DASAR-DASAR PEMISAHAN KIMIA ANALISA

KROMATOGRAFI CAIR PADAT (LSC)

Kromatografi Cair Performa Tinggi

Kelompok 4

1. Muhammad Merlis 2. Muchlas Fedian S 3. Dwi Rati Ningrum

( 06101010017 )

4. Ravensky Yurianty Pratiwi

( 06101010016 )

( 06101010015 ) ( 06101010014 )

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN PROGRAM STUDI PENDIDIKAN KIMIA UNIVERSITAS SRIWIJAYA 2012

A. Pengertian Istilah Kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak ke bawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett adalah orang yang diakui sebagai penemu dan yang pertama menjelaskan mengenai kromatrografi. Penyelidikan tentang kromatografi sempat menurun beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC). Kemudian pada permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai berkembang. Dasar mengenai kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian dierbaiki oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya terbaik diperoleh oeleh Martin dan Synge pada tahun 1941 (sehingga mereka memenangkan penghargaan berupa Nobel). Kromatografi cair kolom klasik merupakan prosedur

pemisahan yang sudah mapan, dimana fase cair mengalir perlahan-lahan melewati kolom akibat adanya gaya gravitasi, pada saat itu terjadi proses pemisahan di kolom tersebut. Metode itu memiiki efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian terhadap teknik kolom cair kembali dilirik dengan dikembangkannya sistem kolom bertekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang mampu bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000p.s.i). Pada metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel pendukung berukuran sekitar 30 nm dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) dari pada dengan kromatografi cair yang biasa (Bassett et. all., 1994). High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Tekanan atau Kinerja Tinggi telah berhasil dikembangkan. Kemajuan dalam instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya. Tentu saja, saat ini dengan teknik yang sudah matang dan dengan cepat HPLC mencapai suatu alat kromatografi yang sederajat dengan kromatografi gas (Putra, 2004). Umumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion adalah contoh-contoh dari kromatografi kolom. Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas dengan bermacam diameter. Partikel dengan dimensi yang bervariasi

digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase gerak yang seragam. Secara keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 nm; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi (Khopkar, 2003). HPLC telah digunakan di Indonesia sejak tahun 1997 oleh Wiadnyana dalam penelitiannya yang bertema menguji dan menentukan kadar toksisitas berbagai macam fitoplankton di perairan laut. Selain digunakan untuk uji toksisitas, dalam bidang

Biokimia HPLC kerap digunakan untuk menghitung kadar vitamin dan protein dari suatu makanan atau sampel. Singkatnya, HPLC merupakan sebuah metode analisa modern yang multifungsi dan sudah ada di Negara kita Indonesia. B. Komponen-Komponen Penting Dari HPLC

Gambar 1. Rangkaian Instrumen HPLC 1. Pompa (Pump) Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu pompa kinerja konstan (constant pressure) dan pompa pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa

reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating), oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar

(base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapa aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas. Syarat syarat pompa yang ideal: a. Mampu membangkitkan tekanan tinggi b. Pulse free out put c. Control laju alir yang akurat d. Tahan korosi e. Terbuat dari bahan yang tahan terhadap fasa gerak f. Bebas pulsa (gerak) g. Perlu de gasser h. Dapat menyalurkan fasa gerak pada rentang kecepatan dan tekanan lebar i. Dapat digunakan untuk melakukan elusi gradien j. Dapat bekerja pada tekanan sampai 6000 psi (400 atm) 2. Detektor (Detector) Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif). Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh. Detektor pada HPLC yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV. Detektor-detektor lainnya antara lain: Detektor Fluorometer - Detektor Spektrofotometer Massa Detektor lonisasi nyala - Detektor Refraksi lndeks Detektor Elektrokimia - Detektor Reaksi Kimia

Gambar 2. Detektor UV 3. Injektor (injector) Injektor merupakan tempat untuk memasukkkan sempel ke kolom. Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan

sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada: tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut) kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel) komposisi yang tepat dari pelarut temperatur pada kolom 1. Elusi Gradien Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari senyawasenyawa yang tertahan kuat pada kolom. Dasar- dasar elusi gradien dijelaskan oleh Snyder. Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan : a. Total waktu analisis dapat direduksi b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing) d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak

4. Kolom (Column) Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom HPLC dapat digunakan kembali (reusable). Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan.

