METROLOGIA

Micropipetas

As micropipetas são instrumentos volumétricos utiliza-

dos para a medição de um determinado volume de líquido
quando são necessários valores na ordem dos micro-
litros. São instrumentos de medição muito importantes
em áreas como a química, biologia, saúde, farmácia e
genética, que trabalham com o doseamento volumétrico
em pequena escala. Existem dois tipos de micropipetas:
as micropipetas de deslocamento positivo utilizadas para
líquidos específicos e as de deslocamento de ar, sendo
estas últimas as mais utilizadas em laboratórios.

O princípio da operação de pipetagem é simples: o

enchimento das micropipetas é realizado através dum
êmbolo accionado manualmente que aspira o líquido
de calibração. A quantidade de ar entre o êmbolo e a
pipeta determina o volume pretendido. O mesmo êmbolo
também provoca o escoamento do líquido por impulsão
do ar.

Calibração

IMPORTÂNCIA DA
Acalibração de micropipetas consiste na determinação
do volume escoado de uma micropipeta através do
método gravimétrico, utilizando água como líquido de

CALIBRAÇÃO
calibração, à temperatura de referência de 20ºC, utili-
zando fórmulas adequadas, e que permite obter o erro
volumétrico associado à micropipeta.

DE MICROPIPETAS O procedimento experimental é baseado na norma ISO

8655(1) e consiste em efectuar cinco enchimentos suces-
sivos de forma a que a micropipeta atinja o equilíbrio de

NOS ENSAIOS ANALÍTICOS humidade. Muda-se de seguida a ponta e faz-se um novo

A medição de volume é um passo crítico em qualquer
laboratório analítico, especialmente quando se trabalha
em ensaios muito sensíveis onde existem poucas
quantidades de amostra a analisar e onde um pequeno
erro de pipetagem pode causar um erro bastante
significativo no resultado. Para se conseguir identificar
e corrigir erros provenientes do manuseamento de
líquidos é essencial a calibração dos instrumentos
volumétricos nas mesmas condições em que são
utilizados no laboratório.
Elsa Batista
Laboratório de Volume
Instituto Português da Qualidade
enchimento. Determina-se o peso do recipiente com 3mm
de água e pipeta-se o volume pretendido. Pesa-se o
recipiente com água e, por diferença, determina-se o
valor do volume da micropipeta. Repete-se os ensaios
10 vezes sem limpar o recipiente. Em cada medição
deve-se registar o valor da massa. O valor médio dos 10
ensaios corresponde à massa escoada da micropipeta.
Para se determinar qual o volume correspondente à
massa escoada da micropipeta utiliza-se a seguinte
fórmula descrita na ISO 4787(2):
Nesta equação temos:
V20 – volume, à temperatura de 20ºC, em µl;

38 QUALIDADE EM SAÚDE

IL – resultado da pesagem com o recipiente cheio com
água, em mg;
IE – resultado da pesagem com o recipiente vazio, em
mg;
ρW – massa volúmica da água, à temperatura de cali-
bração t, em mg/µl;
ρA – massa volúmica do ar, em mg/µl (para temperaturas
muito próximas de 20ºC e à pressão atmosférica
normal pode ser usado o valor médio de 0,0012
mg/µl);
ρB – massa volúmica de referência das massas da
balança (para massas conformes com a OIML 33,
normalmente utilizados, este valor é de 8,0 mg/µl);
γ – coeficiente de expansão cúbica do material de que
é constituída a micropipeta, em ºC–1;
t – temperatura da água usada na calibração, em ºC.
A temperatura do líquido de calibração é um elemento
essencial para o cálculo do volume, uma vez que a sua
variação implica a obtenção de diferentes valores de
densidade. Assim, é de extrema importância que o líquido
de calibração se encontre à temperatura de trabalho
do laboratório para que os valores obtidos na calibra-
ção possam ser utilizados no decorrer de ensaios
laboratoriais. Atemperatura de referência deverá ser de
(20 ± 0.5)ºC. O líquido de calibração deverá ser água
destilada com uma condutividade inferior a 5 µS/cm(3).
Cálculo da incerteza
A incerteza de medição é o parâmetro associado ao
resultado de uma medição, que caracteriza a dispersão
dos valores que podem ser razoavelmente atribuídos
à mesuranda(4). Para calcularmos a incerteza do volume
escoado temos de ter em conta os factores que vão
influenciar essa medição ou seja os componentes de
incerteza.
O cálculo da incerteza na calibração de micropipetas é
semelhante ao descrito no trabalho de E. Batista et.al.,
Metrologia 2000(5). Neste caso específico as componen-
tes da incerteza vão ser as seguintes:
a incerteza da pesagem (um)
a incerteza da massa volúmica da água (uρw),
dos pesos da balança (uρB) e do ar (uρA)
a incerteza da temperatura (ut)
a incerteza da evaporação (uevap)
a incerteza do coeficiente de expansão cúbica
do material (uγ)
Para se obter a incerteza padrão multiplica-se cada
componente pelo respectivo coeficiente de sensibilidade,
METROLOGIA
que descreve como a grandeza V20 é influenciada pelas variações
de cada um dos componentes da fórmula utilizada.
Assim, a fórmula de cálculo da incerteza padrão é a seguinte:
A incerteza padrão é de seguida multiplicada por um factor de
conversão k (normalmente é 2 para um número de graus de
liberdade superior a 50) para se obter a incerteza padrão expandida
que corresponde a um intervalo de confiança de 95%.(6)
Assim, o resultado final da calibração irá ser representado por:
V20= Volume ± Incerteza
Variação do erro
Asoma do módulo do erro obtido (diferença entre o volume nominal
e o volume convencionalmente verdadeiro) com o módulo da
incerteza deverá ser igual ou inferior à tolerância do instrumento
indicada na norma ISO 8655, de forma a que o instrumento possa
ser utilizado nos ensaios a que se destina.
Testes de desempenho
O erro volumétrico obtido na calibração da micropipeta pode ser
alterado indevidamente (invalidando todo o processo de calibração)
devido a vários factores de manuseamento deficiente do material,
tais como um mau funcionamento do êmbolo causado pela fadiga
da mola da micropipeta ou erros associados ao tipo de ponta, entre
outros.
Assim sendo, foram efectuados dois tipos de ensaios de desem-
penho a uma micropipeta de 1000 µl para se avaliar a sua resposta
em condições específicas e como isto pode influenciar o volume
escoado: o ensaio das pontas e o ensaio de fadiga. No primeiro
caso a micropipeta foi calibrada sempre com a mesma ponta cinco
vezes. No caso da fadiga foram realizadas 100 medições conse-
cutivas, 10 testes com 15 minutos de intervalo e cinco testes com
24 horas de intervalo. Cada teste possui 10 medições.
Os resultados obtidos(7) estão indicados nas figuras da página
seguinte.
Como se pode observar pelas figuras, no ensaio de fadiga a
micropipeta necessita de algum tempo para recuperar depois de
ser utilizada continuamente. O volume vai diminuindo ao longo das
100 medições (figura 1) possivelmente devido a um problema mecâ-
N.11 - JULHO/SETEMBRO 2004 39
METROLOGIA

