captulo

MEMBRANAS BIOLOGICAS Y TRANSPORTE

11.1 11.2 11.3 Composicin y arquitectura de las membranas 370 Dinmica de membranas 380 Transporte de solutos a travs de membranas 389

Buenas vallas hacen buenos vecinos.

-Roben Frost, "Mending Wall," en North of Boston, 1914

robablemente la primera clula apareci en el momento en que se form una membrana que encerraba un pequeo volumen de solucin acuosa y lo separaba del resto del universo. Las membranas definen los lmites externos de las clulas y regulan el trfico molecular a travs de estos lmites (Fig. 11-1); en clulas eucariticas dividen el espacio interno en compartimientos discretos para segregar procesos y componentes. Organizan secuencias complejas de reacciones y son de importancia principal tanto para la conservacin de la energa biolgica como para la comunicacin intercelular. Las actividades biolgicas de las membranas son consecuencia de sus notables propiedades fsicas. Las membranas son flexibles, autosellantes y selectivamente permeables a los solutos polares. Su flexibilidad les permite los cambios de forma que acompaan al crecimiento celular y al movimiento (tal como el movimiento ameboide). Su capacidad para romperse y sellarse permite que se fusionen dos membranas tal como sucede en la exocitosis o que un compartimiento sencillo dentro de una membrana pueda experimentar unafisin,dando lugar a la formacin de dos compartimientos sellados tal como ocurre en la endocitosis o en la divisin celular sin que se produzcan grandes prdidas a travs de la superficie celular. Debido a que las membranas son selectivamente permeables, retienen ciertos compuestos e iones dentro de clulas y dentro de compartimientos celulares especficos al tiempo que excluyen otros.

Las membranas no son meras barreras pasivas. Incluyen en su composicin un conjunto de protenas especializadas en promover o catalizar varios procesos celulares. En la superficie celular, los transportadores mueven solutos orgnicos as como iones inorgnicos a travs de la membrana; los receptores captan seales externas y provocan cambios moleculares en la clula y las molculas de adhesin mantienen clulas vecinas unidas. Dentro de la clula, existen membranas que organizan procesos celulares tales como la sntesis de lpidos y ciertas protenas o la transduccin de energa en mitocondrias y cloroplastos. Las membranas estn compuestas simplemente por dos capas de molculas, por lo que son muy delgadas; se las puede considerar bsicamente como bidimensionales. Debido a que las colisiones intermoleculares son mucho ms probables

Membrana bicapa

FIGURA 11-1 Membranas biolgicas. Vistas en seccin transversal, todas las membranas celulares comparten una apariencia trilaminar caracterstica. Cuando se tie un eritrocito con tetrxido de osmio y se observa al microscopio electrnico, la membrana plasmtica aparece como una estructura de tres capas, de 5 a 8 nm (50 a 80 A) de grosor. Las imgenes trilaminares consisten en dos capas densas en electrones (el osmio, unido a las superficies externa e interna de la membrana) separadas por una regin central menos densa. 369

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Captulo 11

Membranas biolgicas y transporte

en este espacio biclimensional que en el espacio tridimensional, la eficiencia de ciertas rutas catalizadas enzimticamente es mucho mayor dentro de una membrana bidimensional. En este captulo describimos en primer lugar la composicin de las membranas celulares y su arquitectura qumica, la estructura molecular sobre la que se asientan sus funciones biolgicas. A continuacin describiremos las extraordinarias caractersticas dinmicas de las membranas en las que lpidos y protenas se desplazan los unos con respecto a las otras. La adhesin celular, la endocitosis y las fusiones de membrana que tienen lugar tras una infeccin vrica ilustrarn el papel dinmico de las protenas de membrana. Pasamos a continuacin al transporte de solutos a travs de las membranas mediado por protenas, mediante transportadores y canales inicos. En captulos posteriores trataremos el papel de las membranas en la transcluccin de seales (Captulos 12 y 23), transduccin de energa (Captulo 19), sntesis de lpidos (Captulo 21) y sntesis de protenas (Captulo 27). 11.1 Composicin y arquitectura de las membranas Una manera de entender la funcin de las membranas es estudiar su composicin: determinar, por ejemplo, qu componentes estn normalmente presentes en todas las membranas y cules se encuentran nicamente en membranas con funciones especficas. Antes de describir la estructura y funcin de la membrana consideraremos, por tanto, los componentes moleculares de las membranas: las protenas y lpidos polares que constituyen casi la totalidad de la masa de las membranas biolgicas y los glcidos presentes como parte de glucoprotenas y glucolpidos.
Cada tipo de membrana presenta una composicin de protenas y lpidos caracterstica

