Universidad Autnoma Metropolitana-Xochimilco

Ciencias Biolgicas y de la Salud Departamento de Sistemas Biolgicos

Carrera: Qumico Farmacutico Bilogo

Mdulo V: Obtencin de materias primas para la produccin de medicamentos

Proyecto de investigacin Aislamiento y extraccin del aceite esencial de Citrus sinensis y determinacin de la citotoxicidad en el modelo de Artemia salina

Equipo No. 1 Garca Bautista Natalia Garca Luis Claudia Hernndez Altamirano Gerardo Pea Rodrguez Zuri Sara 2112032856 2112031644 2113059557 2112032730

Profesor: M. en C. Israel Velzquez Martnez

Fecha de entrega: 1/03/2013

Introduccin La mayora de los aceites esenciales tienen muy baja toxicidad para el hombre, un ejemplo de ellos es el aceite esencial que se obtiene de la piel fresca de la naranja Citrus sinensis, el cual tiene un 90% de d- limoneno, citral, decilaldehdo, antranilato de metilo, linalool y terpineol. El aceite es utilizado como repelente de perros y gatos y algunos insectos, y como insecticida, en ornamentales y basureros. Comochamp para perros y gatos y el el hombre como repelente de insectos. El D-limoneno es uno de los monoterpenos ms comunes de la naturaleza. Posee un centro quiral, un carbono asimtrico, por lo que existen dos ismeros pticos: el D-limoneno y el L-limoneno. Sin embargo, el D-limoneno prevalece en el aceite esencial de la naranja dulce Citrus sinensis, por lo que su extraccin se realiz a travs de este. Los dobles enlaces que contienen los monoterpenos tienen una reactividad similar a la qumica de alquenos, por lo cual, se le aplicaron pruebas de identificacin tpicas de estos, entre las ms comunes se encuentran: bromo en tetracloruro de carbono y permanganato de potasio en frio siendo pruebas cualitativas que se determinan mediante cambios de color; as mismo se realiz una cromatoplaca con un revelador de vainillina/cido sulfrico para la determinacin de monoterpenos Otra finalidad de este trabajo es la determinacin de la DL50 del D-limoneno mediante el modelo de Artemia salina con un tiempo de exposicin de 24 horas. La dosis letal 50 fue calculada mediante el modelo estadstico de Reed-Muench

Antecedentes. La naranja es una fruta ctrica no climatrica comestible obtenida del naranjo dulce Citrus sinensis que se da en regiones de clima templado y hmedo entres sus nombres comunes se encuentra: naranja de la china, naranja portuguesa, naranja comn, naranja dulce, flor de azahar, naranja de cucho, naranja injertada, naranjo, naranjo dulce, palo naranjo. Oaxaca: tzon tende; Puebla: laxus (totonaco), pomfo (otom), xocot clavo (nahua); Quintana Roo: aal, ch'uhukpa, chujulpakal, pak'aaal (maya); San Luis Potos: lanash (tenek)1.

Clasificacin taxonmica Nombre cientfico: Citrus sinensis L. Reino: Divisin: Clase: Subclase: Orden: Familia: Gnero: Especie: Cuadro No.1 Botnica y ecologa. El rbol mide hasta 7 metros de altura, con los tallos verdes y espinosos. Las hojas tienen forma ovada, lisas por ambas caras, con apariencia de cuero; tienen el soporte que las une al tallo con pequeas alas angostas. Las flores pueden estar solitarias o agrupadas, son blancas y aromticas. Los frutos son grandes, cuando se encuentran maduros son redondos de color amarillo a anaranjado y jugosos. Plantae Magnoliophyta Magnoliopsida Rosidae Sapindales Rutaceae Citrus Citrus sinensis

