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La physiologie bactrienne consiste tudier: La Nutrition Le Mtabolisme La croissance des bactries en fonction des variations (naturelles ou contrles) du milieu dans lequel elles vivent.
DEFINITIONS
Nutrition bactrienne : cest l'analyse des besoins lmentaires , nergtiques et spcifiques ncessaires au fonctionnement et la croissance de la bactrie , ainsi que des facteurs physico-chimiques susceptibles de les influencer . Mtabolisme biochimique bactrien : Cest lensemble des transformations chimiques ( anabolisme ou biosynthse et catabolisme ou dgradation) qui assurent llaboration des constituants bactriens et leur fonctionnement . Croissance bactrienne : Cest l'accroissement ordonn de tous les composants de la bactrie. Elle se manifeste par une augmentation numrique des cellules bactriennes et non pas une augmentation de taille comme chez les organismes suprieurs ( homme, animal, plante).
NUTRITION BACTERIENNE
nergie
1.Besoins lmentaires:
Leau En grande quantit : l'oxygne, l'hydrogne ,l'azote, le carbone le phosphore et le soufre, En quantit plus faible: des ions minraux (Mg,K,Cl,Fe,Co...) Sous forme de traces: des oligolments (Cu,Zn,Mn,...).
H20
Besoin majeur , il entre dans la composition de tous les milieux de culture . Cest une source dH2 et dO2.
, Phosphore , Soufre
Le Carbone : un des lments les plus abondants de la bactrie Le plus simple des composs carbons est le CO2 On distingue les bactries en 2 catgories : - capacit de dveloppement en milieu inorganique contenant le CO2 comme seule source de Carbone : Bactries AUTOTROPHES (Stricte/ CO2 obligatoire , Facultatif /CO2 ou compos organique) ex. bactries photosynthtiques - Exigence en composs organiques comme source de carbone : bactries HETEROTROPHES ( capacit de dgrader une panoplie de substances hydrocarbones : Alcool , acide actique , acide lactique (molcules simples) , polysaccharides (complexes). LAzote : entrent dans la composition des protines bactriennes. Lazote peut tre fix par la bactrie : z sous forme dazote molculaire ex. les Rhizobium Azotobacter et certains Clostridiums. z Sous forme de composs inorganiques : ex. NO2- par les Nitrobacter z Sous forme de composs organiques R-NH2 dont les groupements amins reprsentent la source dazote . Phosphore : Il entre dans la composition des acides nucliques , de nombreux coenzymes et de lATP . Il est incorpor dans la bactrie sous forme de Phosphate inorganique . Il permet la rcupration , laccumulation et la distribution de lnergie dans la cellule . Soufre : Il entre dans la composition des acides amins , des protines ( groupement thiol ) . Il est incorpor dans la cellule sous forme de sulfate , de composs soufrs organiques , rarement sous forme de soufre rduit.
2.Besoins nergtiques
Ils couvrent les dpenses engages dans les processus catabolisme et de biosynthse . Les bactries peuvent utiliser comme source d'nergie soit l'nergie lumineuse (bactries Phototrophes), soit l'nergie fournie par les processus d'oxydo-rduction (bactries Chimiotrophes).
Les bactries Phototrophes font appel des composs minraux ou organiques comme sources d'lectrons. Si le substrat oxydable est minral, la bactrie est dite Photolithotrophe :elle est capable de se dvelopper dans un milieu purement minral comme le font les vgtaux :exemple les bactries sulfureuses pourpres ou vertes. Si le substrat oxydable est organique, la bactrie est dite Photoorganotrophe :exemple les bactries pourpres non sulfureuses.