Las proporciones relativas de protena y lipido varan con cada tipo de membrana (Tabla 11-1), lo que refleja la diversidad de papeles biolgicos. Por ejemplo, ciertas neuronas tienen una vaina de mielina, una membrana plasmtica extensa que se
TABLA 11-1

enrolla alrededor de la clula muchas veces y que acta como aislante elctrico pasivo. La vaina de nelina consiste principalmente en lpidos, pero las membranas de bacterias, mitocondrias y cloroplastos en las que tienen lugar muchos procesos metablicos catalizados enzimticamente contienen ms protena que lipido (en masa sobre masa total). Para los estudios de la composicin de membranas es esencial en primer lugar aislar la membrana de inters. Cuando se someten las clulas eucariticas a fuerzas mecnicas de cizalla sus membranas plasmticas se desgarran y fragmentan liberando componente citoplasmticos y organillos unidos a membranas tales como mitocondrias, cloroplastos, lisosomas y ncleos. Los fragmentos de la membrana plasmtica y los orgnulos intactos pueden aislarse por tcnicas de centrifugacin descritas en el Captulo 1 (vase Fig. 1-8). El anlisis qumico de las membranas aisladas de fuentes diversas pone de manifiesto ciertas propiedades comunes. La composicin de los lpidos de la membrana es caracterstica de cada reino, especie, tejido y tipo celular as como de los organillos dentro de un tipo determinado de clula. La membrana plasmtica, por ejemplo, est enriquecida en colesterol y no contiene cardiolipina en cantidades detectables (Fig. 11-2); en la membrana mitocondrial interna de hepatocitos la distribucin es inversa: muy poco colesterol y mucha cardiolipina. Est claro que las clulas tienen mecanismos para controlar las clases y cantidades de lpidos de membrana sintetizados y para dirigir lpidos especficos a organillos concretos. En muchos casos, podemos suponer las ventajas adaptativas de las distintas combinaciones de los lpidos de membrana; en otros casos, el significado funcional de estas composiciones est todava por descubrir. La composicin proteica de membranas de orgenes diferentes vara aun ms ampliamente que su composicin lipdica, lo que refleja su especializacin funcional. En los bastones de la retina de los vertebrados una porcin de la clula est muy especializada para la recepcin de la luz; ms del 90% de su protena de membrana en esta regin es una glucoprotena que absorbe luz llamada rodopsina. La membrana plasmtica menos especializada de los eritrocitos tiene unas 20 protenas prominentes as como docenas de otras ms minoritarias; gran parte de stas actan como transportadores responsables, cada

Componentes mayoritarios de las membranas plasmticas de varios organismos Componentes (% en peso) Protena Fosfolpido 30 27 26 7 40 25 Estero/ 19 25 7 4 4 0 Tipo de estero/ Colesterol Colesterol Sitosterol Ergosterol Estigmasterol Otros lpidos Galactolpidos, plasmalgenos Galactolpidos Triacilgliceroles, esteres esterlicos

Vaina de mielina humana Hgado de ratn Hoja de maz Levadura Paramecium (protista ciliado) coli

30 45 47 52 56 75

Nota: los valores no suman el 100% en todos los casos, porque hay otros componentes adems de protena, fosfolpidos y esterales; las plantas, por ejemplo, tienen concentraciones elevadas de glucolpidos.