Es una especie originaria de China al sureste de Asia, que habita en sitios con clima clido, semiclido, semiseco y templado. Comnmente cultivada en huertos familiares, con vegetacin circundante de bosque tropical caducifolio o perennifolio y bosque mesfilo de montaa. Etnobotnica y antropologa. En las Huasteca potosina y veracruzana se utiliza en ceremonias especiales, como la de ao nuevo. Se coloca en la mesa de la ofrenda y es portada por los participantes oficiales. Son las flores, con o sin hojas, preparadas en infusin y administradas por va oral, la forma de preparacin y tratamiento ms comnmente empleada. Se ocupa principalmente para bajar la calentura (Puebla y Tlaxcala), pero tambin con frecuencia, en desrdenes digestivos, para asentar el estmago despus de la purga, bilis, dolor de estmago, empacho, irritacin estomacal y falta de hambre. En este ltimo caso se ingiere la fruta o jugo, con agua o miel de abeja. Para las alteraciones del sistema nervioso, se hace una coccin con las flores solas o combinadas con flor de tila y de manita, la parte area del toronjil blanco y las ramas con hojas de hinojo. Debe endulzarse con miel de abeja; se toma tres veces al da durante ocho das. La coccin se debe hacer cada vez que se va a ingerir. De igual forma se usa contra el insomnio. Contra reumatismo fuerte y el acecido se recomienda el zumo. Colocndolo en una cucharita, se le agrega miel, se calienta y se toma tibio tres veces al da. Se aconseja aplicar el zumo contra la caspa y tomar el jugo tibio del fruto para la tos. En caso de latido, sntoma que se presenta cuando a alguien se le pasa la hora de comer (el paciente tiene el estmago duro, se le siente como una bola dura por encima del ombligo, siguiendo el pulso de la circulacin), se toma en ayunas un cocimiento de las hojas con canela (Cinnamomum zeylanicum), yema de huevo y alcohol de caa. El ataque o minique (nahua), que ocurre cuando se sube la presin a la cabeza repentinamente, es una enfermedad frecuente que los nahuas reconocen por los siguientes sntomas: se cierran los odos, hay convulsiones, duele la cabeza, el enfermo se atonta y se cae. Para preparar el remedio se ocupa un frasco con refino al que se le agrega jerez, flores de esta planta, de lima ( Citrus limetta), de limn (Citrus aurantifolia), de sidra (Citrus medica), de sempiterna (Gomphrenanitida), de rosa de Castilla (Rosa centifolia), de ans y de manita, nuez moscada, ramas de toronjil (Agastache mexicana) y de estafiate (Artemisia ludoviciana ssp. mexicana), raz de piona (Juncuseffusus), y hinojo

(Foeniculumvulgare). Se deja reposar por tres das y posteriormente se toma tres veces al da un "topo" o una copita chica antes de cada alimento. El enfermo debe consumir tres frascos del preparado. Otros padecimientos en que se menciona su uso medicinal son: alfereca de nios, catarro con tos, clicos, recadas, sofocamiento y asombro. Historia. A mediados del siglo XVIII, Ricardo Ossado en el Libro del Judo comenta: "El cogollo de sus hojas hecho en infusin, se bebe para curar los dolores clicos y las hojas estrujadas se usan entre el agua de bao de las mujeres paridas; su fruto comido con sal es muy bueno para las flemosidades". Posteriormente, en el siglo XX, Narciso Souza indica que la infusin de sus hojas es empleada como astringente. Qumica. El aceite esencial de la cscara del fruto de Citrus Sinensis contiene un 90% del monoterpeno D-limoneno, sin embargo tambin se han identificado los deltacadineno, citral, decilaldehdo, antranilato de metilo, linalool y terpineol y en un menor porcentaje los sesquiterpenos cariofileno, alfa-copaeno, beta-elemeno, notkatona, valenceno y sus epxidos2. En el siguiente cuadro se resume los metabolitos que se pueden encontrar en las diferentes partes del fruto. Parte de la naranja Citrus sinensis Metabolitos encontrados Flavonoides esperidium, naringn, naributn, neoesperidn-hidrochalcona, rutn y la 6-dimetoxi-cumarina; Alcaloides de isoquinolinasinefrina y nmetil-tiramina. Carotenoide beta-apo-8'-carotinol Flavonoides: heptametoxi-flavona, hesperidn y su glucsido, neoesperidn, narinjn y su glucsido, naributn, nobiletn, tetrametilescutelaren. sinensetn y langeretn. Monoterpenos 3-metil-butanol, limoneno y linalol.

Cscara

Jugo

Pulpa

Raz

Semillas. Corteza Flores Hojas Cuadro 22.

