LAMPIRAN B LITERATUR

LB.1 Laporan Mikrobiologi Pewarnaan Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan asam. Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion

LB-9

yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif. Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna mempunyai muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan didinding sel, membran sel dan sitoplasma. Sewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas terlihat. Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif, pada metode ini mikroba dicampur dengan tinta cina atau nigrosin, kemudian digesekkan diatas kaca objek. Zat warna tidak akan mewarnai bakteri, akan tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri. Dengan mikroskop mikroba akan terlihat tidak berwarna dengan latar belakang hitam. Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh seorang ahli bioteknologi dari Denmark yang bernama Christian Gram pada tahun 1884. Ia menemukan metode pewarnaan secara tidak sengaja. dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negatif, yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. Pewarnaan itu merupakan tahap penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri. Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap, yaitu : a. Pemberian cat warna utama (cairan Kristal violet) berwarna ungu. b. Pengintensifan cat warna dengan penambahan larutan mordan. c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alcohol asam. d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

LB-9

Fiksasi dapat dilakukan dengan cara melewatkan preparat diatas api atau merendamnya dengan metanol. Fiksasi digunakan untuk : 1. Mengamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah diwarnai. 2. Melekatkan bakteri pada glass objek. 3. Mematikan bakteri (Wahyuni, 2012) LB.2 Pewarnaan Gram Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu : a. Fiksasi b. Peluntur warna c. Substrat d. Intensifikasi pewarnaan e. Penggunaan zat warna penutup Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies.

LB-9

Teknik pewarnaan pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu : a. Pengecatan sederhana b. Pengecatan negatif c. Pengecatan diferensial d. Pengecatan struktural Pemberian warna pada bakteri atau jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul (Rahman, 2010). LB.3 Uji Fisiologi Bakteri dengan Uji Biokimia Uji fisiologis biasanya identik dengan uji biokimia. Uji-uji biokimia yang biasanya dipakai dalam kegiatan identifikasi bakteri atau mikroorganisme yaitu antara lan uji koagulase, uji katalase, uji nitrit, hidrolisis gelatin, uji hidrogen sulfida (H2S) dan lain-lain. Pengujian biokimia merupakan salah satu hal yang sangat penting di dalam dunia mikrobiologi. Biokimia adalah ilmu mengenai dasar molekuler kehidupan. Tujuan utama dari biokimia adalah untuk mencari jawaban tentang bagaimana benda mati yang menyusun organisme hidup berinteraksi satu dengan yang lain untuk mempertahankan dan melangsungkan keadaan hidupnya. Biokimia telah menghasilkan konsep-konsep mendalami yang mengungkapkan sebagian dari misteri hidup serta berbagai aplikasi praktis dalam bidang kedokteran, pertanian, ilmu biji, dan industri. Melalui percobaan uji biokimia ini, praktikan dapat mengetahui beberapa teknik pengujian secara biokimia yang akan sangat membantu dalam pengidentifikasian mikroorganisme. Hasil yang diperoleh dalam

LB-9

percobaan selanjutnya akan dicocokan pada literatur (buku determinan), sehingga akan diketahui jenis dan nama dari mikroorganisme yang diuji tersebut berdasarkan rekasi-reaksi kimia yang ditimbulkannya dan apakah reaksi tersebut positif atau negatif. Biokimia adalah ilmu yang mengenal dasar molekuler kehidupan. Di seluruh dunia biokimia dianggap sangat menggairahkan kerena berbagai alasan; pertama, mekanisme kimia banyak sentral pada kehidupan kini mulai dipahami. Kedua, pola dan prinsif-prnsip molekular yang umum mendasri penampilan. Ketiga, biokimia sangat mendasari ilmu kedokteran. Keempat, perkembangan yang cepat. Biokimia adalah kimia dari bahan-bahan dan proses-proses yang terjadi dalam tubuh mahluk hidup, sebagai upaya untuk memahami proses kehidupan dari sisi kimia. Bertujuan untuk memahami interaksi molekul-molekul tak hidup yang menghasilkan fenomena kompleks dan efisien yang menjadi ciri-ciri kehidupan serta menjelaskan keseragaman kimia dari kehidupan yang beragam. Hal-hal yang dipelajari dalam biokimia adalah struktur kimia dan bentuk tiga dimensi molekul biologi, interaksi antar biomolekul, sintesis, dan degradasi biomolekul dalam sel, perolehan dan pemanfaatan energi oleh sel, mekanisme pengkoorganisasian biomolekul dan pengkoordinasian aktifitasnya, serta penyimpanan, pemindahan, dan ekspresi informasi genetika. Pengamatan aktivitas biokimia atau metabolisme mikroorganisme yang diketahui dari kemampuan mikroorganisme untuk menggunakan dan menguraikan molekul yang kompleks seperti karbohidrat, lemak, protein dan asam nukleat. Selain itu dilakukan pula pengamatan pada molekul-molekul sederhana seperti asam amino dan monosakarida. Dan hasil dari berbagai uji ini digunakan untuk perincian dan identifikasi mikroorganisme. Penggunaan zat hara tergantung dari aktivitas metabolisme mikroba. Metabolisme seringkali menghasilkan hasil sampingan yang dapat digunakan untuk identifikasi mikroorganisme. Pengamatan aktivitas metabolisme diketahui dari kemampuan mikroorganisme untuk menggunakan dan menguraikan molekul yang kompleks seperti zat pati, lemak, protein dan asam nukleat.

