GLICOSIDOS CARDIOTONICOS DEFINICION Los glicsidos cardiotnicos son sustancias amargas constituidas de una porcin esteroide, una porcin

glicosdica y un anillo de gama-lactona , alfa,-insaturada o delta-lactona-alfa,insaturada, que actan sobre el msculo cardiaco y por tanto se utilizan como medicamentos contra la insuficiencia cardiaca. Se conocen entonces segn el anillo lactnico dos grandes clases de cardiotnicos: Los CARDENOLIDOS, con anillo de gama-lactona,a y los BUFANOLIDOS O ESCILANOLIDOS, con anillo de delta-lactona.

Los glicsidos cardiotnicos son sustancias constituidas de una porcin esteroide, una porcin glicosdica y un anillo de -lactona a,-insaturada o d-lactona-a,insaturada, que actan sobre el msculo cardiaco y por tanto se utilizan como medicamentos contra la insuficiencia cardiaca. Se conocen entonces segn el anillo lactnico dos grandes clases de cardiotnicos: Los CARDENOLIDOS, con anillo de -lactona, y los BUFANOLIDOS O ESCILANOLIDOS, con anillo de dlactona. La figura 24 muestra la estructura estereoqumica general de ambas clases de sustancias.

glicsidos cardiotnicos: incrementan la fuerza de contraccin del corazn

actan sobre el corazn fortaleciendo el trabajo cardiaco. La fraccin de hidratos de carbono que constituyen los glicosidos, contienete de 3 a 5 monosacaridos , por lo general desoxiazucares o azucares especiales. Para que el compuesto resulte activo, deben estar presentes al menos un OH en el C3 en (que constituye el glicosido) y otro en el C14 en , metilos en , en C10 y C13; una lactona unida al C17 correspondiente a una g-lactona a insaturada (cardenolido), o una d-lactona a, -insaturada ( bufadienolido), y los anillos A/B y C/D deben estar en cis
BIOSINTESIS La progesterona formada se condensa con una unidad C2 para dar origen a una cadena lateral de 4 carbonos tpica de los cardenlidos.La posterior oxidacin y deshidratacin origina el anillo lactona,-insaturada.Posteriormente ocurre la glicosilacin. DISTRIBUCION NATURAL Principalmente en las hojas de plantas de las familias Scrofulariaceae, Apocynaceae, Liliaceae, Ranunculaceae y Moraceae.Los bufanlidos se han encontrado tambin en ranas del gnero Bufus, y en las alas de mariposas monarca, han sido considerados de inters por su potencial anticancergeno. DISTRIBUCION NATURAL

Cardenlidos: familias Scrofulariaceae, Apocynaceae, Liliaceae, Ranunculaceae y Moraceae Bufanlidos: en ranas del gnero Bufus, y en las alas de mariposas monarca

ENSAYOS DE RECONOCIMIENTO Los cardenlidos se pueden reconocer en muestras biolgicas mediante los ensayos de coloracin con varios reactivos nitro, tal como se anot para las sesquiterpenlactonas; especficamente con los reactivos de Kedde, Legal y Raymond. Al igual que las saponinas esteroides, dan resultados positivos con el reactivo de Liebermann-Burchard, lo que permite diferenciarlos de las terpenlactonasy las cumarinas.

Kedde Legal Raymond Liebermann-Burchard Ensayosparacarbohidratos (Molisch, antrona, etc.) Keller-Kiliani: Para 2-deoxiazcares A.- ENSAYO DE KEDDE (PARA CARDIOTONICOS)Precaucin: La formacin del color violceo no dura sino algunos pocos segundos.Ensayo: Tomar 1 ml de la fase orgnica. Llevar a sequedad. Redisolver en 1 ml dealcohol. Aadir 0.5 ml de reactivo de Kedde recin prepa rado (Mezcla de partes igualesde las soluciones A y B). Se considera positiva la prueba si aparece una coloracinprpura o violcea. Como referencia se puede compa rar con el color producido con 1ml de KOH al 5% en alcohol. B.- HIDROLISIS Los glicsidos cardiotnicos se hidrolizan fcilmente en soluciones cidas liberando la sapogenina y los carbohidratos ligados. En medio alcalino, adems de liberarse la sapogenina ocurre la apertura del anillo lactnico.