nico de aspiração do líquido, o êmbolo não consegue voltar à posi-

ção inicial. Por outro lado, se houver um intervalo de 15 minutos de
espera (figura 2) entre 10 medições consecutivas, a micropipeta já
tem tempo para recuperar e o problema mecânico é suprimido, o
mesmo acontece se o intervalo de espera for de 24 horas (figura 3),
mas como é óbvio este tempo de espera não é viável em labo-
ratórios analíticos.

Para o ensaio das pontas (figura 4) verifica-se que se a mesma ponta

for utilizada em todas as medições não existe alteração de volume,
mas é mais seguro proceder à substituição da ponta em cada medi-
ção porque, se existir algum defeito de fabrico que possa influenciar
o resultado, pode não ser identificado durante os ensaios. Outro
problema que pode ocorrer se não houver substituição de pontas é
o da contaminação no caso de medições químicas ou biológicas.

Conclusão

Acalibração das micropipetas é de muita importância para os testes

analíticos, pois permite verificar quais os erros e incertezas asso-
ciados ao material utilizado, sendo assim possível a correcção do
volume doseado nas análises realizadas, obtendo-se um resultado
final mais correcto e realista.

Por outro lado, uma utilização cuidada das micropipetas também é

importante, visto que os testes de desempenho indicam claramente
que as micropipetas não devem ser usadas continuamente sem
nenhum intervalo de espera devido à fadiga do êmbolo que irá levar
a resultados de medição de volume incorrectos. Recomenda-se
assim um intervalo de espera de pelo menos 15 minutos entre 10
medições consecutivas se a precisão do resultado for importante
na medição de volume.

Através do teste das pontas pode-se concluir que é melhor utilizar

diferentes pontas em cada medição para evitar contaminações e
identificar problemas de construção da ponta.

Bibliografia
[1] ISO 8655-1/2/6, 2002 – Piston-operated volumetric apparatus;
[2] ISO 4787, 1984 – Laboratory glassware - Volumetric glassware - Methods
for use and testing of capacity;
[3] Guia Relacre – Calibração de material volumétrico, 1995;
[4] VIM – Vocabulário Internacional de Metrologia, IPQ (1996);
[5] E. Batista, A. Sabrosa, M. Ferreira, I. Castanheira, A.M.H. Van der Veen –
"Uncertainty calculation in the calibration of volumetric laboratory glassware",
Congresso de Metrologia, Brasil, 2000;
[6] BIPM, IEC, IFCC, ISO, IUPAC, IUPAP, OIML– Guide to the expression of
uncertainty in measurement (GUM), Geneva, 1995;
[7] E. Batista, L.Pinto, E. Filipe, A.M.H. Van der Veen – "Calibration of micro-
pipettes: test methods and uncertainty calculation", Congresso de Metrologia,
Toulon, 2003.

Agradecimentos
AEduarda Filipe e Luís Pinto o permanente apoio e disponibilidade na elabo-
ração deste artigo.

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