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République algérienne démocratique et populaire.

Université Djillali Liabes


Faculté de Médecine
Département de Pharmacie

TP N°03
Dosage l’urée plasmatique

Réalisée par:
• GHERMI Mohamed.
• BETTAYEB Mohamed Amine.
• TAHRI Mahmoud.
• CHAREF KHODJA Meriem.

4 ème année pharmacie G05.


Année universitaire : 2008 / 2009
TP N 3 DOSAGE DE L’UREE PLASMATIQUE (AZOTEMIE)

L'urée, molécule très hydrosoluble, est la forme principale d'élimination des


déchets azotés du métabolisme des protéines chez l'Homme. La détermination de
l'urée dans le sang longtemps pratiquée pour évaluer la fonction rénale a été
supplantée par celle de la créatinine.

L'urée est le composé azoté le plus abondant de l'urine humaine. Son dosage dans
l'urine est un témoin du métabolisme protidique permettant de comparer les
pertes quotidiennes l'azote aux apports.

Le dosage de l'urée dans le sang est généralement pratiqué en faisant appel à une
méthode enzymatique (uréase).

I- Intérêt physiopathologique :
L'urée est une molécule très hydrosoluble, électriquement neutre. C'est la
forme principale d'élimination des déchets azotés du métabolisme des protéines
chez l'Homme. La plus grande partie de l'ammoniac (NH3), produit dans le foie
par la désamination des acides aminés, est transformée en urée (uréogenèse ou
cycle de Krebs-Henseleit), au niveau du foie et du cerveau.
L'urée est complètement filtrée par le glomérule et réabsorbée partiellement au
niveau du néphron, de façon inversement proportionnelle au débit urinaire.
L'urée est la première substance dont l'augmentation dans le plasma a été associée
au «mal de Bright». À ce titre, elle fut longtemps utilisée pour apprécier la fonction
rénale.
La concentration de l'urée sanguine (ou urémie), correspond à un équilibre entre
sa production, le volume de diffusion (correspond à l'eau totale, soit environ 60%
du poids corporel), et son excrétion urinaire.
Étant donné tous les facteurs extrarénaux susceptibles d'influencer l'urémie, pour
évaluer la fonction rénale, le dosage de la créatinine dans le sang et dans l'urine lui
a été préféré.
De même, le calcul de la clairance de l'urée a été remplacé par celui de la clairance
de la créatinine.
L'urée est le composé azoté le plus abondant de l'urine humaine. Son dosage
contribue à l'exploration de la fonction rénale, et chez le sujet sans affection
hépatique ou rénale, il est un témoin du métabolisme protidique permettant de
comparer les pertes quotidiennes d'azote aux apports prescrits et ainsi de suspecter
une mauvaise observance à un régime ou un état hypercatabolique si l'excrétion
d'azote est supérieure aux entrées.
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TP N 3 DOSAGE DE L’UREE PLASMATIQUE
SMATIQUE (AZOTEMIE)

II-
II- Métabolisme de l’urée (Cycle de l’urée) :

L'ammoniaque, produit final du catabolisme protéique et toxique pour le


système nerveux central, est éliminé de l'organisme par sa transformation en urée
au niveau hépatique. Cette éliminationion est réalisée par une voie métabolique, le
cycle de l'urée, constituée de six étapes enzymatiques réparties entre la matrice
mitochondriale et le cytosol de la cellule hépatique,
hépatique, ces 6 enzymes sont les
suivants : N-acétylglutamate
acétylglutamate synthase [NAGS], carbamylphosphate
carbamylphosphate synthétase I
[CPSI], ornithine transcarbamylase [OTC], argininosuccinate synthétase [ASS],
argininosuccinate
ate lyase [ASL], arginase [ARG].
[ARG]
Certaines de ces enzymes peuvent se retrouver dans d'autres tissus; elles ont
alors un autre rôle. Tout dysfonctionnement
dysfonctionnement de cette voie métabolique entraînera
l'apparition d'une hyperammoniémie. Celui-ci
Celui ci peut être le résultat d'une mutation
délétère touchant un gène codant pour une des enzymes impliquées ou d'une
inhibition d'une des enzymes causée par l'accumulation
l'accumulation d'un composé d'origine
endogène (aciduries organiques) ou exogène (valproate). Dans le cas d'un
dysfonctionnement d'origine génétique, il est important de caractériser
précisément l'étape défectueuse dans un but thérapeutique et de conseil génétique.
génétiq