10. HECHOS ESTRUCTURALESLos cardiotnicos naturales en su gran mayora, poseen:Un anillo lactnicoa,-insaturado en posicin 17Un grupo hidroxilo o glicosilo en posicin 3Un grupo hidroxilo en posicin 14Configuracin cis entre los anillos A/B y C/DOtros grupos hidroxilo en 1, 5, 12, 16, etc.El grupo metilo 19 algunas veces oxidado hasta alcohol o aldehdo1 a 4 unidades de carbohidrato ligadas al oxgeno del carbono 3Los carbohidratos ligados son principalmente glucosa y desoxiazcarescomo digitoxosa, cimarosa, etc.Los desoxiazcares son una caracterstica importante de los glicsidos cardiotnicos, ya que esta clase de carbohidratos se encuentra prcticamente restringida a estas sustanciasnaturales. HECHOS ESTRUCTURALES

Un anillo lactnico alfa,-insaturado en posicin 17. Un grupo hidroxilo o glicosilo en posicin 3. Un grupo hidroxilo en posicin 14. Configuracin cis entre los anillos A/B y C/D Otros grupos hidroxilo en 1, 5, 12, 16, etc. El grupo metilo 19 algunas veces oxidado hasta alcohol o aldehdo. 1 a 4 unidades de carbohidrato ligadas al oxgeno del carbono 3. Los carbohidratos ligados son principalmente glucosa y desoxiazcares como digitoxosa, cimarosa, etc.

Los desoxiazcares son una caracterstica importante de los glicsidos cardiotnicos, ya que esta clase de carbohidratos se encuentra prcticamente restringida a estas sustancias naturales.

11. EXTRACCION Y AISLAMIENTOAl igual que las saponinas esteroides y otros glicsidosterpenoides, los cardiotnicos pueden aislarse en forma glicosdica o como sapogeninas.En el primer caso se utiliza el mtodo ya descrito para las saponinas esteroides (desengrase, extracto polar, resina de intercambio inico, Sephadexy cromatografa), mientras que en el segundo caso se realiza una hidrlisis cida seguida de particin con un solvente orgnico (generalmente cloroformo) y cromatografa en sus diferentes formas, especialmente con slica gel.Para el fraccionamiento por cromatografa en columna con slica gel pueden utilizarse mezclas de solventes comDiclorometano/Metanol/Agua 91:22:683.Luego de este fraccionamiento e hidrlisis cida, las

geninas pueden analizarse y separarse por HPLC-fase reversa4,5,6,7; mientras que los carbohidratos ligados pueden analizarse por cromatografa en papel eluyendo con la mezcla Butanol/Acido Actico/Agua 4:1:58.Recientemente y gracias al avance de las denominadas tcnicas "on-line" y el desarrollo de interfaces HPLC-Espectrometra de masas se pueden analizar extractos crudos que contienen glicsidos cardiotnicos o saponinas, mediante tcnicas combinadas como LC-TMS (HPLC combinada con Espectrometra de masas con interfasetermospray) y LCCF/FAB (HPLC combinada con Espectrometra de masas FAB de flujo continuo)9. 12. VALORACION EN PRODUCTOS FARMACEUTICOSLa mejor tcnica para valorar los glicsido cardiotnicos en extractos vegetales y productos farmacuticos es HPLC.Otros mtodos de valoracin de los cardiotnicos son la colorimetra con el Reactivo de Kedde y mtodos biolgicos en los que se determina la Dosis Letal Mnima (DL-50), el volumen de vmito en palomas, el paro cardaco en gatos y con el corazn aislado de ranas, y los mtodos enzimticos. 13. ACCION FARMACOLOGICA Y RELACION ESTRUCTURAACTIVIDADTienen accin inotrpica positiva, es decir, incrementan las fuerzas de contraccin del msculo cardaco. Por otro lado, las hojas de digital tienen un efecto diurtico. Por estas razones se les utiliza en tratamientos de nefritis, edemas y algunas enfermedades infecciosas. Se ha establecido que para que los cardiotnicos manifiesten su actividad requieren adems del ciclo lactnicoa,insaturado, que:La configuracin sea 14,3,17configuracin A/B cisAdems, se ha observado que la presencia de azcares ligados y el nmero de hidroxilos tienen capacidad en aumentar la actividad farmacolgica.

