DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES POR LA TCNICA DE MILLER (DNS)

Resumen En la presente prctica se llevar a cabo la determinacin de azcares reductores. La cantidad de azcares reductores se determinar colorimtricamente aplicando el mtodo del cido dinitrosaliclico (DNS) a una gama de soluciones patrn de glucosa, a objeto de obtener la correspondiente curva de calibrado. Palabras clave: carbohidratos, azucares reductores, mtodo colorimtrico. Abreviaturas empleadas: DNS, cido dinitrosaliclico. 1. Introduccin y objetivo

Los carbohidratos son molculas formadas por carbono, hidrogeno y oxigeno. Todos los carbohidratos son azucares pequeos, solubles en agua (glucosa y fructosa, por ejemplo) o bien cadenas, como el almidn y la celulosa, que se elaboran enlazando subunidades de azcar. En la naturaleza, los carbohidratos se presentan como monosacridos (azucares simples), oligosacridos (contienen de dos a diez unidades monosacridas) y polisacridos (glcidos polimricos mas grandes). Los monosacridos se clasifican en aldosas si tienen grupo aldehdo y cetosas si tienen un grupo cetona. Todos los monosacridos, aldosas o cetosas y la mayora de los disacridos son azucares reductores (excepto la sacarosa) porque uno de sus dos carbonos anomricos no est formando enlace glucosdico. Las pruebas de Fehling y de Benedict, por ejemplo, se basan en la capacidad de los azucares reductores de reducir los iones cpricos (Cu2+) y aportan un ensayo sencillo para reconocer azucares que pueden existir como aldehdo o cetona libre. Los azucares que reaccionan se llaman azucares reductores, que pueden unirse de forma

inespecfica a otras molculas; los que no lo hacen, azucares no reductores.

El mtodo DNS es una tcnica colorimtrica que emplea 3,5-cido dinitrosaliclico para la hidrlisis de polisacridos presentes en una muestra, seguido de la determinacin espectrofotomtrica a 540nm de los azcares reductores. Esta tcnica sirve para cuantificar los azucares reductores producidos durante una fermentacin o para cuantificar los productos de una reaccin enzimtica.

Objetivo: Construccin de una curva patrn para calcular el coeficiente de correlacin mediante el mtodo DNS. 2. Material

3.1. Material * * Tubo de ensaye con rosca (25) * Gradilla para tubos (1) * Probeta de 100mL (1) * Vasos de pp de 100mL (2) * Pipetas de 1mL (2) * Pipetas de 2mL (2) * Pipetas de 5mL (2) * Pipetas de 10mL (2) * Matraz aforado de 100mL (1) * Matraz aforado de 250mL (1) * Bao Mara (1) * Piseta con agua destilada (1) * Agitador magntico (1) * Termmetro (1) * Frasco mbar (1)

* Celdas para espectrofotmetro (2) * Papel seda 3.2. 3.3. Equipo * * Vrtex * Parrilla de agitacin y calentamiento * Espectrofotmetro 3.4. 3.5. Reactivos * * Acido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) * Hidrxido de sodio anhidro (NaOH) * Fenol (C6H6O) * Sulfito de sodio anhidro (Na2SO4) * Glucosa (C6H12O6)

3. Mtodo

4.6. Reactivo DNS Disolver 2.5g de DNS, 2.5g de NaOH, 0.125g de Na2SO4 y 0.5g de C6H6O en
200mL de agua destilada. Aforar a 250mL con agua destilada. Colocar la solucin en el frasco mbar y etiquetarla. 4.7. Solucin patrn de glucosa (1.0g/L) Disolver 0.1g de glucosa en 90mL de agua destilada, agitar hasta disolver y aforar a 100mL. 4.8. Curva patrn A partir de una solucin de glucosa y por dilucin con agua destilada, preparar una gama

de soluciones de glucosa de distinta concentracin (por duplicado), como se indica en el anexo (An1; Tabla 1). A cada uno de los tubos, adicionar 1mL del reactivo DNS y agitar con el Vrtex. Poner en bao Mara en ebullicin durante 5 minutos, enfriar, agregar 8mL de agua destilada y determinar la absorbancia a 575nm, utilizando como blanco el tubo 1.

4. Resultados

En el anexo (An2) se reportan los valores de las absorbancias obtenidas (tabla 2); la media de cada duplicado, la desviacin estndar y l % de error (tabla 3).

La Grafica 1 muestra la curva patrn obtenida a partir de los datos experimentales (los valores representados son el promedio de las absorbancias por duplicado); ajustndola a la recta se obtuvo la ecuacin:

y= 0.0442x 0.0508

donde la pendiente (m) es 0.0442 y la ordenada al origen (b) es 0.0508.

R = 0.9921

5. Discusin La absorbancia es directamente proporcional a la concentracin del material que absorbe la luz

6. Cuestionario 1. Explique el fundamento de la tcnica de DNS. Se basa en la reduccin del DNS (de color amarillo) por la glucosa u otro azcar reductor

al cido 3-amino-5-nitrosaliclico (de color rojo), cuya presencia puede detectarse por lectura de la Absorbancia en la zona de 540-570nm.