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III-
III- Dosages de l’urée dans l’organisme :
1- Etape pré-
pré-analytique :
a- Urée sanguine :
L'urée étant très diffusible, sa concentration est identique dans le
plasma et les globules rouges. Les résultats obtenus à partir du plasma,
du sérum, ou du sang sont équivalents.
Le prélèvement est de préférence effectué chez le sujet à jeun.
Le sang est recueilli dans des tubes avec ou sans anticoagulant.
Le fluorure de sodium est à éviter car il inhibe l'uréase utilisée dans les
techniques enzymatiques contrairement à l'iodoacétate qui ne l'affecte
pas.

b- Urée urinaire :
Le dosage est effectué, soit sur un échantillon des urines de 24 heures,
soit sur une miction.
Étant donné la consommation possible de l'urée par des germes
possédant une uréase, les urines peuvent être conservées pendant 7
jours à+4°C ou 1 mois à -20°C.

2- Techniques de dosages :
a- Techniques chimiques :
 Méthode à l’hypobromite de Na: Na:
L'urée est traitée par une solution alcaline d'hypobromite de sodium,
ce qui donne un dégagement d'azote qui est mesuré dans l'uréomètre
et comparé à l'azote dégagé, dans les mêmes conditions, par une
solution d'urée de titre connu.
La défécation du sérum est effectuée par une solution d'acide
trichloracétique.
L'appareillage était représenté par l'uréomètre d'Yvon et une cuve à
mercure. Cette technique, applicable aussi bien au sérum qu'à l'urine
n'est plus utilisée depuis longtemps, mais c'est elle qui a donné le
nom d'azotémie au taux d'urée dans le sang.

 Méthode à la diacétyl monoxime (DAM):


L'urée réagit à chaud avec la DAM, en présence d'ions ferriques,
pour former une coloration rose qui peut être sensibilisée et
stabilisée par des adjuvants tels que le thiosemicarbazide, cette
coloration peut être dosée par mesure de l’absorbance à 520 nm
(dosage colorimétrique).
Cette méthode est souvent utilisée après déprotéinisation, mais elle
peut aussi être utilisée directement. La parfaite proportionnalité
entre l'absorbance et le taux de l'urée autorise l'emploi de 2 ou 3
étalons seulement.
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SMATIQUE (AZOTEMIE)

• Le seuil de détection est de 10 PP


P
• Une courbe d’étalonnage de l’absorbance en fonction de la
concentration d’urée est tracée :

• La courbe d’étalonnage de l’urée est une droite pour une gamme


de concentrations comprise entre 0 et 30 ppb.
• La réaction chimique est la suivante :

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SMATIQUE (AZOTEMIE)

• Le facteur clé de ce dosage est la température de chauffage qui


doit être rigoureusement identique et constante pour toutes les
solutions étalons.
étalons

Cette méthode est désormais abandonnée.

b- Techniques enzymatiques :
L'urée est principalement dosée par des méthodes basées
basées sur l'action
préliminaire de l'uréase suivie de réactions auxiliaires différentes.
Les techniques enzymatiques utilisées par moins de 20% des
laboratoires
aboratoires il y a 30 ans sont aujourd'hui très largement majoritaires.

 Uréase/glutamate déshydrogénase, mesure à 340 nm :


Elles exploitent le schéma réactionnel suivant :

Dans les conditions opératoires choisies, la vitesse de disparition du


NADH est proportionnelle à la concentration d'urée dans
l'échantillon. La lecture est effectuée à 340 nm.
Cette technique
hnique peut être effectuée en cinétique ou en point final.