Extraccin y aislamiento

Glicsidos: Extraccin dem a lo descrito para las saponinas esteroides (desengrase, extracto polar, resina de intercambio inico, Sephadex y cromatografa) Sapogeninas: Extraccin con hidrlisis cida seguida de particin con un solvente orgnico (generalmente cloroformo) y cromatografa en sus diferentes formas, especialmente con slica gel. Cromatografa en columna (Slica gel, DiclorometanoMetanol/Agua 91:22:68) Extraccin con hidrlisis cida, las geninas pueden analizarse y separarse por HPLC-fase reversa; mientras que los carbohidratos ligados pueden analizarse por cromatografa en papel eluyendo con la mezcla Butanol/Acido Actico/Agua 4:1:5. HPLC-Espectrometra de masas LC-TMS (HPLC combinada con Espectrometra de masas con interface termospray) LC-CF/FAB (HPLC combinada con Espectrometra de masas FAB de flujo continuo).

CARACTERISTICAS ESPECTRALES

 Espectroscopia Infrarrojo: Los cardiotnicos adems de las bandas caractersticas de la funcionalidad esteroide, presentan bandas de absorcin caractersticas del grupo carbonilo lactnico alfa,-insaturado alrededor de 1715-1725 cm-1. b. Espectroscopia UV: El cromforo gama-lactona-alfa ,insaturada muestra un mximo de absorcin alrededor de 215-220 nm. c. Espectrometra de masas 70 eV: Agliconas m/z 111, M-44. Glicsidos: Espectrometra de masas FAB en modo positivo o negativo.

PRINCIPALES DROGAS VEGETALES QUE CONTIENEN CARDIOTONICOS

Hojas de digital La droga la constituyen las hojas desecadas de Digitalis purpurea (Fam. escrofularicea). Esta planta es cultivada en Europa, pero en nuestro pas es ms bien escasa y se utiliza con fines ornamentales. Se la conoce con el nombre vulgar de "campanitas" o "dedalera" y crece silvestre en localidades como a orillas de la autopista Medelln-Bogot en el sector de Sasaima. Los principios activos son una mezcla de glicsidos cardiotnicos denominados purpureaglicsidos, en los cuales la sapogenina es la digitoxigenina. Uno de estos es el

purpureaglicsido A:

La especie relacionada Digitalis lanata, tambin contiene glicsidos cardiotnicos pero con la caracterstica particular de que uno de los carbohidratos ligados posee un grupo hidroxilo acetilado. Esta especie contiene los denominados lanatsidos como por ejemplo:

La especie D. lanata, aunque es originaria de Europa, tambin se encuentra en nuestro pas, especficamente en la sabana de Bogot. Estas drogas vegetales se comercian en Europa bajo nombres comerciales como Digitalina, Cardinatina, Cristalloxina, Digoxina, etc. Para el anlisis HPLC de esta droga puede consultarse el trabajo de Ikeda y col.26, y este autor tambin ha reportado el anlisis cuantitativo mediante Cromatografa en Capa Fina de Fase Reversa 27. El gnero Isoplexis fam. Escrofulariceas contiene cardenlidos similares a los de Digitalis28.

