GUIA GENERAL PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS

Cabeza Herrera, E.A., Ortiz Lemuz, J.F. Universidad de Pamplona, Facultad de Ciencias Bsicas, Departamento de Microbiologa. Campus Universitario, Km. 1 Va Bucaramanga.

La presente gua presenta de forma ilustrada los diferentes mtodos para el recuento en placa de microorganismos en alimentos. Se trata de un resumen adaptado de la norma tcnica colombiana NTC 4092 y de las recomendaciones que se manejan en el Instituto Nacional de Salud de Colombia y avaladas por el Ministerio de la Proteccin Social (Antes Ministerio de Salud). Para el mtodo de recuento de microorganismos por la tcnica del nmero ms probable consulte la NTC-4092.

RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS (ICONTEC). La presente gua de recuento de microorganismos en alimentos est basada en la Norma Tcnica Colombiana NTC-4092. Esta norma establece directrices generales para realizar anlisis microbiolgicos de conformidad con normas internacionales (ISO 7218 de 1997). 1. CONSIDERACIONES GENERALES: Para la correcta aplicacin de esta norma la preparacin de la muestra es fundamental, por lo tanto se requiere que la siembra se realice a partir de dos diluciones consecutivas y por duplicado adems de inocular los volmenes correctos (0,1 ml para superficie bajo ciertas circunstancias se puede inocular 0,2 ml, 0,5 ml o 1 ml en superficie para muestras que se consideren con un bajo recuento y cuando el medio de cultivo empleado tenga la capacidad de embeber dicho volumen y 1 ml para profundidad). RANGOS PARA EL RECUENTO: Despus del periodo especificado de incubacin se cuentan las unidades formadoras de colonias UFC presentes en las cajas que contengan entre 15 UFC y 300 UFC, los anlisis que aplica dicho rango son: Aerobios mesfilos; coliformes, recuento de bacterias termfilas, proteolticas, lipolticas, Clostridium sulfito reductores, S. aureus, B. cereus, etc. Excepto para aquellas bacterias cuya norma exige presencia o ausencia. Despus del periodo especificado de incubacin se cuentan las unidades formadoras de colonias UFC presentes en las cajas que contengan entre 15 UFC y 150 UFC para Mohos y levaduras, levaduras osmoflicas.

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RECUENTO Y EXPRESIN DE RESULTADOS: A). CASO GENERAL: Se calcula el nmero N de microorganismos presentes en la muestra, a partir del recuento de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una de las dos cajas de cada dilucin est dentro del rango, usando la siguiente frmula: N=

C , donde: V (n1 + (0.1 * n 2))d

C: Es la Sumatoria del nmero de colonias contadas en cada caja examinada de

las diluciones sucesivas. V: Volumen de muestra inoculada en cada caja. n1: Nmero de cajas retenidas de la primera dilucin. N2: Nmero de cajas retenidas de la segunda dilucin. d: Factor de dilucin correspondiente a la primera dilucin retenida. 0,1= constante de correccin. Se redondea el resultado calculado a dos cifras significativas. Para esto si la ltima cifra es inferior a 5 la cifra anterior no se modifica; si la ltima cifra es 5 o mayor, la cifra anterior se incrementa en una unidad. Se prosigue as hasta que se obtengan dos cifras significativas. Los resultados se expresan en UFC por gramo o mililitro de producto segn la naturaleza del mismo, expresado como un nmero entre 1,0 y 9,9 (Dos cifras significativas, un entero y un decimal) multiplicado por 10X donde x es la potencia apropiada de 10. Ejemplo: A partir de un anlisis de aerobios mesfilos para una leche pasteurizada se obtuvieron los siguientes resultados:

N: Nmero total de UFC por gramo o mililitro de muestra.

N=

en la primera dilucin seleccionada (10-2): 168 UFC y 215 UFC. en la segunda dilucin seleccionada (10-3): 14 UFC y 25 UFC.

168 + 215 + 25 1(2 + (0.1 *1))0,01 408 = 19.428,57 N= 0,021 Al redondear la cifra como se especific anteriormente, se obtiene como resultado 19.000, expresado con dos cifra significativas 1,9x104 UFC por mililitro.

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B). MTODO DE CLCULO PARA RECUENTOS DE MICROORGANISMOS QUE REQUIERAN CONFIRMACIN POSTERIOR: (Por Ejemplo S. aureus coagulasa positiva, B. cereus.) Se calcula el nmero N de microorganismos presentes en la muestra, a partir del recuento de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una de las dos cajas de cada dilucin est dentro del rango. En este caso es necesario confirmar de cada una de las cajas un nmero representativo de colonias tpicas (generalmente 5). Antes de calcular el informe final es necesario aplicar un factor de correccin a cada una de las cajas retenidas mediante la siguiente frmula: a=