 Technique électrochimique :
L'uréase dégrade l'urée en NH4+ qui fait varier la conductivité. On
mesure la cinétique de la variation de la conductivité avec une
électrode sélective de conductivité.

 Technique réflectométrique :
Les plaques sont constituées de plusieurs couches réactionnelles sur
un support en polyester. La méthode analytique est basée sur
l'hydrolyse de l'urée en présence d'uréase pour donner de
l'ammoniac et du gaz carbonique. Une réaction colorimétrique
permet de déterminer par réflectométrie la concentration en
ammoniac produit.
Cette méthode analytique à l'avantage d'être spécifique, rapide et
d'éviter l'utilisation de produits corrosifs ainsi que la
déprotéinisation.

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 Méthode colorimétrique
colorimétrique de Berthelot :
Les ions ammonium produits par l'action de l'uréase réagissent en
milieu alcalin avec l'hypochlorite de Na, en présence de
nitroprussiate de Na, pour former une monochloramine qui dans un
2ème temps réagit avec deux phénols pour former un indophénol
responsable du développement de la coloration verte mesurée à
580nm.

 Technique de référence :
Une technique utilisant le couple uréase/glutamate-déshydrogénase
a été proposée par le Center for Disease Control (CDC) comme
technique de référence pour le dosage de l'urée sanguine.

IV-
IV- Application au TP (Echantillon N°105) :
1- Réactif :
R1 : Nitroprussiate de Na (catalyeur) + Uréase.
R2 : Hypochlorite de Na + NaOH.
[Etalon] = 0,5 g/l.
g/l

2- Echantillon :
Sérum (N°105
N°105).
N°105
Faire une dilution au 1/3.
1/3

3- Méthode et mode opératoire :


La méthode utilisée est celle de la méthode colorimétrique de Berthelot.
Les différentes étapes sont résumées dans le tableau suivant :

Blanc Etalon Echantillon


Eau distillée 20 µl / /
Etalon / 20 µl /
Echantillon / / 20 µl
R1 2 ml 2 ml 2 ml
Laisser à T° ambiante pendant 10mn.
R2 2 ml 2 ml 2 ml

Bien mélanger pendant quelques minutes puis lecture au


spectrophotomètre à λ=580 nm.
nm

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4- Résultats :
Les résultats obtenus sont les suivants :

ETALON ECHANTILLON
DO 0,450 0,670

 

[Urée] =    (dilution)-1
 é  

,
[Urée] =  0,5  3
,

[Urée] ≈ 1 g/l ≈ 16,67 mmol/l.


mmol/l

5- Interprétation des résultats :


Avant tous, on citera les valeurs normales de l’urémie et celle de l’uréurie.

Urémie N Urémie N
(mmol/l) (g/l)
Nouveau-
Nouveau-né (< 4 jours) 1,5 - 8,0 0,09 - 0,48
Nouveau-
Nouveau-né (> 4 jours) 1,0 - 4,2 0,06 - 0,25
Nourrisson et enfant jusqu'à 1,6 - 6,5 0,10 - 0,40
5-6 ans
Enfant de plus de 7 ans et 2,5 - 7,5 0,15 - 0,45
adulte

En ce qui concerne le taux urinaire, les valeurs normales sont comprises


entre 300 et 500 mmol/24 h (soit 18 à 30 g/24 h).

• Remarque :
Dans les pays anglo-saxons, le dosage de l'urée dans les liquides
biologiques est exprimé non par molécule d'urée mais par
concentration d'azote uréique exprimée en g/L, qu'il faut multiplier par
deux pour obtenir l'urée plasmatique en g/L.