Estrofanto Esta droga la constituyen las semillas desecadas de varias especies de plantas del gnero Strophantus, y es usada como veneno de flechas por los nativos de algunas tribus de Africa. Esta droga contiene el glicsido estrofantina:

Azuceno de la habana Corresponde al Nerium oleander (Fam. Apocinceas). Esta planta es cultivada para fines ornamentales, y es comn verla en diferentes sitios de la ciudad de

Medelln, con flores rosadas o blancas. La variedad de flores blancas tiene reportados usos como antdoto, antibacterial, antiepilptico, anticancergeno, cardiotnico y como depresor del Sistema Nervioso Central (SNC). De las races, Huq y col., aislaron un cardenlido que adems de cardiotnico es antibacterial29. Las hojas contienen varios cardenlidos con accin depresora sobre el SNC 30.

Thevetia peruviana Las semillas de esta planta contienen cardiotnicos como el peruvsido:

Lirio de los valles La droga la constituyen las partes areas de Convallaria majalis (Fam. liliceas). Esta contiene varios cardiotnicos, entre ellos la convalatoxina:

Bulbo de escila La droga la constituyen los bulbos de Drimia maritima (Fam. liliceas). Contiene bufanlidos como el escilareno-A el cual produce irritacin gstrica la que a su vez induce la secrecin de los bronquiolos, por lo cual se usa como expectorante.

Helboro negro Corresponde al Helleborus niger (Fam. Ranunculceas).

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

INTRODUCCIN

La insuficiencia cardiaca congestiva (ICC) aparece cuando el corazn es incapaz de atender las necesidades del organismo mediante un funcionamiento normal. El corazn aumenta de tamao, pierde fuerza de contraccin y por tanto, la

capacidad de bombear sangre con la eficacia requerida. El tratamiento clsico de la ICC va dirigido a reducir los factores que la provocan y a mejorar la funcin del miocardio, lo cual se puede alcanzar incrementando la eficacia por aumento de la fuerza contrctil y el vaciado del corazn con agentes inotrpicos positivos (cardiotnicos). La especie vegetal Thevetia peruviana, originaria de la Amrica tropical y naturalizada en la regin del Valle de Aburr sintetiza metabolitos secundarios tipo glicsidos cardiotnicos, los cuales almacena en hojas y semillas. Esta premisa fue la motivacin para llevar a cabo la extraccin, purificacin, identificacin y cuantificacin de este tipo de glicsidos presentes en la planta mencionada. Los glicsidos cardiotnicos son de estructura esteroidal y se caracterizan por llevar en el C-17 del ncleo esteroideo un anillo de lactona insaturado. Las diferentes sustituciones del C-17 dan lugar a diversas actividades o funciones, que son aprovechadas para la elucidacin estructural.

Entre los glicsidos cardiotnicos se encuentran los cardenlidos, productos naturales que aparecen en diversas plantas, estos compuestos poseen un anillo pentagonal con un doble enlace conjugado con el carbonilo en C-17. Adems, ellos presentan azcares como sustituyentes, entre los ms importantes se puede mencionar la glucosa y 6-desoxiazcares (ramnosa, mucosa, digitalosa), as como 2,6-desoxiazcares (digitoxosa, cimanosa). El presente trabajo incluye el proceso de extraccin slido-lquido de los glicsidos cardiotnicos de las hojas de Thevetia peruviana a travs de una metodologa optimizada de separacin y purificacin, as como su respectiva identificacin estructural y cuantificacin. La cromatografa de columna fue la tcnica implementada para la separacin de los componentes de la mezcla, en tanto que la elucidacin estructural fue alcanzada con la ayuda de la espectroscopia de Resonancia Magntica Nuclear (1H- y 13C-RMN) y su cuantificacin se logr mediante cromatografa de alta resolucin acoplada a masas, (HPLC-MS), permitiendo determinar por primera vez la cantidad de principios activos presentes en estos compuestos. Para las mediciones espectroscpicas y de cuantificacin contamos con el apoyo del Laboratorio de Resonancia Magntica Nuclear de la Universidad Nacional de Colombia Sede Bogot y del Laboratorio de de Cromatografa Lquida de la Sede de Investigaciones Universitarias, SIU, de la Universidad de Antioquia.