Sesquiterpeno valenceno. Carotenoides mono y diepoxi-caroteno, di-hidro-caroteno, beta-citraurn y mutatoxantn. Monoterpenos: limoneno, lindol, mirceno, alfa-pineno y sabineno. Sesquiterpeno valenceno Flavonoide ramnsido del 4-metil -terdihidro-camferol. Cumarinas brayln, oxigeranil-piranocumaril, ostol, sesetn, suberosn, xantoxiletn y xanfiletn Bencenoides: estragol,cido valncico Flavonoide: ciflavanona Triterpenos: limonn, nomiln, deacetilnomiln y obacunona Cumarinadimetoxi-cumarina, y escoparona. Alcaloide cafena Flavonoide rutn

El D-limoneno posee un centro quiral, concretamente un carbono asimtrico. Por lo tanto existen dos ismeros pticos: el D-limoneno y el L-limoneno. La nomenclatura IUPAC correcta es R-limoneno y S-limoneno, pero se emplean con ms frecuencia los prefijos D y L o alfa y beta. Propiedades fsicas y qumicas de limoneno (D-Limoneno, terpeno de naranja) Formula molecular Punto de inflamabilidad Punto de ebullicin Punto de fusin Masa molecular C10H16 50 C 176 C -75.2 C 136.24 g/mol

Densidad del limoneno Solubilidad en agua Solubilidad en metanol Cuadro 33. Farmacologa.

0.84 g/cm3 insoluble Soluble

El aceite esencial obtenido de la cscara del fruto ejerce una actividad antibitica contra las bacterias Bacillussubtilis, B. anthracis, B. mycoides, B. pumilus, Candida albicans, Escherichia coli, Salmonella paratyphi, Staphaylococcus aureus, Vibrio cholera y Pseudomona aeruginosa y el hongo Candida albicans. Tambin present un efecto carminativo al medir in vitro la actividad de reduccin de la espuma. Se ha demostrado que el jugo del fruto ejerce actividad contra el Polivirus I. 2 El pericaripio y tambin las hojas tienen una actividad venotnica y vasoprotectora; los principios amargos son responsables de su accin aperitiva y eupptica.1 Toxicidad. La relatividad txica del limoneno es de 0.34 y la DL 50 es de 1470ppm en un tiempo de exposicin de 6 hrs en el modelo de Artemia salina. Se ha demostrado que tiene baja toxicidad oral (LD50> 5g/kg) y baja toxicidad drmica (LD50> 5g/kg) cuando se prob en conejos. Tambin mostr una baja toxicidad por inhalacin (RD50> 1g/kg) cuando se prob en ratones. La capacidad de irritacin cutnea del D-limoneno en cobayas y conejos se considera moderada y baja respectivamente. La inhalacin puede causar irritacin en la nariz, garganta y tracto respiratorio. Este compuesto no est clasificado como carcingeno por la Occupational Safety and Health Administration (OSHA), International Agency for Research on Cancer (IARC), American Conference of Governmental Industrial Hygienists (ACGIH) o la National Toxicology Program (NTP) ya que no se ha demostrado que produzca cambios genticos en pruebas bacterianas o clulas animales ni contiene toxinas conocidas de reproduccin o desarrollo. La exposicin prolongada o repetida puede causar sequedad o dermatitis de la piel. El almacenamiento y la manipulacin inadecuada pueden conducir a la sensibilizacin de la piel.3

Biosntesis Los monoterpenos y en general todos los compuestos terpenoides naturales se biosintetizan por la ruta del acetilCoenzima A a travs de un intermedio comn que es el cido mevalnico.
Mevalonato

H3C OPOP

CH3

CH3

CH3

CH2

H3C

C CH3 H3C CH3 H3C

H H3C CH2

Geranil difosfato

Limoneno

Figura 1

Sntesis qumica

Una forma de sintetizar D-limoneno es mediante la reaccin de Diels-Alder. Reaccin general

H3C CH2 CH2

+
CH2 O

CH3

H3C

H3C

(Ph)3PCH2
CH3 O H2C CH3

Mecanismo de reaccin

H3C

CH2

CH2

H3C CH3 O

+
CH2

CH3 H2C
-

CH3

H3C CH3 O CH2

-

H3C CH3 O
-

H2C

CH3 P
+

+
O P

Figura 2.

Elucidacin estructural (qumica degradativa o mtodos espectroscpicos) Debido a la diversidad de grupos funcionales que pueden estar presentes en los componentes mono y sesquiterpnicos de un aceite esencial no existe una prueba