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 Interprétation :
Les valeurs obtenues (16,67 mmol/l – 1g/l) sont supérieurs à (2x) les valeurs
usuelles ce qui pourrait résulter de deux mécanismes essentielles que sont :
 Par défaut d'excrétion rénale :
L'hyperurémie est alors nette, souvent supérieure à 16 mmol/L.
Elle est accompagnée d'une baisse de l'élimination urinaire de l'urée.
Ce défaut d'excrétion (insuffisance rénale) peut avoir plusieurs
origines :
- Origine prérénale : il peut s'agir d'une oligurie que l'on rencontre
dans les insuffisances cardiaques ou les cirrhoses ascitiques, ou d'une
déshydratation extracellulaire due à une fuite hydrosodée consécutive à
une diarrhée et/ou des vomissements.
- Origine rénale : les néphropathies aiguës (glomérulonéphrites,
pyélonéphrites), ou chroniques entraînent l'installation d'une
insuffisance rénale de façon brutale ou progressive.
- Origine post-rénale : l'insuffisance rénale est liée à la présence d'une
obstruction au niveau de l'appareil urinaire (c'est le cas, par exemple,
d'un cancer ou d'un adénome prostatique).

 Par formation excessive d'urée :


Un régime trop riche en protéines, ou un hypercatabolisme protidique
(fièvres et infections aiguës, dénutrition associée à une myolyse
importante, ou traitement par des corticoïdes) sont à l'origine d'une
augmentation de l'urée sanguine, qui s'accompagne, la fonction rénale
étant normale, d'une augmentation parallèle de son excrétion urinaire.

 Autres variations :
 Variations physiologiques :
• Les variations de l'urée dans les liquides biologiques sont très
dépendantes des apports alimentaires.
• Les nouveau-nés de plus de 4 jours et les nourrissons présentent
des concentrations d'urée plasmatiques inférieures d'environ
40% par rapport aux concentrations observées chez les adultes.
• Les valeurs élevées observées à la naissance correspondent à
l'épisode d'insuffisance rénale néonatale.
• La concentration d'urée dans le sang augmente avec l'âge. Ainsi,
après 50 ans une urémie à 8 mmol/L n'est pas considérée comme
pathologique.
• Chez la femme, l'urémie est inférieure de 25% à celle de
l'homme.Elle est abaissée au cours de la grossesse, du fait de
l'augmentation de l'espace liquidien.

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 Diminution de l’urémie :
Elle ne s'observe que rarement :
• Dans les carences importantes en protéines alimentaires (ou les
malabsorptions digestives).
• Dans les insuffisances hépatiques graves avec un effondrement •
de l'uréogenèse.
• En cas de déficit enzymatique au niveau du cycle de
l'uréogenèse.

Dans tous les cas, l'excrétion urinaire de l'urée est abaissée.

V- Applications pratiques :
1- Intérêt de la mesure conjointe de l'urée et la créatinine
sanguine :

Le dosage de l'urée en pratique clinique n'a d'intérêt qu'associé à celui


de la créatinine dans le cas d'une insuffisance rénale dont on souhaite
savoir si elle est fonctionnelle ou organique. En effet, le rapport
urée/créatinine plasmatique molaire normal est d'environ 50. Lorsque ce
rapport U/C plasmatique devient supérieur à 100, l'élévation
disproportionnée de l'urée sanguine par rapport à celle de la créatinine doit
faire rechercher soit une hyperproduction d'urée, soit une insuffisance
rénale fonctionnelle (l'urée, petite molécule facilement diffusible est
réabsorbée passivement dans la médullaire rénale dans toutes les situations
à débit urinaire faible).

2- Intérêt du dosage de l'urée urinaire

La mesure de la concentration peut servir au diagnostic différentiel


entre une insuffisance rénale organique et une insuffisance rénale
fonctionnelle. De plus, elle permet de calculer l'osmolarité des urines et son
rapport avec l'osmolarité du plasma.
La mesure de l'excrétion uréique urinaire des 24 heures permet d'évaluer
l'observance d'un régime protidique prescrit. Ce recueil devra être validé
par la comparaison avec la créatininurie des 24 heures.
Un apport protidique normal se situe entre 1 et 2 g/kg/24 h, ce qui
correspond, pour un sujet de 60 kg, à 335 à 670 mmol d'urée excrétée par 24
heures.

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