Thevetia peruviana

Seguidamente se detallan algunas caractersticas especficas de la especie vegetal de estudio.

Familia: Apocynceae Sinnimos: Cerbera peruviana , Thevetia neriifolia Nombre comn: Catape, cascabel, azuceno Lugar de origen: Mxico y Amrica tropical Etimologa: Thevetia, en honor a Andr Thvet (1502-1590), misionero francs que colect plantas en Suramrica. Peruviana, del latn peruvianus-a-um, procedente de Per.

Cultivo y usos: Se multiplica por semillas, es una planta de rpido crecimiento y muy resistente a condiciones adversas. Se suele cultivar ms como arbusto que como rbol. Su ltex y semillas son venenosas. Las hojas y semillas contienen glucsidos que actan como estimulantes cardacos; aunque es utilizada en medicina popular su empleo inadecuado es muy peligroso.

Los criterios para la seleccin de la Thevetia peruviana que se utilizar en el presente trabajo de grado se basaron en su disponibilidad geogrfica y en el alto contenido de glicsidos cardiotnicos reportado para esta familia.

Figura 6. Thevetia peruviana

3.5. Propiedades qumicas

Las propiedades fisicoqumicas de estos compuestos corresponden a las esperadas de su estructura y considerable tamao, as, ellos son slidos cristalizables, insolubles poco solubles en agua, solubles en alcoholes y en cloroformo. La solubilidad depende de la naturaleza de la aglucona y de la cadena

de azcares, entre mayor sea el nmero de residuos de azcar, mayor ser la solubilidad. HIPTESIS

Dado que muchas reacciones y compuestos que intervienen en el metabolismo en los diferentes grupos de organismos vivos son casi idnticos, se les denomina reacciones y productos metablicos primarios. Sin embargo, una amplia variedad de rutas bioqumicas son exclusivas de unas pocas especies de organismos y se conocen colectivamente como metabolismo secundario, y a los compuestos generados como metabolitos secundarios, los cuales usualmente son sealados por los qumicos como productos naturales.

La formacin de productos naturales es una caracterstica comn de clulas especializadas, originada por la accin de enzimas especficas que juegan un papel decisivo en el desarrollo y funcin del organismo productor como un conjunto. Actualmente se reconoce que muchos de estos compuestos desempean un papel vital como mediadores de interaccin biolgica, asegurando la supervivencia de un organismo en un medio hostil y competitivo. Tales interacciones incrementan el inters por el estudio de los productos naturales, imprimiendo a este campo un carcter interdisciplinario, que abarca la qumica, la biologa y la botnica, entre otras reas. La razn principal de estos estudios radica en la utilizacin de los productos naturales en medicina, conduciendo a la bsqueda de nuevas plantas potencialmente tiles por parte de qumicos y bilogos, as como de compaas farmacuticas que enfocan sus investigaciones en las propiedades de plantas muy reconocidas en la medicina popular. Con relacin a las enfermedades cardacas, la frecuencia de cardiopatas congnitas constituye un problema de salud que va en aumento en la medida que la poblacin es ms longeva; para su

tratamiento se utilizan glicsidos cardiotnicos, especialmente cardenlidos, causando un efecto que se manifiesta en el sistema cardiovascular ocasionando el aumento de la contraccin sistlica, lo que se denomina accin inotrpica positiva.

