Pontificia Universidad Catlica de Chile Facultad de Qumica Departamento: Qumico-Fsica Asignatura: Bioqumica Profesor: Marco Soto (Ctedra) Claudia

Bueno (Laboratorio)

INFORME 5
Enzimas, transaminasas

Alumno: Vicente Andrs Rojas Yez Fecha de ejecucin: martes 28 de Mayo 2013

OBJETIVO GENERAL
Estudiar la reaccin de la transaminacin.

OBJETIVOS ESPECFICOS

Estudiar el proceso de la transaminacin en presencia de un extracto enzimtico de origen animal. Separar e identificar aminocidos y cetocidos obtenidos como productos en la reaccin de transaminacin.

RESULTADOS
En esta experiencia se realiza un estudio sobre hgados de rata, los que se someten a distintos procesos y reactivos para poder producir distintas reacciones de transaminacin en sustratos. Los ensayos efectuados son esquematizados a continuacin. 1. Composicin de los ensayos.
Tubo/Composicin Arsenito de Na 0,1 M (mL) Buffer Fosfato 0.05 M (ml) Glutamato 0,1 M (mL) Alanina 0,1 M (mL) --Piruvato 0,1 M (mL) 0,5 -Cetoglutarato 0,1M (mL) Extracto Crudo (mL) 0,5 Extracto Hervido (mL) ---0,5 ---0,5 ----0.5 0,5 ---0,5 --0,5 ------0,5 --------------------------0,5 ---0,5 ----0,5 ------0,5 --0,5 ---------1,0 ------------------0,5 0,5 --0,5 1,0 -----1,0 A 0,5 1,0 B 0,5 1,5 C 0,5 1,5 D 0,5 1,0 E 0,5 1,0 F 0,5 1,5 G 0,5 1,5 H 0,5 1,0 Patrn Ala 0,5 1,5 Patrn Glu 0,5 1,5 P- Ppyr CG 0,5 1,5 ---0,5 0,5 --0.5 -------------1,0 ------0,5 1,5 ----

*Tabla 1, organizacin de cada ensayo.

2. Tablas de resultados de distancias recorridas y Rf:

Luego de revelar las cromatoplacas, se mide la distancia recorrida tanto del eluyente como de cada muestra en anlisis, obtenindose los siguientes resultados: a. Cromatografa de aminocidos
Distancia recorrida por eluyente Placa 1: 6,2 cm

Placa 1:
Nmero de manchas 2 1 0 1 1 1 Distancia Recorrida por analito (cm) 1,2 (1 mancha) 0,8 (2 mancha) 0,8 0 0,9 1,6 0,7 Distancia Recorrida por eluyente (cm) 6,2 6,2 6.2 6.2 6,2 6,2 Rf

Tubo A Tubo B Tubo C Tubo D Patrn Alanina Patrn Glutamato

0,194 (1 mancha) 0,129 (2 mancha) 0,129 0 0.145 0,258 0,113

*Tabla 2, Cantidad de manchas y distancias recorridas del eluyente y de los ensayos realizados
desde el tubo A al D y los patrones alanina y glutamato.

*Imagen 1, cromatografa aminocidos placa 1.

Distancia recorrida por eluyente Placa 2: 4,4 cm, (datos obtenidos desde otro grupo de laboratorio). Placa 2:
Nmero de manchas 1 1 1 1 1 1 Distancia Recorrida por analito (cm) 1,40 1,30 0 1,25 1,30 0,50 Distancia Recorrida por eluyente (cm) 4,4 4,4 0 Rf 0,318 0,295 0 0,284 0,295 0,114

Tubo E Tubo F Tubo G Tubo H Tubo Patrn Ala Tubo Patrn Glu

4,4
4,4 4,4

*Tabla 2, Cantidad de manchas y distancias recorridas del eluyente y de los ensayos realizados
desde el tubo A al D y los patrones alanina y glutamato.

b. Cromatografa de cetocidos.
Siguiendo los pasos para la cromatografa de los cetocidos, es decir, se realiza la

comparacin de los tubos del A H, sembrando las soluciones patrn de -cetoglutarato y piruvato. Distancia recorrida por eluyente Placa 1: 4,2 (a las soluciones patrn, no se les adicion la hidracina, por lo que no se muestran como mancha amarilla, debido a esto se debi conseguir Rf con un grupo de laboratorio de otra seccin, para as poder comparar las manchas de las muestras y sus respectivos Rf dependiendo de la magnitud de ste.)
Nmero de manchas 2 0 2 2 Distancia Recorrida por analito (cm) 3,0 (1 mancha) 2,1 (2 mancha) 0 3,1 (1 mancha) 2,3 (2 mancha) 3,2 (1 mancha) 2,4 (2 mancha) Distancia Recorrida por eluyente (cm) 4,2 0 4,2 4,2 Rf

Tubo A Tubo B Tubo C Tubo D Patrn P-CG Patrn Ppyr

0,714 (1 mancha) 0,500 (2 mancha) 0 0,738 (1 mancha) 0,548 (2 mancha) 0,762 (1 mancha) 0,571 (2 mancha) 0,317 0,512

*Tabla 3, cromatografas cetocidos para tubos del A al D

*Imagen 2, cromatografa aminocidos placa 1, en cetocidos.

Distancia recorrida por eluyente Placa 2: 4,7 (datos conseguidos con otro grupo, se establece solo una mancha segn informacin otorgada por ellos.)
Nmero de manchas 1 0 1 1 1 1 Distancia Recorrida por analito (cm) 2,00 0,00 2,30 2,35 Distancia Recorrida por eluyente (cm) 4,7 0 4,7 4,7 Rf

Tubo E Tubo F Tubo G Tubo H Patrn P-CG Patrn Ppyr

0,426 0 0,489 0,500 0,385 0,578

*Tabla 4, datos obtenidos de cromatografa de cetocidos para los tubos del E al H.