Dans les ractions REDOX, les bactries Chimiotrophes utilisent des composs minraux ou organiques comme "donneurs ou "accepteurs d'lectrons". Si le donneur dlectrons est un corps minral, la bactrie est dite Chimiolithotrophe, ex. bactrie oxydant lhydrogne . Si le compos est organique , la bactrie est dite Chimioorganotrophe ( bactries pathognes dintrt mdical, de contamination alimentaire, d'usage industriel )
3. Substances spcifiques:
Ce sont des mtabolites essentiels dont certaines bactries ont besoin et qu'elles sont incapables de synthtiser par dfaut enzymatique. On les appelle Facteurs de croissance. Ils peuvent appartenir la classe des Acides amins ,des bases puriques et pyrimidiques ou des vitamines. Les besoins quantitatifs sont de l'ordre de 10 microgrammes pour la 1re et la 2me classe et de l'ordre de 1 microgramme pour la 3me classe. Les facteurs de croissance prsentent des caractres communs: - ils sont actifs concentration infime - ils sont troitement spcifiques
Les bactries exigeant des facteurs de croissance sont appeles : Bactries Auxotrophes . Les bactries non exigeantes sont dites : Bactries Prototrophes. Exemples : E.Coli est une bactrie prototrophe : n'exigeant aucun facteur de croissance, elle se multiplie sur milieu minimum. Haemophilus influenzae est une bactrie auxotrophe. Elle ne peut cultiver dans un milieu minimum car il lui manque dans son systme enzymatique les enzymes ncessaires la synthse du facteur V (coenzyme I et II) et du facteur X (Hmine).
ETUVE BACTERIOLOGIQUE
Le pH
Les bactries prfrent un pH neutre ou lgrement alcalin (7 7.5). Exemples : E.coli cultive entre pH 4.4 et pH8 Lactobacillus acidophilus cultive mieux pH 6 Vibrio cholerae se multiplie au pH optimal de 9 Solutions Tampons : Ils sont inclus dans les milieux de culture bactriologiques afin dviter les brusques variations de pH dues aux modifications chimiques qui rsultent de la dgradation de substrats. Les tampons phosphates (K2HPO4 et KH2PO4) sont les plus utiliss parce quils permettent de garder le pH dans une large zone autour de 7 , parce quils ne sont pas toxiques et quils reprsentent une source de phosphore.
La Pression Osmotique
Grce une paroi spcifique des procaryotes ( Murine) qui leur confre une rigidit et une rsistance aux chocs , les bactries tolrent des variations de concentrations ioniques . Certaines bactries tolrent des concentrations salines importantes ex. Enterococcus (6.5% Nacl) Staphylococcus aureus ( 7.5%Nacl)
Glose VF (Viande-Foie)
1 2 3 4
Arobie Stricte
MicroArophile
ArobieAnarobie facultative
Anarobie Stricte
Dfinition :
Le milieu de culture doit apporter la bactrie un mlange quilibr de tous les nutriments ncessaires, des concentrations qui permettent une croissance optimale, cest dire : ni trop faible, sinon le milieu sappauvrit vite et la bactrie cultive mal ; ni trop forte sinon le milieu devient vite toxique. La composition du milieu de culture varie linfini. Elle est choisie en fonction du but atteindre et des besoins requis par la bactrie. Le milieu peut tre liquide ou solidifi par addition dAgar : Cest une substance extraite dalgues marines et qui possde la proprit de fixer une grande quantit deau do glification.
CRITERES de Classification
Composition chimique
Synthtiques
Composition chimique bien dfinie Exemple :Citrate de Simmons
de Matire Organique + Glucose -Exemples : Glose nutritive -Types : Extraits de Levure Peptones pepsiques Peptones trypsiques Peptones pancratiques
Consistance
z milieu z milieu
Chapman)
z milieu
Utilisation
les milieux usuels ou de base (ex. glose nutritive , bouillon nutritif) z les milieux enrichis (ex. glose au sang , Bouillon pour Hmoculture ) z les milieux slectifs ou lectifs (ex. glose Hektoen) z les milieux didentification (ex. milieu TSI) z les milieux de conservation z les milieux de transport (milieu T.G.V.)
z
CROISSANCE BACTERIENNE
1- Dfinition
Cest laccroissement ordonn de tous les composants dun organisme. Chez les bactries (organismes unicellulaires), elle aboutit une augmentation du nombre dindividus . Il y a multiplication dune bactrie, donnant naissance par scissiparit , 2 nouvelles bactries identiques . On dfinit le Temps de gnration comme le temps requis pour un ddoublement du nombre de bactries. ex. E.coli :TG= 20mn M.tuberculosis : TG= 20 h On dfinit le Taux de croissance comme le nombre de divisions par unit de temps (ex. 3 pour E.coli). Au cours de la croissance, le milieu sappauvrit en lments nutritifs disponibles et senrichit en produits du catabolisme, souvent toxiques . Des modifications touchent le pH, le potentiel Redox , la pression osmotique
Mesure automatise avec un compteur de particules , des bactries en suspension dans une solution dlectrolyte Mthode dpifluorescence ( Acridine Orange)
Inconvnient : - Plusieurs cellules agglomres peuvent ne donner quune seule colonie. - De nombreuses cellules isoles ne forment pas ncessairement de colonie.