Kolom diisi dengan partikel padatan yang berukuran kecil dilapisi secara kimia oleh suatu cairan yang berfungsi sebagai fasa diam. Komponen-komponen sample dibawa oleh cairan fasa gerak yang dialirkan dengan bantuan tekanan tinggi melewati kolom fasa diam. Komponen- komponen dipisahkan berdasarkan partisi antara fasa diam dan fasa gerak yang satu sama lain tidak bercampur. Efisiensi kolom salah satunya sangat tergantung dari besarnya partikel fase stasioner. Oleh karena itu bila ukuran fase stasioner lebih kecil, maka tinggi plat teoritik akan berkurang, sehingga jumlah plat teoritik akan bertambah, yang meningkatkan efisiensi kolom. Dengan efisiensi, pemisahan akan berjalan dengan cepat. Terdapat banyak analisis yang dikerjakan pada suhu kamar, suhu kolom sering dapat diatur dengan konstan dengan memakai cara pemanasan. Sering dibutuhkan suhu kolom yang lebih tinggi dari suhu kamar untuk mengatasi masalah daya larut solute yang dianalisis dan viskositas fase gerak yang agak tinggi. 5. Pengolahan Data (Data Handling) Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam bentuk kolom yang pendek dan

kromatogram pada rekorder. Waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui atau dihitung. Ini bisa digunakan untuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen, bila kondisi kerja dapat dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau proporsional dengan konsentrasi dan dapat digunakan untuk memperoleh hasil secara kuantitatif.

C. Prinsip Kerja HPLC Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan fase stasioner (diam). Fase mobilenya adalah sampel dan eluen yang bercampur, dan fase stasionernya adalah silika gel yang mengandung hidrokarbon. Sehingga senyawa yang memiliki kepolaran yang lebih tinggi akan tertahan pada fase stasioner yang bersifat polar. Mula-mula solven diambil melalui pompa Solven ini kemudian masuk ke dalam katup injeksi berputar, yang dipasang tepat pada sample loop. Dengan pertolongan mikrosiring, sample dimasukkan ke dalam sample loop yang kemudian bersama-sama

dengan solven masuk ke dalam kolom. Hasil pemisahan dideteksi oleh detektor yang ditampilkan oleh perekam/recorder. Tekanan solven diatur dengan pengatur dan pengukur tekanan. Pompa memasok solven pada tekanan konstan hingga tekanan 4500 psi dengan laju alir rendah, yakni beberapa milliliter per menit. Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menyerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama. Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana). Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahu berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil.

Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika anda mempunyai dua substansi yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y), dapatkah anda mengatakan jumlah relatifnya? Anda tidak dapat mengatakannya jika anda menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.