3. Calculo de Rf:
Se calcula el Rf con las distancias medidas de cada mancha (se define como distancia de mancha al centro de sta).

Como ejemplo de obtencin del Rf se realiza con las muestras patrn de Alanina y Glutamato.

Patrn Alanina Patrn Glutamato

Se calcula el resto de los Rf para cada muestra de la misma manera.

DISCUSIN
Se realiza el anlisis entre reactantes y productos obtenidos en la cromatografa en capa fina (slica) con eluyentes que se encuentran en proporciones definidas, as se puede observar claramente la separacin de las manchas, luego se utiliza un revelador (ninhidrina) el cual reacciona con los grupos aminos oxidndolos para luego producir una condensacin otorgando el producto morado de Ruhemannn. Para el caso de los cetocidos se utiliza la hidrazina, la que acta de forma rpida con los cetocidos formando una hidrazona que se puede reconocer por su color amarillo. Cabe mencionar que se realiza un error en la deteccin por cromatografa de los cetocidos, ya que a las soluciones patrn no se le adiciona la hidrazina, no pudiendo ver la corrida de los cetocidos. En la reaccin de transaminacin el grupo alfa-amino de un aminocido es transferido al tomo de carbono alfa de un cetocido, dando lugar al correspondiente -cetocido anlogo al aminocido y el aminocido anlogo al cetocido correspondiente. Estos productos fueron los medidos en la cromatografa, con la finalidad de saber si la reaccin de transaminacin fue realizada (efectiva) o no. La reaccin se puede escribir de la siguiente manera: Glutamato + Piruvato Alanina + -cetoglutarato Transaminasa

Para lograr la identificacin de los aminocidos L-Glutamato y L-Alanina, en cada tubo por preparado, se comparan los Rf calculados con los patrones, es decir, si ocurre que el tubo preparado otorga una mancha con un Rf similar o igual a un Rf de un patrn, entonces este corresponder a dicho patrn y podr ser identificado. Se resume de acuerdo a lo obtenido en la siguiente tabla el prctico: A B C D E
Crudo Alanina -CG

F
Crudo Alanina

G
Crudo -CG

H
hervido Alanina -CG Glutamato

Crudo Crudo Crudo Hervido Tipo de extracto Contenido Glutamato Glutamato Piruvato Glutamato Piruvato Piruvato Inicial

-CG Glutamato Alanina Contenido Alanina Glutamato Glutamato Piruvato -CG final -CG piruvato piruvato

Alanina

*Tabla 5, resumen de lo obtenido y podido estudiar. (no es posible determinar el contenido final de los tubos completamente por la no completa informacin otorgada por el otro grupo).

Para el Tubo A, con la enzima activa (extracto crudo) se logra determinar que existe la reaccin esperada porque las manchas obtenidas poseen un Rf similar a la de los patrones, en ambas cromatografas (aminocidos y cetocidos), por lo tanto se dice que fue efectiva la reaccin por parte de glutamato- alanina y de piruvato a alfacetoglutarato. Para el Tubo B, se establece que no ocurri la reaccin enzimtica porque el mismo glutamato queda en la corrida, sin aparicin de alanina, tambin no se obtienen cetocidos. Para el Tubo C, es efectiva la reaccin, logrando pasar de piruvato a alfacetoglutarato. No se obtiene aminocidos concordando con lo previsto, ya que no sembraron. Para el Tubo D, se posee la enzima desnaturalizada (extracto hervido) y adems los reactantes, pero no ocurre reaccin, por esto solo se obtiene una mancha similar al Rf del glutamato. Para el Tubo E, se encuentra la enzima activa, por lo que se espera reaccin, pero no ocurre obteniendo una mancha con Rf similar al de la alanina. Pudo deberse a una falla en el proceso como poco tiempo de incubacin. Para el Tubo F, solo se obtiene alanina. Para el Tubo G, no se obtiene resultado respecto a aminocidos. Para el Tubo H, aunque se utiliz el extracto calentado, se produce reaccin obteniendo una mancha con un Rf similar al del glutamato. Pudo deberse a que el crudo no fue correctamente hervido hasta la desnaturalizacin completa de la enzima. En los tubos D y H, la enzima se utiliza extracto hervido (para la desnaturalizacin de la enzima), en el tubo D se obtiene lo esperado No reacciona, por tanto solo se obtiene lo adicionado en el tubo en cambio el H se produce reaccin, pudo deberse a la no utilizacin correcta del crudo hervido. Para los tubos del E al H no se puede establecer resultados finales con respecto a los cetocidos, ya que falta informacin (nmero de manchas, Rf de muestras patrn)

CONCLUSIN
Se logra entender la reaccin de transaminacin, utilizando un extracto enzimtico de hgado de rata, para un completo estudio se evala en distintos medios, como temperatura desnaturalizando a la enzima. Se identifican los aminocidos esperados L-Alanina y L- Glutamato, utilizando la tcnica de separacin Cromatografa en capa fina, comparando Rf de soluciones patrn con los Rf de las manchas de las muestras sembradas. Si no se establece un buen medio, como por ejemplo la total de los reactivos, la reaccin no se puede llevar a cabo obteniendo solo el sustrato inicial.

BIBLIOGRAFA
1. Jess V. Jorrn Novo, M Nieves Abril Daz, Jos A. Brcena Ruiz , Separacin de aminocidos por cromatografa en capa fina y deteccin mediante reaccin con ninhidrina, Depto. De Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Crdoba. 2. Lehninger, principios de bioqumica / / David L. Nelson, Michael M. Cox; coordinador de la traduccin Claudi M. Cuchillo. 2006