11.1

Composicin y arquitectura de las membranas

371

Plasmtica Mitocondrial interna Mitocondrial externa cu "O <s a Lisosmica Nuclear

Las membranas son impermeables a la mayora de solutos polares o cargados, pero son permeables a los compuestos apola100 res; tienen de 5 a 8 nm de grosor (50 a 80 ) y tienen aspecto trilaminar cuando se observan en seccin transversal con el Porcentaje de lpidos de membrana microscopio electrnico (Fig. 11-1). Las pruebas combinadas de microscopa electrnica y estudios de composicin qu| Colesterol | Esfmgollpidos mica, as como de estudios fsicos de permeabilidad y del mo| Cardiolipina "j Fosfatidilcolina vimiento, de molculas individuales de protenas y lpidos | | Lpidos minoritarios Q Fosfatidiletanolamina dentro de las membranas, condujeron al modelo de mosaico fluido para la estructura de las membranas biolgicas (Fig. FIGURA 11-2 Composicin lipdica de la membrana plasmtica y 11-3). Los fosfolpidos forman una bicapa, en la que las regiode las membranas de los organillos de un hepatocito de rata, ta esnes apolares de las molculas lipdicas de cada capa estn enpecializacln funcional de cada tipo de membrana se refleja en su caradas hacia el centro de la bicapa y sus grupos de cabeza composicin lipdica caracterstica. El colesterol es prominente en polares estn encarados hacia el exterior interaccionando con membranas plasmticas pero es apenas cletectable en membranas mila fase acuosa a cada lado. Las protenas globulares estn intocondriales. La cardiolipina es un componente mayoritario de la crustadas en esta bicapa lipdica y se mantienen mediante membrana mitocondrial interna pero no de la membrana plasmtica. interacciones hidrofbicas entre los lpidos de la membrana y La fosfaticlilserina, el fosfatidilinosol y el fosfatilidilglicerol son comlos dominios hidrofbicos de las protenas. Algunas protenas ponentes relativamente minoritarios (amarillo) de la mayora de memsobresalen a un solo lado de la membrana; otras tienen domibranas, pero desempean funciones crticas; el fosfatidilinosol y sus nios expuestos a ambos lados. La orientacin de las protenas derivados, por ejemplo, son importantes en la transduccin de seaen la bicapa es asimtrica, confiriendo "Literalidad" a la memles desencadenadas por hormonas. Los esfingolpiclos, la fosfatidilcobrana; los dominios proteicos expuestos a un lado de la bicapa lina y la fosfatilidiletanolamina estn presentes en la mayora de son diferentes a los expuestos al otro lado, lo que refleja una membranas, pero en proporciones variables. Los glucolpidos, que asimetra funcional. Los lpidos individuales y las unidades son los componentes mayoritarios de las membranas de los cloroplasproteicas de una membrana forman un mosaico fluido con un tos de plantas, estn prcticamente ausentes en las clulas animales. patrn que, a diferencia de un mosaico de cermica y mortero, puede cambiar constantemente. El mosaico de la membrana es fluido porque la mayora de interacciones entre sus compouno de ellos, de transportar un soluto especfico a travs de la nentes son no covalentes, dejando libertad a las molculas de membrana. La membrana plasmtica de E. coli contiene cenlpidos y de protenas para trasladarse lateralmente en el plano tenares de protenas diferentes, entre ellas transportadores y de la membrana. muchos enzimas que intervienen en el metabolismo de conservacin de la energa, sntesis de lpidos, exportacin de proteRepasaremos ahora algunas de estas caractersticas del nas y divisin celular. La membrana externa de E. coli, que modelo de mosaico fluido con ms detalle y consideraremos rodea la membrana plasmtica, tiene una funcin distinta (prolas pruebas experimentales que apoyan el modelo bsico pero teccin) y un conjunto diferente de protenas. que han exigido su refinamiento en diversos aspectos. Algunas protenas de membrana se unen covalentemente a conjuntos complejos de glcidos. Por ejemplo, en la glicofoEl elemento bsico estructural de las membranas rina, una glucoprotena de la membrana plasmtica de eritroes una bicapa lipdica cito, el 60% de la masa consiste en un complejo oligosacrido unido covalentemente a residuos aminocidos especficos. Los Los glicerofosfolpidos, esfingolpiclos y esterles son prcticaresiduos de Ser, Thr y Asn son los puntos ms comunes de mente insolubles en agua. Cuando se mezclan con agua, forunin (vase Fig. 7-31). Al otro extremo de la escala est la ro- man espontneamente agregados lipideos microscpicos en dopsina ele la membrana plasmtica del bastn de la retina, una fase que se aisla de su entorno acuoso, agrupndose con Golgi