LB-9

Selain itu pengamatan juga dilakukan pada molekul yang sederhana seperti amino dan monosakarida. Berikut beberapa uji Biokimia yang digunakan untuk identifikasi bakteri antara lain: a. Indol Media ini biasanya digunakan dalam indetifikasi yang cepat. Hasil uji indol yang diperoleh negatif karena tidak terbentuk lapisan (cincin) berwarna merah muda pada permukaan biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk indol dari tryptopan sebagai sumber karbon, yang dapat diketahui dengan menambahkan larutan kovaks. Asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein. b. MR-VP 1. Uji MR dengan hasil positif, terjadi perubahan warna menjadi merah setelah ditambahkan methyl red. Artinya, bakteri ini mengahasilkan asam campuran (metilen glikon) dari proses fermentasi glukosa yang terkandung dalam medium MR-VP. Terbentuknya asam campuran pada media akan menurunkan pH sampai 5,0 atau kurang, oleh karena itu bila indikator metil ditambahkan pada biakan tersebut dengan pH serendah itu maka indikator tersebut menjadi merah. Hal ini menandakan bahwa bakteri ini peragi asam campuran. 2. Uji VP dengan hasil negatif, karena tidak terbentuk warna merah pada medium setelah ditambahkan -napthol dan KOH, artinya hasil akhir fermentasi bakteri ini bukan asetil metil karbinol (asetolin). Uji katalase merupakan suatu pengujian terhadap bakteri tertentu untuk mengetahui apakah bakteri tersebut merupakan bakteri aerob, anaerob fakultatif, atau anaerob obligat (Sandiatono, 2012).

LB-9

LB.4 Rhodospirillum rubrum Klasifikasi ilmiah: Kingdom: Bacteria Phylum: Proteobacteria Class: Alpha Proteobacteria Order: Rhodospirillales Family: Rhodospirillaceae Genus: Rhodospirillum Species: R. rubrum Gambar B.1 Bakteri Rhodospirillum rubrum (Amirin, 2011)

Rhodospirillum rubrum merupakan bakteri nitrogen , yaitu, dapat mengekspresikan dan mengatur nitrogenase , sebuah kompleks protein yang dapat mengkatalisis konversi atmosfer dinitrogen menjadi amonia. Rhodospirillum adalah genus bakteri fotosintetik dari Rhodospirillaceae keluarga. sel-sel mereka umumnya berbentuk spiral, polarly flagellated dan mengandung vesikuler, pipih membran fotosintesis ditumpuk (Singleton dan Sainbury). Mereka berkisar dari tiga sampai sepuluh mikrometer panjang dan satu-setengah sampai satu setengah mikrometer satu di lebar. Salah satu jenis spesies dari genus ini adalah Rhodospirillum rubrum, sebuah bakteri nonsulfur ungu. Bakteri ini berada di bawah pembagian Alpha kerajaan Proteobacteria. R. rubrum adalah bakteri gram negatif yang mengandung asam lemak tak jenuh dan jenuh. Utamanya karotenoid (pigmen) adalah rhodovibrin dan spirilloxanthin. Biotin merupakan faktor pertumbuhan yang diperlukan untuk R. rubrum serta konten GC adalah 63,8-65,8 persen. Rhodospirillum rubrum dan bakteri lainnya nonsulfur ungu dapat ditemukan dalam pengaturan alam seperti air kolam, lumpur atau sampel kotoran. ungu. bakteri nonsulfur phototrophic digunakan dalam proses pengolahan limbah, untuk produksi biomassa sebagai sumber makanan hewan atau pupuk pertanian, dan produksi hidrogen molekul oleh evolusi dari nitrogenase. Mereka dapat digunakan juga sebagai sumber-bebas sistem sel melakukan fotosintesis dan pembentukan ATP, dan untuk produksi vitamin dan molekul organik lainnya.