D. Teknik Pemisahan dengan HPLC Tehnik pemisahan dalam kromatografi melibatkan dua fasa, yakni fasa diam yaitu padat atau cairan yang terikat pada padatan pendukung, dan fasa gerak yang berupa gas dan cair. Proses pemisahan dalam kromatografi di dasarkan pada perbedaan laju migrasi masing- masing komponen dalam sistem kromatografi. Perbedaan laju migrasi dari masing-masing komponen merupakan akibat dari perbedaan keseimbangan distribusi masing-masing komponen diantara fasa gerak dan fasa diam. Metode kromatografi dibedakan dalam beberapa macam, berdasar pada fasa gerak, fasa diam, mekanisme, dan tehnik yang digunakan dan salah satu diantaranya adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC). Dalam kromatografi cair Kinerja tinggi ini fasa gerak yang digunakan berupa cairan, sedangkan fasa diamnya berupa padatan (silica gel) yang ditempatkan pada kolom tertutup (melekat secara kimia dalam kolom tersebut). Maksud dan tujuan analisis dengan kromatografi yaitu didapatnya pemisahan yang baik demikian halnya dalam HPLC diharapkan pemisahannya baik dan dalam waktu proses yang relative singkat. Untuk mencapai Tujuan analisis ini, maka dipilih pelarut pengembang yang sesuai dengan komponen yang dipisahkan, kolom yang digunakan juga harus diperhatikan, dan detector yang memadai. Parameter baik atau tidaknya suatu kromatografi didasarkan pada lima factor, yaitu waktu retensi, faktor kapasitas, efisiensi kolom, resolusi, dan factor ikutan. 1. Waktu retensi didefinisikan sebagai waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu komponen dari dalam kolom kromatografi sehingga yang keluar dari kolom adalah tepat konsentrasi maksimum. 2. Faktor kapasitas (k) juga merupakan ukuran retensi suatu komponen dalam kolom. Jika nilai k kecil, maka komponen tertahan sebentar dalam kolom. Dan jika nilai k yang lebih besar, maka pemisahan baik tetapi waktu yang dibutuhkan untuk analisis lebih lama dan dan puncaknya melebar. Sehingga ditentukanlah nilai k optimum, yaitu antara 1 sampai 10. Kolom dinyatakan baik jika cukup selektif artinya mampu menahan berbagai komponen dengan kekuatan yang cukup berbeda. Agar terjadi pemisahan yang baik maka nilai selektivitas () harus lebih besar daripada 1., dimana semakin besar

nilai maka pemisahannya akan semakin baik. Nilai dapat diubah-ubah dengan cara, mengubah fasa gerak (misal: memperbesar polaritas); mengubah fasa diam; mengubah temperature, karena pada umumnya kenaikan temperature akan memperkecil waktu retensi; dan mengubah bentuk komponen. 3. Efisiensi kolom merupakan kemampuan kolom mengeluarkan hasil yang diinginkan dengan hasil yang memuaskan dan dalam waktu yang singkat. 4. Keterpisahan antara dua puncak kromatogram dinyatakan dengan resolusi R (ukuran besar kecilnya pemisahan). Jika nilai R 1,5 maka senyawa terpisah dengan baik. 5. Sedangkan factor terikutan (Tf) merupakan ukuran kesimetrisan suatu puncak. Dengan catatan nilai Tf < 2,0. HPLC berkembang dari asas proses pemisahan adsorpsi dan partisi ke arah yang lebih luas, yaitu proses pemisahan yang berasaskan afinitas. Filtrasi gel dan ion yang berpasangan, akan tetapi proses pemisahannya tetap dilaksanakan di dalam kolom disertai pemakaian pelarut pengembang dengan tekanan tinggi (Ahmad dan Suherman, 1995). Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair cair yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar. Kegunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities); analisis senyawa- senyawa mudah menguap (volatile); penentuan molekul- molekul netral, ionic, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa- senyawa dengan jumlah sekelumit (trace elements), dalam jumlah yang banyak, dan dalam skala proses industry.

E. Kelebihan Dan Kekurangan Metode Analisis Dengan HPLC Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) atau High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. HPLC termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan

dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya. Kelebihan itu antara lain: 1. Mampu memisahkan molekul- molekul dari suatu campuran. 2. Mudah melaksanakannya. 3. Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi. 4. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis Resolusi yang baik. 5. Dapat digunakan bermacam- macam detektor. 6. Kolom dapat digunakan kembali. 7. Mudah melakukan "sample recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang dianalisis. 8. Dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas 9. Banyak pilihan fasa geraknya. 10. Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit

(uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai. 11. Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam. 12. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada HPLC memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan. 13. Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam HPLC dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacammacam zat. 14. Detektor- detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll, dapat juga digunakan dalam HPLC. 15. Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom HPLC dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang

bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan. 16. Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. HPLC dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat zat tersebut. 17. Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam HPLC tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detector. 18. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus. Sedangkan kekurangannya adalah: 1. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu. 2. Hanya bisa digunakan untuk asam organic. 3. Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi. 4. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas.

Sumber : Meilina Rizky Hadianti Blogspot ; Yanes Rampengan Blogspot