especfica para su reconocimiento. Sin embargo existen procedimientos experimentales que permiten reconocerlos, por la coloracin con diferentes reactivos, su absorcin de luz UV y Rf en cromatografa en capa fina. El limoneno se reconoce en las placas de TLC porque absorbe luz UV a 254 nm, otra forma de identificarlo la presencia de terpenos es realizando pruebas tpicas para alquenos: -Ensayo de Baeyer4 (oxidacin con solucin diluida de KMnO4): Los compuestos que tienen enlaces etilnicos o acetilnicos reaccionan con solucin diluida de KMnO4 en frio. El color purpura del ion permanganato se reemplaza por un precipitado marrn de dixido de manganeso. Sin embargo, debe advertirse que muchos compuestos orgnicos debido a la presencia de impurezas, pueden dar una ligera coloracin. Procedimiento: En un tubo de ensayo se coloca 1ml del compuesto a ensayar y se agrega 1ml de la solucin de Baeyer. Agitar el contenido del tubo. Observar y registrar los resultados - Ensayo de bromo en tetracloruro de carbono (Br2)/CCl4) Los compuestos que presentan dobles y /o triples enlaces pueden adicionar bromo. Una prueba que indica la presencia de insaturaciones es aquella en la cual el color del bromo desaparece sin que se desprenda bromuro de hidrogeno (HBr). Esta aclaracin es vlida para explicar que el desprendimiento de HBr indica que tuvo lugar una reaccin de sustitucin y no de adicin. Procedimiento: Colocar 1 ml del compuesto a ensayar en un tubo de ensayo limpio y seco. Agregar 1 ml de la solucin de bromo en tetracloruro de carbono. Agitar el contenido del tubo. Observar y registrar los resultados. Otro mtodo para identificar monoterpenos y sesquiterpenos es por cromatografa en capa fina utilizando reactivos reveladores como el anisaldehdo-cido sulfrico, o vainillina-cido sulfrico5 dando la presencia de zonas rojas-violetas, cafs-rojas, azules-verdes para una prueba positiva. Tambin se utiliza el reactivo de Liebermann-Buchard dando UV-365 nm con presencia de zonas gris-caf y en luz visible (VIS) zonas caf oscuro o gris indicando prueba positiva Objetivo(s)

Realizar la extraccin del aceite esencial de la cascara de naranja dulce (Citrus sinensis); por medio de la destilacin por arrastre con vapor. Aislar D-Limoneno a partir del aceite esencial de la cascara de naranja dulce. Determinar la DL50 en el modelo de Artemia salina

Material y Equipo de laboratorio. Destilacin por arrastre con vapor -Refrigerante con mangueras -Matraz Erlemeyer -Tubos de vidrio, tapones -3 Pinzas de 3 dedos con nuez -3 Soporte universal - Parrilla de calentamiento -Probeta -2 Matraz bola de 500 mL -2 Reostato -2 canastillas de calentamiento -Perlas de ebullicin Extraccin -Embudo de vidrio -Embudo de separacin -Soporte universal -Anillo metlico -Matraz redondo Reactivos. -Diclorometano -Acetona -Hexano y acetato de etilo -Sulfato magnsico anhidro -Etanol Modelo Artemia Salina -Vaso de precipitado de 500 mL -Pipetas pasteur -2 Microespatulas

-Agua -Cloruro de sodio Mtodo de recoleccin, secado, extraccin, purificacin del metabolito secundario. Recoleccin Todas las frutas son material vivo que liberan humedad y calor. Las condiciones de almacenamiento que retienen esta humedad o calor pueden producir cambios negativos en las frutas, tal como mohos o podredumbre. Dado que la naranja es un ctrico no climatrico no debe recolectarse previo a la maduracin del fruto. En este proyecto no se llev a cabo la recoleccin por este mtodo, debido a que el fruto es de consumo comn por lo se tiene la facilidad de adquirirlo en el comercio. Aislamiento La destilacin por arrastre con vapor es una tcnica muy utilizada para extraer compuestos de fuentes naturales (como los aceites esenciales) o para remover productos de mezclas de reaccin complejas. Se utiliza un matraz generador de vapor (equipado con un tubo de seguridad para evitar proyecciones), conectado por medio de un adaptador, a otro matraz que contiene la mezcla que se desea destilar que va ensamblado a un refrigerante y un colector. El destilado ser un lquido turbio, producto de la mezcla de ambos constituyentes inmiscibles, despus de un tiempo de reposo se separarn en dos fases. Por medio de un embudo de separacin es posible separar los componentes. Cuando no es tan sencilla la separacin, se hace una extraccin con un disolvente.

Mtodo indirecto 1. Conectar un matraz generador de vapor al mismo equipo. Eliminar el embudo de adicin. 2. Colocar en el matraz la mezcla que se va a destilar.