Los glicsidos cardiotnicos estn presentes en especies vegetales de las familias de las Apocynceas y Asclepydceas, donde la especie vegetal ms importante e investigada para el tratamiento de enfermedades relacionadas con el corazn es la Digitallis purpurea2, conocida como Digital, de la cual se extraen compuestos como la digitoxina que posee una gran cantidad de estos cardenlidos encaminados a producir el efecto inotrpico positivo mencionado. Kyeremematen y Hagos3, de la Facultad de Farmacia del Centro Biomdico Uppsala en Suecia, realizaron un estudio de los compuestos presentes en las especies Thevetia ovata y Thevetia nereifolia, encontrando tres glicsidos cardiotnicos tipo cardenlido, para los cuales se caracteriz una estructura formada por un anillo esteroidal y residuos de glucosa en la posicin del C-3 y un compuesto lactonizado en la posicin del C-17. En este marco de referencia y sealando que pese al gran inters prctico de las plantas de Thevetia peruviana, el estudio de su qumica ha sido muy limitado, el presente trabajo de investigacin centra su inters en el estudio de los compuestos qumicos presentes en las hojas de la especie vegetal Thevetia peruviana, perteneciente a la familia de las Apocynceas, originaria de la Amrica tropical y naturalizada en el Valle de Aburr. Se espera que los metabolitos secundarios aislados puedan ser aprovechados a futuro en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. Acorde con estas expectativas se han fijado los siguientes objetivos:

3.1 OBJETIVO GENERAL

Extraer, purificar, identificar y cuantificar los glicsidos cardiotnicos presentes en las hojas de la especie vegetal Thevetia peruviana, naturalizada en la regin del Valle de Aburr.

3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS * Seleccionar y adecuar un mtodo eficiente para la extraccin y purificacin de los glicsidos cardiactivos existentes en las hojas de Thevetia peruviana.

* Utilizar ensayos conocidos para la identificacin cualitativa de las partes componentes de los glicsidos cardiotnicos.

* Llevar a cabo la identificacin estructural de los compuestos de inters con la ayuda de tcnicas espectroscpicas convencionales.

* Cuantificar mediante cromatografa HPLC-Masas la cantidad de metabolitos cardiotnicos presentes en las hojas de Thevetia peruviana con el fin de disponer de estndares puros de glicsidos cardiotnicos de esta especie, an no disponibles y que sern de gran ayuda como indicadores en la identificacin de cultivos provenientes de esta planta.

4. EQUIPOS

Figura 10. Rotaevaporador

Figura 11. Muestras extraidas y purificadas listas a analizar

Figura 12. Cromatografa de columna

Figura 13. Esquema de la cromatografa de columna

Figura 14. TLC (Thin Layer Chromatography)

5. METODOLOGIA

5. METODOLOGIA

La secuencia de etapas que permitieron extraer, separar, purificar y cuantificar los glicsidos cardiotnicos presentes en las hojas de Thevetia peruviana, se esquematizan en el diagrama 1 (ver final del captulo).

Despus de un tratamiento preliminar de la muestra se efectu un tamizaje fitoqumico, etapa inicial de toda investigacin fitoqumica que permite determinar cualitativamente los principales grupos de constituyentes qumicos (fundamentalmente metabolitos secundarios) presentes en una planta, y a partir de esta informacin, orientar la extraccin y/o fraccionamiento de los extractos para el aislamiento de los grupos de mayor inters. Especficamente, el tamizaje fitoqumico consiste en la extraccin de los componentes qumicos de la planta con disolventes apropiados y la aplicacin de reacciones de coloracin que permitan la evaluacin rpida, sensible, reproducible y de bajo costo de los mismos.

El desarrollo de la secuencia de etapas especficas de la metodologa implementada se describe a continuacin.