S Del RE rugoso 6 O Del RE liso

que slo contiene un hexasacriclo. Las porciones ui-dicas de las glucoprotenas de la superficie influyer. er. el znegamiento de las protenas, en su estabilidad y en el destino intracelular, y juegan un papel importante en la unin especfica de ligandos a los receptores glucoproteicos de superficie (vase Fig. 7-37). Algunas protenas de membrana estn unidas de forma covalente a uno o ms lpidos, que actan como anclas fbicas, manteniendo las protenas unidas a la membrana, tal como veremos.
Todas las membranas biolgicas comparten ciertas propiedades fundamentales

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Captulo 11

Membranas biolgicas y transporte

Cadenas de oligosacrido glucoprotena

Bicaj lipidie I Cabezas polares de fosfolpido

Protena perifrica

-Protena integral (hlice transmem brana nica)

Protema perifrica unida covalentemente a lipido

' Protena integral (hlices transmembrana mltiples)

FIGURA 11-3 Modelo del mosaico fluido para la estructura de la membrana. Las cadenas de acilo graso del interior de la membrana forman una regin hidrofbica fluida. Las protenas integrales flotan en este mar de lpidos, sostenidas por interacciones hidrofbicas con sus cadenas laterales de aminocidos apolares. Tanto las protenas

como los lpidos se pueden desplazar libremente en el plano de la bicapa, pero el movimiento de una cara de la bicapa a la otra est restringido. Las porciones de glcido unidas a algunas protenas y Ipidos de la membrana plasmtica estn expuestas en la cara extracelular de la membrana.

sus partes hidrofbicas en contacto mientras que sus grupos hidroficos interactan con el agua que los envuelve. Recurdese que los agregados lipideos disminuyen la superficie hidrofbica expuesta al agua y as minimizan el nmero de molculas en la capa, de agua ordenada en la interfase lpido-agua (vase Fig. 2-7), ciando lugar as a un incremento de entropa. Las interac-

ciones hidrofbicas entre las molculas de lipido proporcionan la fuerza termodinmica para la formacin y mantenimiento de estos agregados. En funcin de las condiciones precisas y de la naturaleza de los lpidos se forman tres tipos de agregados lipideos cuando los lpidos antipticos se mezclan con agua (Fig 11-4). Las mi-

Las unidades individuales tienen forma de cua (seccin transversa] de la cabeza mayor que la de la cadena lateral)

Cavidad Las unidades individuales son cilindricas (seccin transversal de la cabeza igual a la de la cadena lateral)

(a) Micela

(b) Bicapa

(c) Liposoma
la lmina estn protegidas de la interaccin con el agua, (c) Cuando una bicapa biclimensional se pliega sobre s misma, forma una bicapa cerrada, una vescula hueca tridimensional (liposoma) que encierra una cavidad acuosa.

FIGURA 11-4 Agregados de lpidos antipticos que se forman en el agua, (a) En las micelas, las cadenas hidrofbicas de los cidos grasos se hallan secuestradas en el ncleo de la esfera. No hay prcticamente agua en el interior hidrofbico. (b) En una bicapa abierta, todas las cadenas laterales acilo excepto las que estn en los bordes de

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Composicin y arquitectura de las membranas