b * C , donde: A

b: Nmero de colonias identificadas como positivas de acuerdo al criterio microbiolgico. A: Nmero de colonias examinadas C: Nmero total de colonias tpicas contadas en cada una de las cajas retenidas. Para expresar el resultado final se aplica la siguiente formula: a N= , donde: V (n1 + (0.1 * n2))d N: Nmero total de UFC por gramo o mililitro de muestra. a: Sumatoria del nmero de colonias tpicas corregidas en cada caja examinada. V: Volumen de muestra inoculada en cada caja. n1: Nmero de cajas retenidas de la primera dilucin. N2: Nmero de cajas retenidas de la segunda dilucin. d: Factor de dilucin de la primera dilucin retenida. 0,1= constante de correccin. Se redondea el resultado calculado a dos cifras significativas. Para esto si la ltima cifra es inferior a 5 la cifra anterior no se modifica; si la ltima cifra es 5 o mayor, la cifra anterior se incrementa en una unidad. Se prosigue as hasta que se obtengan dos cifras significativas. Los resultados se expresan en UFC por gramo o mililitro de producto segn la naturaleza del mismo, expresado como un nmero entre 1,0 y 9,9 multiplicado por 10X donde x es la potencia apropiada de 10. Ejemplo: A partir de un anlisis de S. aureus coagulasa positiva en un queso se obtuvieron los siguientes resultados:

en la primera dilucin seleccionada (10-3): 66 UFC y 80 UFC. en la segunda dilucin seleccionada (10-4): 4 UFC y 17 UFC.

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GUIA GENERAL PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS Factor de correcin: Colonias contadas en c/caja (C): Colonias examinadas (A): Colonias positivas (b):

66 y 80 UFC. 6 y 8 4 y 5

4 y 17 UFC. 4 y 5 4 y 3

a=

4 * 66 6

a=

5 * 80 8

a=

4 *4 4

a=

3 * 17 5

a= 44 col. Informe: N=

a= 50 col. a= 4 col.

a= 28 col.

a V (n1 + 0.1 * n2)d

N=

44 + 50 + 28 0,1(2 + (0.1 *1))0,001 122 N= = 580.952,38 0,00021

Al redondear la cifra como se especific anteriormente, se obtiene como resultado 580.000, expresado con dos cifra significativas 5,8x105 UFC por gramo. C). CASOS ESPECIALES: CASO 1: Cuando el nmero de UFC se encuentran por debajo del rango mnimo en ambas cajas de una o las dos diluciones consecutivas, se informar as: Se descarta el recuento obtenido en la mayor dilucin y se calcula la media aritmtica de las colonias presentes en las dos cajas de la menor dilucin multiplicndose por el inverso de la dilucin y se informa el resultado como sigue: Conteo estimado de UFC por gramo o mililitro (Teniendo en cuenta la forma de informar el resultado final: dos cifras significativas por.....)

CASO 2: Ausencia de crecimiento, si las dos cajas correspondientes a primera dilucin, se informa el resultado como sigue:

la

< 1x10X UFC por gramo o mililitro segn corresponda.

NOTA: cuando el conteo de colonias exceda el mximo del rango se recomienda repetir el anlisis empleando diluciones mayores para obtener un resultado ms confiable, o reportar como TNTC (too numerous to count = Muy numeroso para contar).

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RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS (Recomendaciones del Instituto Nacional de Salud y Ministerio de la Proteccin Social de Colombia). La presente gua de recuento de microorganismos en alimentos est basada en las recomendaciones del Instituto Nacional de Salud y avaladas por el Ministerio de la Proteccin Social de Colombia y del instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos INVIMA-. Esta gua establece directrices generales para realizar recuentos de anlisis microbiolgicos de conformidad con las normas nacionales. 1. CONSIDERACIONES GENERALES: Para la correcta aplicacin de esta norma la preparacin de la muestra es fundamental, por lo tanto se requiere que la siembra se realice a partir de dos diluciones consecutivas y por duplicado adems de inocular los volmenes correctos (0,1 ml para superficie y bajo ciertas circunstancias se puede inocular 1 ml en superficie para muestras que se consideren con un bajo recuento y 1 ml para profundidad). RANGOS PARA EL RECUENTO: Despus del periodo especificado de incubacin se cuentan las unidades formadoras de colonias UFC presentes en las cajas que contengan entre 30 UFC y 300 UFC, los anlisis que aplica dicho rango1 son: Aerobios mesfilos; coliformes, recuento de bacterias termfilas, y en general para anlisis de microorganismos donde no se observan reacciones enzimticas ni de crecimiento sobre la superficie del Agar. Para el recuento de estos ltimos microorganismos se emplea el rango de 20 UFC 200 UFC, por ejemplo para: S. aureus, B. cereus, etc. Para el recuento de Mohos y Levaduras, y levaduras osmoflicas se tiene en cuenta el rango de 10 UFC 100 UFC. RECUENTO Y EXPRESIN DE RESULTADOS: A). CASO GENERAL: Se calcula el promedio de colonias para cada una de las diluciones a examinar multiplicando el resultado por el factor inverso de la dilucin respectiva, a partir del recuento de dos diluciones sucesivas. Dividir el resultado obtenido de la mayor dilucin (Menos concentrada) por el resultado de la menor dilucin (ms concentrada). Si el cociente de esta divisin es mayor a 2, reportar el resultado obtenido en la dilucin ms concentrada, Pero, si el cociente es menor de 2 reportar la media aritmtica de los recuentos de las dos diluciones consecutivas.

