalah pemisahan kromatografi teknik di mana fase gerak adalah cairan (biasanya pelarut atau campuran biner sederhana pelarut) dan fase diam juga cair (yang harus larut dan tidak larut dalam cairan fase gerak). Fase diam cair didukung pada beberapa bahan yang cocok seperti tanah diatom atau di bawah gel silika keadaan tertentu. Sistem ini secara inheren tidak stabil, sebagai fase diam akan selalu memiliki beberapa kelarutan dalam fase gerak dan, sebagai akibatnya, akhirnya akan dilucuti dari dukungan. Sistem cair-cair pertama dilaporkan oleh AJP Martin yang menggunakan air didukung pada silika gel sebagai fase diam dan n-heptana sebagai fase gerak. Untuk menghindari ketidakstabilan cair-cair sistem, fase terikat dikembangkan yang secara ketat cair-padat sistem, tetapi sebagai gugus terikat sangat besar, berperilaku sangat mirip dengan cair-cair sistem. Sebagai isoterm serapan dari cair-cair sistem yang linier sampai dengan konsentrasi zat terlarut yang relatif tinggi, beban yang relatif besar dapat diterapkan untuk cair-cair kolom. Cair-cair sistem, dengan demikian, tidak umum digunakan dalam kromatografi cair yang modern. Fase diam merupakan cairan (lebih baru-baru ini bonded phase) yang dilapiskan pada patana inert (bahan pendukung). Bahan terlarut ditambahkan ke dalam sistem yang mengandung dua pelarut yang tidak dapat dicampur dan memenuhi keseimbangan

Konstanta Partisi dihubungkan pada rasio partisi k via volume tiap fase oleh persamaan

FASE GERAK UNTUK KROMATOGRAFI CAIR

Sifat-sifat berikut diperlukan untuk fase gerak dalam Kromatografi Cair.

A. Solven (pelarut) harus siap tersedia

B. Pelarut harus sesuai dengan detektor yang digunakkan. Denganmempertimbangkan : - Deteksi Photometric UV - Deteksi Refractive Index |R| pelarut dan analit - Ketidakmurnian yang memiliki extinction coeffisient tinggi, yaitu mengabsorbsidengat kuat. C. Reaktivitas Pelarut. Pelarut sbaiknya tidak bereaksi dengan sampel ataupolymerisasi dengan fase diam. Hal ini meniadakan aldehid, olefin dansenyawa sulphur (kecuali DMSO) ( misal pH kontrol untuk kolom basa silikaantara 2-8) D. Pelarut sebaiknya tidak terlalu kental. Viskositas tinggi (menimbulkantekanan operasional) mengurangi efisiensi pemisahan. Tiik didih dapt menjadipetunjuk viskositas, senyawa dengan titik didih yang rendah lebih kurangkental. Pelarut sebaiknya mendidih pada 200-500 diatas temperatur pemisahane. E. Untuk Kromatografi Cair Partisi dengan fase diam mekanik, fase gerak harustidak dapat dicampur dengan fase diam. F. Keamanan dalam penggunaan pelarut harus dipertimbagkan terutamakemungkinan timbulnya pembakaran atau keracunan.

HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY) Hplc (high performance liquid chromatography) atau biasa juga disebut dengan Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik. SISTEM PERALATAN HPLC Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut(1). Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.4). Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-

pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.2)

2. Pompa Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.6)

3. Tempat penyuntikan sampel Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.

Posisi pada saat memuat sampel

Posisi pada saat menyuntik sampel

4. Kolom dan Fase diam Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 l/menit).

Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.3]

Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).

Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain. Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.

5. Detektor HPLC Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UVVis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut: 1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel. 2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil. 3. Stabil dalam pengopersiannya. 4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita. 5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier). 6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.2) Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik detektor seperti berikut : Detektor Sensitifitas Kisaran (g/ml) Absorbansi Uvvis Fotometer filter 5 x 10-10 5 x 10-10 104 105 105 Sensitivitas bagus, paling sering digunakan, selektif terhadap gugus-gugus dan struktur-struktur tidak jenuh. 10-12 104 yang linier Karakteristik

Spektrofotometer > 2 x 10-10 spektrometer photo-diode array Fluoresensi

Sensitifitas sangat bagus, selektif, Tidak peka

terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak. Indeks bias 5 x 10-7 104 Hampir bersifat universal akan tetapi sensitivitasnya sedang. Sangat sensitif

terhadap suhu, dan tidak dapat digunakan pada

elusi bergradien Elektrokimia Konduktimetri 10-8 104 Peka terhadap perubahan

Amperometri

10-12

105

suhu dan kecepatan alir fase gerak, tidak dapat digunakan bergradien. mendeteksi pada elusi Hanya solut-solut

ionik. Sensitifitas sangat bagus, timbul adanya elektroda. selektif tetapi

masalah dengan kontaminasi