Inconvnient : toute la masse cellulaire est mesure . De plus , cest une technique longue et dlicate.
b-2- Mesure de la Densit optique (DO) : On value la DO du milieu de croissance en fonction du temps , une longueur donde donne . La mesure de la D.O. se fait une longueur d'onde allant de 450 550nm et les cultures bactriennes sont dilues de faon obtenir des D.O. infrieures 0,4 ( les DO voluent linairement la concentration cellulaire).
c- Marqueurs chimiques :
Il sagit de dosage des protines , DNA , ATP, peptidoglycane ..
L'utilisation des log de base 2 facilite cette reprsentation: La courbe de croissance obtenue montre alors 6 phases:
Phase A: Phase de latence Phase B : Phase d'acclration Phase C: Phase de croissance exponentielle : Le taux de croissance atteint la valeur maximale . Phase D: Phase de ralentissement Phase E: Phase stationnaire: La masse bactrienne est maximale . Phase F: Phase de dclin: La masse bactrienne dcrot du fait de la lyse acclre des bactries.
1- Dfinition :
Il est dfini comme l'ensemble des transformations chimiques (ractions de biosynthse et de dgradation), qui assurent l'laboration des constituants bactriens et leur fonctionnement. Grce un quipement enzymatique trs complet, toutes les ractions chimiques du mtabolisme bactrien sont catalyses par des enzymes spcifiques. L'tude du mtabolisme bactrien permet de dfinir des caractres d'identification biochimique qui reprsentent des critres essentiels dans la classification (ou Taxonomie) bactrienne.
Les ractions cataboliques permettent la bactrie de convertir les aliments mis sa disposition ( Protines , Lipides , Polysaccharides) en molcules organiques simples ou en mtabolites intermdiaires , avec production dnergie sous forme de liaison phosphate ADP Pi . Les liaisons anaboliques sont les voies de biosynthse que la bactrie emprunte partir de ces molcules simples pour synthtiser des macromolcules intervenant dans la structure et le fonctionnement bactrien . Lnergie utilise dans ces biosynthses provient du catabolisme .
Le mtabolisme nergtique dune bactrie chimioorganotrophe est constitu dune suite de ractions REDOX avec libration dnergie , partant dun substrat organique . Le compos organique peut tre : un hydrate de carbone ( surtout le glucose) source la plus importante dnergie un acide amin un acide gras un alcane une base purique ou pyrimidique
Les ractions redox productrices dnergie sont intgres dans 2 types de processus nergtiques : La Fermentation et la Respiration
La fermentation a t dfinie par Pasteur comme la vie sans air . Cest une oxydation biologique au cours de laquelle laccepteur final dH2 et d est un compos organique. Ce compos peut tre prsent dans le milieu ou provenir de la dgradation dun substrat oxydable . Les voies fermentaires se droulent au sein du cytoplasme bactrien. Lnergie est produite par Phosphorylation au niveau du substrat. Le bilan nergtique est rduit.
La Respiration est lensemble des voies mtaboliques au cours desquelles loxygne molculaire ou des composs oxygns inorganiques ou ioniques jouent le rle daccepteur dlectrons et dH2 dans les ractions redox. Ces voies sont lies la membrane cytoplasmique de la bactrie. Lnergie est produite par phosphorylation dite oxydative et libre par paliers via une chane de transfert dlectrons ; Le bilan nergtique est lev.
2-3- La respiration :
Le Pyruvate est le point daboutissement oblig de toutes les voies de dgradation du Glucose et des voies doxydation de nombreux acides amins. Il est transform en Acetyl~CoA par dcarboxylation oxydative.