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Excepto para aquellas bacterias cuya norma exige presencia o ausencia

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GUIA GENERAL PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS Se redondea el resultado calculado a dos cifras significativas. Para esto si la ltima cifra es inferior a 5 la cifra anterior no se modifica; si la ltima cifra es 5 o mayor, la cifra anterior se incrementa en una unidad. Se prosigue as hasta que se obtengan dos cifras significativas. Los resultados se expresan en UFC por gramo o mililitro de producto segn la naturaleza del mismo, expresado como un nmero entre 10 y 99 (dos cifras significativas enteras) multiplicado por 10X donde x es la potencia apropiada de 10. Ejemplo: A partir de un anlisis de aerobios mesfilos para una leche pasteurizada se obtuvieron los siguientes resultados:

en la primera dilucin seleccionada (10-2): 168 UFC y 215 UFC. en la segunda dilucin seleccionada (10-3): 35 UFC y 45 UFC.

10-2=

168 + 215 x100 = 19.150 2

10-3=

35 + 45 x1000 = 40000 2 40000 = 2,087 19150

Como el cociente es mayor de dos se reporta el resultado de la menor dilucin: 10-2= 19150 UFC/ml. Al redondear la cifra como se especific anteriormente, se obtiene como resultado 19.000, expresado con dos cifra significativas 19x103 UFC/ml. B). CASOS ESPECIALES: CASO 1: Cuando el nmero de UFC se encuentran por debajo del rango mnimo en ambas cajas de una o las dos diluciones consecutivas, se informar as: Se descarta el recuento obtenido en la mayor dilucin y se calcula la media aritmtica de las colonias presentes en las dos cajas de la menor dilucin multiplicndose por el inverso de la dilucin y se informa el resultado como sigue: Conteo estimado de UFC por gramo o mililitro (Teniendo en cuenta la forma de informar el resultado final: dos cifras significativas por.....)

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CASO 2: Ausencia de crecimiento, si las dos cajas correspondientes a la primera dilucin no presentan crecimiento se reportar como negativo y se informa el resultado como sigue: Conteo estimado de UFC por gramo o mililitro < 1x10X UFC por gramo o mililitro segn corresponda. C.E. CASO 3: Crecimiento abundante, si las dos cajas correspondientes a la primera dilucin presentan crecimiento mayor de 300 colonias se divide la caja en 2, 4, 6, 8 cuadrantes, se cuenta el nmero de colonias presente en un cuadrante y se multiplica por el total de cuadrantes y por el inverso de la dilucin. Se continua el recuento como en el caso general pero se informa el resultado como Conteo estimado de UFC por gramo o mililitro

Ejemplo: A partir de un anlisis de aerobios mesfilos para una leche pasteurizada se obtuvieron los siguientes resultados:

- en la primera dilucin seleccionada (10-2): >300 UFC en las dos cajas. - en la segunda dilucin seleccionada (10-3): >300 UFC en las dos cajas. Al dividir las cajas de 10-2 en 4 se cont en un cuadrante 180 colonias y 150 colonias respectivamente. Al dividir las cajas de 10-3 en 4 se cont en un cuadrante 100 colonias y 120 colonias respectivamente.
10-2 (caja 1) = ((180 x 4) x100 ) 10-3 (caja 1) = ((100 x 4) x1000) 10-2= 10-2 (caja 2) = ((150 x 4) x100) 10-2 (caja 2) = ((120 x 4) x1000 )

720 + 600 x100 = 66000 2 400 + 480 x1000 = 440000 2 400000 = 6,66 66000

10-3=

Como el cociente es mayor de dos se reporta el resultado de la menor dilucin: 10-2= 66.000 UFC/ml. Al redondear la cifra como se especific anteriormente, se obtiene como resultado 66.000, expresado con dos cifra significativas 66x103 UFC/ml. C.E.

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NOTA: cuando el conteo de colonias exceda de 200 en 1/8 de la caja se reportar como >1600 UFC/gr o ml multiplicadas por el inverso de la menor dilucin y Conteo estimado. Ejemplo: A partir de un anlisis de aerobios mesfilos para una leche pasteurizada se obtuvieron los siguientes resultados:

- en la primera dilucin seleccionada (10-2): >300 UFC en las dos cajas. - en la segunda dilucin seleccionada (10-3): >300 UFC en las dos cajas. Al dividir las cajas de 10-2 en 4 se cont en un cuadrante 240 colonias y 230 colonias respectivamente.
Se informa como >1600x102 UFC/ml. C.E.

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