3. Introducir dentro de la mezcla a separar el inyector de vapor que debe llegar hasta el fondo del matraz. 4. Calentar con mantilla el matraz que contiene la mezcla, si se observa que hay condensacin. 5. Recibir el destilado en un matraz.6

Extraccin:http://biotec93.blogspot.mx/2012/02/obtencion-de-un-productonatural.html [F. consulta 20130224] -Preparacin del material: Para la extraccin se monta un equipo donde se coloca el embudo de decantacin (que tener su correspondiente tapn y llave funcionales) en un aro metlico sujeto a un soporte universal sujetado mediante una pinza. -Adicin de fases: Se vierte la disolucin con ayuda de un embudo redondo en el embudo de decantacin. Sobre sta se aade el disolvente orgnico (diclorometano). As se pueden reconocer dos fases, la fase acuosa y la fase orgnica.

-Agitacin de la mezcla: Se cierra el embudo, y se coloca una mano sobre la llave y la otra sobre el tapn, se agita la mezcla mediante movimientos circulares, para eliminar el aumento de presin que se ha producido se abre la llave, despus se vierten 10 ml de diclorometano y se repite este proceso hasta tres veces. -Separacin de fases: Se coloca el embudo de decantacin sobre el aro metlico con el tapn abierto y se espera hasta que las dos fases se separen. Se recoge la fase orgnica, ya que el limoneno se disuelve mejor. Este proceso se realiza en un matraz redondo previamente tarado.

-Secado de la fase orgnica: Al juntar las tres fases orgnicas, quedan restos de agua. Con el propsito de eliminar estos restos de agua se utiliza el desecante sulfato de sodio anhidro (NaSO4) que se hidrata segn la reaccin:

-Filtrado y eliminacin del disolvente: El agente desecante se elimina mediante filtracin empleando un crculo de papel provisto de varios pliegues y dispuesto sobre el embudo redondo. Para eliminar el disolvente orgnico se utiliza el rotavapor de la siguiente manera: Primero se une el matraz a la boquilla, se activa la conexin al vaco y cuando deje de hacer ruido, se habr hecho el vaco y el matraz quedar sujeto. Despus se baja la palanca para que el matraz quede en contacto con el agua, se espera a que se termine de destilar, se desactiva el vaco y finalmente se pesa el limoneno Fase experimental prctica La extraccin del limoneno se realiz a partir del aceite esencial obtenido del pericarpio de la cascara de naranja (Citrus sinensis) mediante la tcnica de arrastre con vapor de tipo indirecta que se realizo de la siguiente manera: 1. Se pesaron 500 g. del pericarpio, recin cortado. 2. Se colocaron a destilacin por arrastre con vapor que se llev por 3 horas obtenindose 420 mL de aceite con agua (Ver imagen 1).. 3. En un embudo de separacin se aadi el aceite con agua con 25 mL de diclorometano y se agit vigorosamente para permitir que las fases interactuarn de tal manera que los solutos presentes se distribuyeran entre ambas. Se repiti el procedimiento 3 veces aadiendo 15 mL de cloruro de metileno cada vez. Como el diclometano (1,33 g/cm) es ms denso que el agua la fase orgnica se fue a la fase inferior del embudo y la fase acuosa se present en la parte superior. Se realiz la extraccin de la fase orgnica a la que posteriormente se le aadi sulfato de sodio anhidro para secarla. (Ver imagen 2) 4. Se realiz una filtracin rpida para separar el sulfato de sodio de la fase orgnica la que se llev al rotavapor para destilar el diclorometano y obtener el producto. (Ver imagen 3) 5. Se pes y se coloc en un frasco mbar previamente tarado. Pruebas de identificacin del metabolitos secundarios.

Se realizaron pruebas destructivas para determinar la presencia del limoneno utilizando las mismas que se realizan para determinar alcanos ya que la estructura contiene dobles enlaces; con bromo en cloroformo y permanganato de potasio diluido. Tambin se llev a cabo una cromatoplaca en una cmara con mezcla de disolventes de 6 mL de hexano y 4 mL de acetato de etilo utilizando un revelador de vainillina que se preparo de la siguiente forma: -Se prepararon 2 diluciones, una con 9 mL de etanol y pocos cristales de vainillina y la segunda con 1 mL de acido sulfrico concentrado en 9 mL de etanol Despus de correr la cromatoplaca se roci con la solucin de la vainillina y posteriormente con la solucin de acido sulfrico colocndola a calentamiento directo en la parrilla. Evaluacin de la toxicidad en el modelo de Artemia salina (determinar la DL50). Procedimiento: Se prepar una solucin salina diluyendo 12 g. de NaCl en 500 mL de agua, posteriormente se monto la prueba realizando un blanco diluyendo 1 mL de etanol (disolvente para el limoneno) en 9 mL de solucin salina aforada a 10 mL . Posteriormente se realizaron 3 stock: 1. 5100 ppm; agregando 51 mg de aceite, 1 mL de etanol y aforando a 10 mL con solucin salina 2. 4000 ppm: agregando 40 mg de aceite, 1 mL de etanol y aforando a 10 mL con solucin salina 3. 3100ppm: agregando 31 mg de aceite, 1 mL de etanol y aforando a 10 mL con solucin salina Por lo que se prepararon soluciones con concentraciones de 5100 ppm, 4000 ppm, 3100 ppm, 2040 ppm, 1600 ppm, 1240 ppm, 816 ppm, 640 ppm, 496 ppm, 326 ppm, 256 ppm, 198 ppm colocando en cada concentracin 12 artemias que no fueron recin eclosionadas Las pruebas se realizaron por triplicado Observaciones.