ADP
ATP
ADP
ATP
ADP
ATP
* NAD : Nicotinamide Adnine Dinuclotide ou Coenzyme I : Coenzyme fonctionnant comme transporteur dhydrogne dans de nombreuses ractions redox. La molcule dH2 est porte sur le rsidu Nicotinamide. Forme oxyde :NAD+ Forme rduite : NADH + H+ (N.B. NADP= Coenzyme II) * FP : Ce sont des protines de haut poids molculaire contenant des flavines comme groupement prosthtique . Appartiennent aux FP la Flavine mononuclotide (FMN) et Flavine Adnine dinuclotide (FAD). Ces flavoprotines ont pour fonction daccepter lH2 qui provient du NADH. * Ubiquinone ou Coenzyme Q : transporteur dhydrogne , non li une protine.
* Cytochromes : Systmes redox qui transfrent des lectrons et ne sont pas capables de transporter de lhydrogne. Ce sont des protines dont le groupement prosthtique est une protoporphirine portant un atome de fer central qui participe au transport lectronique. Cette protoporphirine sappelle Hme quand le fer est ltat Fe++ (ferreux) et Hmine lorsque le fer est ltat Fe+++ (oxyd ou ferrique). De nombreux cytochromes ont t dcrits chez les bactries : a , a3 , b, c , o. Le cytochrome terminal qui joue le rle daccepteur final dlectron est appel Cytochrome Oxydase. Au cours de la respiration , il y a dgagement important dnergie puisquil y a oxydation du substrat jusquau stade H20+C02 . De ce fait , lnergie , trop importante pour tre libre dun seul coup, est libre par palier au cours dune succession de ractions redox allant de la rduction du NAD puis dune flavoprotine et dune ubiquinone avec transfert dlectrons et de protons jusqu laccepteur final , les lectrons tant transfrs seuls par les cytochromes .
La respiration se fait donc en 2 tapes : 1) Le cycle tricarboxylique de Krebs , avec libration de CO2 par oxydation couple la rduction de 3 NAD+ et de 1 FAD+ par tour de cycle . 2) La chane respiratoire avec coenzymes de dshydrognases , Quinones et Cytochromes .
Selon laccepteur final dlectrons et dH2 , on peut distinguer : 1) Dans la respiration arobie , laccepteur final est lO2 2) Dans la respiration anarobie , laccepteur final est un compos inorganique ou ionique (NO3fumarate)
Les Enterobacteries VP+ , Listeria monocytogenes,la plupart des Vibrio et Aeromonas possdent , ct du mode de fermentation Acides Mixtes, une voie fermentaire particulire, dite Butandiolique ou Butylne glycolique. Cette voie aboutit la libration d'un produit neutre: Le 2,3 Butylne Glycol.
Fermentation lactique :
On distingue 3 modles: - Fermentation Homolactique : retrouve chez les Streptocoques : C'est une fermentation sans production de gaz et s'accompagnant d'une diminution importante du PH du milieu. - Fermentation Htrolactique: retrouve chez les Lactobacilles, Comprend une production importante de CO2 et un PH bas. - Fermentation Aceto-lactique: retrouve chez des bactries du genre Bifidobacterium , s'accompagne de la production d'un mlange d'acide lactique et actique.
* Fermentation Alcoolique:
C'est une fermentation retrouve chez les champignons et les cellules vgtales.
* Fermentation Butyrique :
Elle aboutit l'Acetate , le Butyrate, H2 et CO2 et qui est retrouve chez les Clostridies dits Saccharolytiques
2-5-3- Recherche de la catalase : on met en prsence une colonie microbienne et une goutte deau oxygn sur une lame . Lapparition de bulles dair signe la prsence dune catalase . Attention : ne pas prlever la culture partir dune glose au sang.