2. Para que se utiliza el NaOH, el fenol y el sulfito de sodio en la tcnica de DNS?

Los carbohidratos son particularmente sensible a cidos fuertes y altas temperaturas. Bajo estas condiciones una serie de reacciones complejas toman lugar empezando con una deshidratacin simple, si se contina el calentamiento y la catlisis cida se producen varios derivados del furano que condensan consigo mismos y con otros subproductos para producir compuestos coloridos producto de la condensacin de compuestos fenlicos y con heterociclos con el nitrgeno como heterotomo. La condensacin ms comn es con fenol. Este mtodo es fcil, eficaz y rpido. Todos los azcares como oligosacridos y polisacridos pueden ser determinados, recordando que stos bajo hidrlisis cida producen monosacridos. La forma en que procede la reaccin no es estequiomtrica y depende de la estructura del azcar, por lo tanto se realiza una curva patrn. 3. Porque es importante esta tcnica en microbiologa?

Sirve en la aplicaciones industriales las cuales hay varios microorganismos que desarrollan varias rutas, lo que hace la tcnica DNS en corresponder a la gama de azucares reaccionando en su metabolismo donde degradan azcar para convertirlo en ATP, ya que varios microorganismo sirven para la produccin de vinagre, vinos , mantequilla , yogurt y pan enfatizando ayuda a precisar una reaccin enzimtica.

4. Que interferencias puede tener este mtodo?

Una de las cuales pueda ser que el blanco, se encuentre contaminado, o en su defecto que la a cantidad de solubilidad de agua con el gradiente de glucosa se en mayor

proporcin que la del soluto, haciendo que los valores de la observancia se alteren.

5. De algunos ejemplos de azucares reductores y explique porque la sacarosa no es un azcar reductor.

La sacarosa no es un azcar reductor porque tiene los dos carbonos anomricos formando parte del enlace que une los dos monosacridos.

6. Que es la glucosilacin avanzada?

Los azcares reductores provocan la alteracin de las protenas mediante la reaccin de glucosilacin no enzimtica tambin denominada reaccin de Maillard o glicacin.

Desde el punto de vista qumico, la glucosilacin se define como la reaccin de grupos amino primarios de aminocidos, pptidos y protenas con el grupo carbonilo de los azcares reductores. A lo largo de esta reaccin se pueden distinguir tres etapas: inicialmente se produce la asociacin del azcar con la protena, formando un compuesto denominado base de Schiff.

7. Explique con un esquema de reaccin como se forman los compuestos bicarbonlicos. Esta reaccin se basa con la base de Schiff que da como subsecuente producto de Amadori.

Anexo An1.

Tabla 1. Gama de soluciones de glucosa de diferente concentracin. | Tubo | Volumen de laSolucin Patrn (mL) | Volumen de Agua(mL) | Concentracin(mg/L) | 1 | 0.0 | 1.0 | 0.0 | 2 | 0.1 | 0.9 | 100 | 3 | 0.2 | 0.8 | 200 | 4 | 0.3 | 0.7 | 300 | 5 | 0.4 | 0.6 | 400 | 6 | 0.5 | 0.5 | 500 | 7 | 0.6 | 0.4 | 600 | 8 | 0.7 | 0.3 | 700 | 9 | 0.8 | 0.2 | 800 | 10 | 0.9 | 0.1 | 900 | 11 | 1.0 | 0.0 | 1000 | An2. Tabla 2. Absorbancia reportada (575nm) | Tubo | Absorbancia | Tubo | Absorbancia | 1 | Blanco | 12 | - | 2 | 0.041 | 13 | 0.056 | 3 | 0.043 | 14 | 0.084 | 4 | 0.115 | 15 | 0.149 | 5 | 0.169 | 16 | 0.179 | 6 | 0.211 | 17 | 0.206 | 7 | 0.254 | 18 | 0.242 | 8 | 0.320 | 19 | 0.293 | 9 | 0.324 | 20 | 0.368 | 10 | 0.393 | 21 | 0.393 | 11 | 0.423 | 22 | 0.497 | Tabla 3. Media de absorbancias por duplicado, desviacin estndar y % de error | Media | DesviacinEstndar | % deerror | 0||| 0.04 | | | 0.06 | | | 0.13 | | | 0.17 | | |

0.20 | | | 0.24 | | | 0.30 | | | 0.34 | | | 0.39 | | | 0.46 | | | Concentracin(mg/L) | PromedioAbsorbancia575nm | 0.0 | 0 | 100 | 0.04 | 200 | 0.06 | 300 | 0.13 | 400 | 0.17 | 500 | 0.20 | 600 | 0.24 | 700 | 0.30 | 800 | 0.34 | 900 | 0.39 | 1000 | 0.46 | Grafica 1. Curva patrn para la determinacin de azucares reductores (DNS) Conclusin Debido a nuestros resultados nos damos cuenta que Referencias bibliogrficas (Chaplin, 1986), Kowluru, R.A., Heidorn, D.B., Edmondson, S.P., Bitensky, M.W., Kowluru, A., Downer, N.W., Whaley, T.W., Trewhella, J. Glycation of calmodulin: chemistry and structural and functional consequences. Biochemistry 28,2220-2228,1989 The Glycation Homepage (www.geocities.com/CapeCanaveral/8824/) 78 ways sugar can ruin your health (www.rheumatic.org/sugar.htm) Maillard Reaction (chemistry.miningco.com/library/weekly/aa122898.htm)