- La destilacin por arrastre por vapor se realizo en 2 partes ya que el matraz Erlemeyer no poda contener tanta materia prima. -Al culminar el rotavapor el compuesto adquiri una consistencia aceitosa, amarilla y un aroma dulce. -Las artemias utilizadas no fueron recien eclosionadas. Resultados y discusin de resultados.

Peso del limoneno obtenido

1.64 g.

Se obtuvieron 1.64 g de limoneno con un volumen de 1.72 mL teniendo una densidad de 0.94 g/cm3 que es una densidad cercana a la reportada en literatura 0.85 g/cm3 (reporte de la norma NMX-F-063-1978). Para las pruebas de identificacin se realizaron las siguientes. Cuadro #. Prueba Revelado vainillina/H2SO4 Resultado Positiva, despus del calentamiento se observo un ligero color morado en la misma zona donde corri el aceite esencial (Ver imagen 4) Positiva, observando un cambio de color de morado a caf (Ver imagen 5) Positiva, observando un cambio de color de rojo a incoloro (Ver imagen 6)

KMnO4 diluido y frio Br2/CCl4

Determinacion de la citotoxicidad en el modelo Artemia salina Los resultados obtenidos son los presentados a continuacin:

Concentracin (ppm) 5100

log Conc. 3.71

Muertas 12

Vivas 0

Acumuladas Acumuladas Muertas Vivas 108 0

Radio TOTAL Muertes 108/108

Mortalidad 100.00%

4000 3100 2040 1600 1240 816 640 496 326 256 198

3.60 3.49 3.31 3.20 3.09 2.91 2.81 2.70 2.51 2.41 2.30

12 12 12 12 12 10 8 11 1 4 2

0 0 0 0 0 2 4 1 10 7 10

96 84 72 60 48 36 26 18 7 6 2

0 0 0 0 0 2 6 7 17 24 34

96/96 84/84 72/72 60/60 48/48 36/38 26/32 18/25 7/24 6/30 2/36

100.00% 100.00% 100.00% 100.00% 100.00% 94.70% 81.25% 72.00% 29.10% 20.00% 5.55%

Tabla 1.

120.00%

Mortalidad

100.00%

80.00%

60.00% Mortalidad 40.00%

20.00%

0.00% 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00

Grafico 1.

120

100

80

Y Acumuladas Muertas Y Acumuladas Vivas

60

40

20

0 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00

Nmero de Acumulados

Log. de la dosis

Grafico # Las 2 curvasseomtersectam a la dosis letal para el 50% de la poblacin animal Disposicin de Residuos. -Los fase acuosa generada se arrojo a la tarja ya que solo era agua. -El disolvente destilado (diclorometano) se coloc en los desechos no clorados. -Las artemias que sobrevivieron se les agrego formaldehido y se tiraron junto con las muertas en la tarja.

Conclusiones.

Bibliografa.

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[Fecha deconsulta 2013/02/02]

6. Soria Arteche Olivia, Fundamentos de Qumica Orgnica experimental Universidad Autnoma Metropolitana, Unidad Xochimilco, Mxico, 2009, pg. 203-204 y 207 7. biotec93.blogspot.mx/2012/02/obtencion-de-un-producto-natural.html [F. consulta 20130224]

ANEXOS

Arrastre por vapor

Extraccin

Rotavapor

Pruebas de identificacin: Cromatografia en capa fina Relevador con vainillina/ac. sulfurico

Prueba de KMnO4 frio

Prueba con bromo

Prueba de Artemia Salina