5.1. Recoleccin y tratamiento preliminar de la muestra

La recoleccin del material vegetal se llev a cabo en las riberas de la quebrada La Iguana, localizada en el sector urbano de la ciudad, en cercanas de la Universidad Nacional de Colombia Sede Medelln. La Thevetia peruviana es un arbusto de 3 a 5 m de altura, con la corteza griscea, lenticelada, algo rugosa con los aos. Hojas de linear-lanceoladas a lanceoladas, de 10-15 x 0,5-1,2 cm, con la base atenuada, el margen entero y el pice corta o largamente acuminado; son glabras, algo coriceas, de color verde lustroso en el haz, algo ms claras en el envs, con el nervio central destacado y la nerviacin secundaria poco visible. Despus de su respectivo lavado, se procedi a su secado durante dos das a temperatura ambiente, luego se tritur de tal forma que el material vegetal tuviera un tamao promedio de 0.5 cm.

5.2. Preparacin de la muestra

En esta etapa se incluyeron los procesos de licuado, filtracin desgrasado, lavado, cromatografa de capa delgada y rotaevaporacin, que se detallan seguidamente.

Licuado: 250 g de hojas de Thevetia peruviana (TP) previamente seca y triturada se someten a un licuado con 400 mL de ter de petrleo durante 10 minutos para aumentar el rea superficial y as poder extraer la mayor cantidad de cardenlidos.

5.3. Extraccin

Una vez que la TP se ha licuado, se procede a realizar una filtracin al vaco para

recolectar el extracto etreo y eliminar los residuos de las hojas.

Dicho concentrado se lav tres veces con metanol en una relacin de volumen (metanol / ter de petrleo) 3:1 para retirar las grasas en suspensin que se forman durante este proceso y que son retenidas en un embudo de separacin buchner.

Despus se concentran las muestras por medio de rotaevaporacin y se realiza un seguimiento de los compuestos por medio de cromatografa de capa fina para verificar la presencia de los cardenlidos en la muestra.

5.4. ANALISIS CUALITATIVO

Despus del lavado y una filtracin al vaco se debe comprobar la existencia de cardenlidos en el compuesto extrado, para ello se realiz un anlisis cualitativo.

Para comprobar de forma cualitativa la presencia de cardenlidos en el extracto obtenido, se realizaron los siguientes ensayos con reacciones coloreadas: * Presencia de azcares (desoxiazcares). * Presencia del ncleo esteroideal. * Reacciones del anillo de lactona. 5.4.1. Desoxiazcares Para comprobar la presencia de azcares utilizamos la reaccin de Keller Killiani: En un tubo de ensayo se disuelve un poco del extracto metanlico (1 mL) en cido actico con algo de tricloruro de hierro. Sobre esta disolucin se deja caer por las paredes cido sulfrico y tricloruro de hierro. En la superficie de contacto aparece un anillo pardo y una capa actica azul verdosa, que muestra la presencia de los

desoxiazcares. Este ensayo result positivo para la muestra analizada. Reaccin de Keller-Killiani

CH3COOH + FeCl3 + H2SO4

TP

Color verde azul (Fase actica)

5.4.2. Anillo esteroidal Para comprobar la presencia del anillo esteroidal se llev a cabo la reaccin Liebermann-Burchnard. A 1 mL de muestra disuelta en etanol, se le adiciona anhdrido actico (5 mL) y cido sulfrico concentrado (5 mL), recin preparados, se agita con acido actico y se deja reposar en un bao de hielo. La aparicin de un color violeta verde es indicativo de la presencia del anillo esteroidal.

La reaccin de Liebermann-Burchard se realiza en un medio cido fuerte constituido por cido sulfrico, cido actico y anhdrido actico. En la reaccin, el esteroide sufre una oxidacin gradual, formndose en cada etapa una molcula de colestapolieno, que posee un doble enlace adicional con respecto al compuesto del cual deriva. La etapa inicial de esta reaccin consiste en la protonacin del grupo OH del colesterol con la consiguiente prdida de agua, obtenindose el in carbonio 3,5-colestadieno que constituye el primer paso de la reaccin del color. La oxidacin secuencial de este in carbonio allico por el SO2produce un cido colesta-hexano-sulfnico con caractersticas cromofricas. Al igual que en los pruebas anteriores, este ensayo arroj un resultado positivo sobre la muestra de estudio.