Catalase -
Catalase +
GN non ensemence
Staphy.aureus
Enterococcus faecalis
2-5-4- Test de GRIESS-ILOSWAY : Bouillon Nitrate 1%o KNO3 ensemenc partir de la souche tudier Ractifs de rvlation : Acide Sulfanilique et alpha-naphtylamine Poudre de Zinc
2-5-4- Etude de la voie fermentaire des Acides complexes: Bouillon CLARK et LUBS
Bouillon CLARK et LUBS inocul par une goutte dune suspension trouble de bactries. Aprs 18h 37C, on divise le bouillon dans 2 tubes striles. Chaque tube sert rvler une des 2 voies : - Voie des Acides mixtes : Addition dune goutte de ROUGE de METHYL (test au RM) - Voie Butylne-Glycolique : Addition de 2 gouttes de KOH 10% et dAlpha-naphtol ( Raction de VOGES-PROSKAUER)
2-5-5- Utilisation du Citrate comme seule source de Carbone : Milieu au Citrate de SIMMONS ou au Citrate de KRISTENSEN
Test ngatif
Test positif
3- Mtabolisme Glucidique :
3-1- LAuxanogramme : Etude dune gamme de sucres dgradables par la bactrie (en milieu liquide ou solide) 3-2- Ltude de lattaque des sucre en :
- Milieux glucidiques gloss simples : glose + sucre + indicateur de pH (exemple : le milieu Mannitol-mobilit-nitrate ) - Milieux gloss glucidiques complexes : TSI (Tri-Sugar-Iron ) et KIA (Kligler-Iron-agar) Ce sont des gloses inclines avec pente +culot : 1%o Glucose et 10%o Lactose et Saccharose Lindicateur de pH est le Rouge de Phnol
Mannitol-Mobilit
T.S.I.
Avant ensemencement
Shigella sonnei
Pseudomonas sp.
4- Mtabolisme Protidique :
NH2
H2S +
Indole -
Indole +
Ure +
Ure -
2me temps : Acidification de tous les tubes par attaque du glucose: Tous les tubes virent au jaune
3me temps : Dcarboxylation et libration de catabolites alcalins do virage au bleu violacle tube tmoin reste jaune Lecture : tube jaune : ngatif tube violet : positif
5- Mtabolisme lipidique :
Lipase : enzyme qui hydrolyse les esters dacide gras longue chane carbone.
Test de laboratoire : Technique de SIERRA : Comme ester dacide gras utilis au laboratoire , on distingue les TWEEN qui sont des Esters de Sorbitol et dAcide gras.
2- L'Antibiothrapie: Les modifications de la courbe de croissance permettent de mesurer l'activit anti-bactrienne d'un nouvel antibiotique sur une bactrie donne. 3- Lefficacit de la strilisation: L'tude de la courbe de croissance permet de vrifier la vitesse de destruction des bactries par la chaleur , les UV, ou d'autres agents physiques ou chimiques. 4- L'industrie: -Dosage microbiologique des vitamines et autres substances qui sont des facteurs de croissance pour les bactries, - Culture de grandes quantits dantibiotiques, d'enzymes et de vitamines grce la croissance en milieu de culture renouvel, - Culture de grandes quantits de bactries destines l'alimentation en particulier animale (gnie gntique).
Bass sur le principe de dtection dun produit du mtabolisme biochimique ; Exemple : Dtection du CO2 dorigine bactrienne Lun des automates les plus rcent : BACT/ALERT Microbial Detection System (Biomerieux) , bas sur la dtection par technique colorimtrique.
6- Les Biofilms:
Dans les habitats naturels, les bactries sont attaches des surfaces , plus souvent que libres en suspension dans un milieu liquide. Ainsi, les bactries attaches des surfaces sorganisent en communaut en sentourant dune matrice de polymres organiques : le Biofilm Cest sous cette forme que les bactries colonisent les matriel dexploration ou de soin : Endoscopie, cathters , sondes respiratoires ou urinaires. Elles seraient protges des agents antimicrobiens car elles se trouvent au repos ou dans un tat de latence peu propice laction des antimicrobiens . Les bactries des bio films imposent une rflexion en matire d hygine hospitalire, de prvention et de dsinfection du matriel de soin .
Bibliographie 1- Leclerc H. , Gaillard J.L., Simonet M. Microbiologie gnrale :La Bactrie et le monde bactrien Edition DOIN 1995 2- Marchal N., Bourdon J.L. , Richard CL .Les Milieux de culture pour lisolement et lidentification biochimique des bactries , dition DOIN 1991 3- Olds R.J. Atlas en couleurs de Microbiologie dition MALOINE 1979 4- Consultez les liens disponibles dans le site du Rseau AARN (Algrian Antimicrobial Resistance Network) que vous trouverez ladresse Internet : WWW.sante.dz