LB-9

a. Karakteristik (1) bakteri gram negatif (2) warna ungu - dari rhodovibrin pigmen cartenoid dan spirilloxanthin (3) bakteri nonsulfur - dapat menggunakan sulfida sebagai donor elektron untuk pengurangan karbon dioksida, tetapi tidak pada konsentrasi tinggi seperti bakteri sulfur (4) morfologi sel - sel berbentuk spiral (5) karbon dan energi metabolism - Tumbuh aerobik dengan oksigen (chemotroph) - Juga tumbuh anaerobik menggunakan lampu (phototroph) - Bisa tumbuh auto-dan heterotrophically (6) lokasi dan penggunaanya - Studi di tahan radiasi dan fiksasi nitrogen. - Ditemukan di lumpur, air kolam, dan sampel kotoran. - Digunakan untuk: - Pengolahan limbah proses. - Produksi biomasa. - Hewan makanan (ikan & ayam), pupuk pertanian. - Produksi hidrogen molekul (evolusi dari nitrogenase). - Melakukan fotosintesis dan pembentukan ATP. - Menghasilkan vitamin dan molekul organik lainnya. b. Struktur sel dan Metabolisme Rhodospirillum adalah bakteri Gram-negatif, motil, bakteri berbentuk spiral. Mereka dapat tumbuh di bawah berbagai jenis kondisi termasuk lingkungan aerobik atau anaerobik. Anaerobik, bakteri menggunakan fermentasi atau fotosintesis untuk menghasilkan energi serta pertumbuhan photoautotrophic. rubrum menggunakan MoFe dan hanya nitrogenase Fe (Amirin, 2011). LB.5 Amoeba Amoeba adalah makhluk mikroskopis yang terdiri dari satu sel (unicellular). Seperti sebagian besar sel tumbuhan dan sel hewan, sel amoeba

LB-9

juga memiliki sitoplasma (cytoplasm), nukleus (nucleus), membran sel (cell membrane) dan ectoplasm dan endoplasma (bagian dari sitoplasma). Menurut klasifikasi Protozoa berdasarkan alat geraknya, amoeba termasuk ke dalam kelas Rhizopoda atau Sarcodina (protozoa yang bergerak menggunakan Pseudopodia). CLASSIFICATION Domain : Eukaryota Kingdom : Protista Phylum : Tubulinea Order : Tubulinida Family : Amoebidae Genus : Amoeba Gambar B.2 Amoeba (Adam, 2012)

Beberapa jenis Amoeba bersifat patogen pada manusia (pathogenic to humans), menyebabkan penyakit seperti Amoebic Meningitis, tapi sebagian besar tidak membahayakan, hidup di sistem percernaan manusia atau hidup di kulit dan memakan sel-sel yang mati. Meskipun species Amoeba yang paling dikenal, Amoeba proteus hanya berdiameter sekitar 700 microns, lain hal dengan Amoeba dubia (Polychaos dubium) yang dapat mencapai ukuran diameter 0.039 inches (1 milimeter) yang dapat dilihat dengan mata telanjang tanpa bantuan mikroskop. Amoeba pertama kali ditemukan oleh August von Rosenhof pada tahun 1755, menggunakan mikroskop sederhana. GENERAL CHARACTERISTICS 1. 2. 3. 4. 5. Eukaryota Unicellular (bersel satu) Bergerak menggunakan Pseudopodia (kaki semu) yang merupakan julur-julur sitoplasma. Hidup bebas, di tanah atau tempat berair yang mengandung zat organik. Berkembang biak dengan cara pembelahan biner (binary fission) (Adam, 2012)

LB-9