5.4.3. Anillo pentagonal de lactona

Reactivo de Raymond-Marthoud.

Este reactivo se prepara a partir de 1 g de m-dinitrobenceno en 100 mL de etanol y la adicin de hidrxido de potasio. La presencia de un color violeta confirma la estructura del anillo lactnico.

Reactivo de Kedde

Para preparar este reactivo se requiere cido 3,5-dinitrobenzoico (al 3% en metanol) y la adicin de hidrxido de potasio (al 6% en H2O). Un color rojo violeta seala la presencia del anillo lactnico.

Estos dos ensayos tambin dieron resultados positivos, confirmando la presencia del anillo lactnico.

5.5. Cromatografa de columna 5.5.1. Separacin a travs de cromatografa de columna Con el extracto vegetal concentrado se realizaron placas cromatogrficas con diferentes combinaciones de solventes para poder determinar la mejor separacin de los compuestos de inters, el mejor resultado fue obtenido para la relacin tolueno/acetato de etilo (3:1).

Con esta combinacin de solventes y con el fin de separar los compuestos del extracto vegetal, ese efectu el montaje de columnas cromatogrficas con silica gel 60, en tanto que la cromatografa de capa fina fue utilizada para controlar la pureza de las fracciones obtenidas.

Al realizar la columna cromatogrfica se observan dos franjas bien diferenciadas por su color, de la primera franja de color verde oscuro se recolectaron las fracciones 3-11, las cuales dieron lugar a un compuesto puro. Las placas

cromatogrficas de las fracciones 12-23, no presentaron ningn compuesto.

La segunda franja de color pardo, correspondiente a las fracciones 24-30 present impurezas en las placas cromatogrficas tomadas en tolueno/acetato de etilo (3:1), por lo que se procedi a realizar una nueva columna cromatogrfica modificando la proporcin de disolventes (tolueno/acetilo de etilo en relacin de volumen 5:1) dando un compuesto puro, pero en cantidad mnima.

Las dos muestras fueron rotuladas y enviadas al laboratorio de Resonancia Magntica Nuclear de la Universidad Nacional de Colombia Sede Bogot para su identificacin espectroscpica.
Resultados La caracterizacin espectroscpica de los cardenlidos se apoya principalmente en la resonancia magntica nuclear de protones y carbono (1H- y 13C-RMN), en la espectrometra de masas y en los espectros simulados; es de resaltar que todas las seales experimentales concuerdan con las predichas. Dado que el glicsido Thevetin A solo puedo aislarse en una cantidad mnima, que permiti la comprobacin de su estructura por medio de masas, la discusin de resultados est referida a la molcula de Thevetin B.

Conclusiones

1. Se comprob la presencia de metabolitos secundarios tipo glicsidos cardiotnicos en la planta de Thevetia peruviana naturalizada en nuestra regin.

2. Mediante tcnicas tradicionales de separacin y purificacin como son, la extraccin, filtracin y cromatografa en columna, se logr aislar y purificar dos metabolitos secundarios tipo glicsidos cardiotnicos en las hojas de la planta Thevetia peruviana, naturalizada la regin de Antioquia. Su elucidacin estructural

se efectu con espectroscopia de RMN y cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC-MS) acoplado a masas.

3. Adems, mediciones de UV-VIS permitieron la cuantificacin del cardenlido Thevetin B en la especie vegetal de estudio.

4. El mtodo desarrollado para extraer y caracterizar los glicsidos cardioactivos fue eficiente y condujo a resultado satisfactorios, por tanto puede implementarse para el anlisis de glicsidos cardiotnicos de otras especies vegetales.

Bibliografa http://es.geocities.com/qo_10_rmn/ Litter, M., Farmacologia experimental y clinica, Ed. El Ateneo, Sexta Edicin. Medarde, M., Caballero, E., San Feliciano, A., Cardiopatas, Investigacin y Ciencia, Febrero (1997), 36-37.