I.

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

B. Tujuan Tujuan dari praktikum penentuan kualitatif dan kuantitatif asam nukleat menggunakan spektrofotometri adalah untuk melakukan pengukuran kualitas dan kuantitas DNA hasil isolasi dan mengetahui pengaruh perbedaan perlakuan isolasi DNA terhadap kualitas dan kuantitas DNA yang diperoleh

II. MATERI DAN METODE

A. Materi

Alat-alat

yang

digunakan

adalah

spektrofotometer

UV

(UV-Vis

spektrofotometer shimadzu model UV mini 1240), tissue, kuvet, dan tabung reaksi. Bahan-bahan yang digunakan adalah DNA hasil isolasi (buah dan bakteri) dan akuades steril. B. Metode

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Tabel 1. Perhitungan Konsentrasi DNA No 1 2 3 4 5 6. Sampel Strawberry Alpukat Pepaya Mangga Naga E.coli Keterangan: 230 A[S]-A[B] 0,009 0,027 0,063 0,595 0,003 -0,011

Hasil

260 A[S]-A[B] 0,008 0,024 0,012 0,091 0,004 0

280 A[S]-A[B] 0,007 0,034 0,01 0,052 0,006 0,002

320 A[S]-A[B] 0,012 0,054 0,01 0,065 0,009 0

A[S] = Absorbansisampel DNA A[B] = AbsorbansiBlanko

Tabel 2. Perhitungan Konsentrasi DNA terhadap Konsentrasi Protein dan Karbohidrat/Kemikalia No 1 2 3 4 5 6 Panjang Gelombang () (nm) 230 nm 400 1200 600 250 200 0 260/280 nm 1,143 1,706 1,2 0,83 0,67 0 260/230 nm 0,089 0,89 0,19 0 1,33 0

B. Pembahasa A. Pembahasan

Spektrofotometer merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. peralatan yang digunakan dalam spektrofotometri disebut spektrofotometer. cahaya yang dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV dan inframerah, sedangkan materi dapat berupa atom dan molekul namun yang lebih berperan adalah elektron valensi. Sinar atau cahaya yang berasal dari sumber tertentu disebut juga sebagai radiasi elektromagnetik. Radiasi elektromagnetik yang dijumpai dalam kehidupan sehari-hari adalah cahaya matahari. Dalam interaksi materi dengan cahaya atau radiasi elektromagnetik, radiasi elektromagnetik kemungkinan dihamburkan, diabsorbsi ataupun spektroskopi emisi. Spektrofotometri dapat dibayangkan sebagai suatu perpanjangan dari penilikan visual dimana studi yang lebih terperinci mengenai pengabsorbsian energi cahaya oleh

spesies kimia memungkinkan kecermatan yang lebih besar dalam pencirian dan pengukuran kuantitatif. Kelemahan spektrofotometri adalah alat-alat yang digunakan untuk analisisnya harganya mahal, perawatannya agak sedikit susah. Hukum Bouguer-Beer menuntut radiasi monokromatik karena nilai absorbtivitas bergantung pada panjang gelombang. Nilai absorbans yang terukur mencerminkan distribusi panjang gelombang dalam radiasi yang dalam sebuah spektrofotometer praktis, tak pernah benar- benar monokromatis. Kelebihan spektrofotometri adalah dengan mengganti mata manusia dengan detektor- detektor radiasi lain, dimungkinkan studi absorbsi diluar daerah spektrum tampak, dan sering kali eksperimen spektrofotometri dilakukan secara automatik memudahkan jika yang dicari dengan analisis spektrofotometri adalah konsentrasi komponen dari suatu larutan campuran. Kuantifikasi dan analisa kualitas DNA/RNA diperlukan untuk mengetahui kemurnian dan jumlah konsentrasi DNA/RNA yang diisolasi. Kualitas DNA/RNA terbaik menunjukkan keadaan DNA/RNA bebas dari kontaminasi seperti kontaminasi protein dan garam yang terdapat pada DNA/RNA yang diisolasi. Kuantitas DNA/RNA menunjukkan konsentrasi DNA/RNA. Penentuan konsentrasi DNA dilakukan dengan cara spektofotometri. Sebelum dilakukan pengukuran dengan spektofotometer, DNA diambil sebanyak 3 ul dan diencerkan dengan akuades steril hingga 3000 ul. Absorbansi hasil pengenceran dibaca pada tiga panjang gelombang yaitu 230 nm, 260 nm, 280 nm dan 320 nm. Rasio pada 260 nm dan 280 nm digunakan untuk menilai kemurnian DNA dan RNA. Sampel DNA/RNA dikatakan murni apabila berada dalam skala 1,8-2,0. Rasio pada 260 nm dan 230 nm dikatakan murni apabila berada dalam skala 2,0-2,2 (Anonim 2008). Hasil yang diperoleh pada praktikum ini pada rasio 260 nm dan 280 nm berada di bawah skala murni asam nukleat. Hal ini menunjukkan DNA plasmid yang diuji berada dalam kondisi tidak murni yang disebabkan oleh kontaminasi protein, fenol, garam, atau kontaminasi lainnya yang absorbsi pada atau disekitar 280 nm. Kemurnian yang diperoleh pada rasio 260 nm dan 230 nm juga menunjukkan kondisi di bawah skala murni asam nukleat. Hal ini menunjukkan adanya kontaminasi protein, fenol, garam, atau kontaminasi lainnya yang absorbsi pada 230 nm Hasil kuantitas DNA menunjukkan bahwa nilai kemurnian pada masing-masing sampel berbeda dan tingkat konsentrasi DNA yang diperoleh berbeda-bada pula. Perbedaan

konsentrasi DNA yang diperoleh pada masing-masing sampel dapat ditentukan oleh perlakuan fisik yang diberikan serta kemampuan buffer ekstrasi dalam memecah sel. Proses perusakan sel secara fisik dengan penggerusan sampel yang sempurna dapat mempermudah buffer ekstrasi dalam memecah sel. Disamping itu buffer ekstrasi yang digunakan dapat menentukan konsentrasi DNA yang dihasilkan.

IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan B. Saran