373

celas son estructuras esfricas que contienen entre pocas doPorcentaje cenas y algunos miles de molculas antipticas ordenadas con del total de Distribu:::r. frFosfolpido fosfolpido de sus regiones hidrofbicas hacia el interior, excluyendo el agua de membrana la membrana a membrana y sus grupos de cabeza hidrofflcos en la superficie, en contacto con el agua. La formacin de las ncelas est favorecida cuanMonocapa Monocapa do el rea de la seccin transversal del grupo de cabeza es ma100 interna ( ) exte 100 yor que la de las cadenas laterales acilo, tales como las de los i 1 lll cidos grasos libres, lisofosfolpidos (fosfolpidos a los que les Fosfatidiletanolam na 30 falta un solo cido graso) y detergentes como el dodecilsulfato de sodio (SDS;p. 92). 27 i .Fosfatidilcolma Un segundo tipo de agregado lipclico en agua es la bicapa, Esfingomielina 23 E 1 en la cual dos monocapas de lpidos forman una hoja bidimensional. La formacin de la bicapa tiene lugar fcilmente cuando Fosfatidilserina 15 | la seccin transversal del grupo de cabeza y las cadenas lateraFosfatidilmositol les acilo son similares, como en el caso de glicerofosfolpidos y esfingolpiclos. Las porciones hidrofbicas de cada monocapa, Fosatidilinositol 4-fosfato excluidas del agua, interaccionan entre s. Los grupos de cabeza -5 mdrolicos interaccionan con el agua en cada superficie de la Fosatidilinositol bicapa. Dado que las regiones hidrofbicas de sus extremos 4,5-bisfosfato (Fig. 1 l-4b) estn en contacto transitorio con el agua, la hoja en cido fosfatdico j' bicapa es relativamente inestable y forma espontneamente mi tercer tipo de agregado: se repliega sobre s misma formando FIGURA 11-5 Distribucin asimtrica de fosfolpidos entre las mouna esfera vaca llamada vescula o liposoma (Fig. ll-4c). En nocapas interna y externa de la membrana plasmtica de eritrocito. la formacin de vesculas, la bicapa pierde sus regiones extreLa distribucin de un fosfolpido especfico se determina al tratar la mas hidrofbicas expuestas al agua, consiguiendo mxima estaclula intacta con fosfolipasa C, la cual no puede alcanzar lpidos de bilidad dentro del entorno acuoso. Estas vesculas en bicapa la monocapa interna pero elimina lo grupos de cabeza de lpidos en encierran agua, creando un compartimiento acuoso separado. la monocapa externa. La proporcin de cada grupo de cabeza elimiEs probable que los precursores de las primeras clulas se asenado proporciona una estimacin de la fraccin de cada lipido en la mejaran a liposomas, en los cuales el contenido acuoso se manmonocapa externa. tendra separado del exterior gracias a una hoja hidrofbica. Las membranas biolgicas estn construidas por bicapas liLas protenas perifricas de membrana pdicas de 3 nm (30 ) de grosor con protenas que sobresalen a cada lado. El ncleo hidrofbico de la membrana, formado se solubilizan fcilmente por los grupos CH2 y CH 3 de los acilos grasos es tan Las protenas de membrana se pueden dividir operacionalmente apolar como el decano y los liposomas formados en el laboratoen dos grupos (Fig 11-6). Las protenas integrales estn firrio a partir de lpidos puros son prcticamente impermeables a memente unidas a la membrana y slo se pueden liberar por la los solutos polares, al igual que las membranas biolgicas (aunaccin de agentes que interfieren en las interacciones hidroque estas ltimas, como veremos, son permeables a los solutos fbicas tales como detergentes, disolventes orgnicos o despara los que disponen de transportadores especficos). naturalizantes. Las protenas perifricas se asocian con la Los lpidos de la membrana plasmtica son asimtricos en membrana a travs de interacciones electrostticas y enlaces su distribucin entre las dos caras de la bicapa, aunque la aside hidrgeno con los dominios mdroflicos de las protenas inmetra, a diferencia de la de las protenas de membrana, no es tegrales y con los grupos de las cabezas polares de los lpidos absoluta. En la membrana plasmtica de los eritrocitos, por de membrana. Pueden liberarse con tratamientos relativamente ejemplo, los lpidos que contienen colina (fosfaticlilcolina y essuaves que interfieren en las interacciones electrostticas o fingonelina) se encuentran principalmente en la cara externa rompen los puentes de hidrgeno; un agente utilizado habide la bicapa (extracelular o exoplasmtica) (Fig. 11-5), mientualmente es el carbonato a pH elevado. Las protenas periftras que fosfatidilserma. la fosfatidiletanolamina y los fosfatiricas pueden servir como reguladores de enzimas unidos a dilinositoles son mucho ms frecuentes en la cara mterna membrana o pueden limitar la movilidad de las protenas inte(citoplasmtica). Los cambios en la distribucin de lpidos engrales formando ligaduras intramoleculares. tre las hojas de la membrana plasmtica tienen consecuencias biolgicas. Por ejemplo, slo cuando la fosfatidilserma de la Muchas protenas abarcan la bicapa lipdica membrana plasmtica pasa a la cara externa puede una plaqueta realizar su papel en la formacin de un cogulo sangu- La topologa de las protemas de membrana (localizacin relaneo. Para muchos otros tipos de clulas, la exposicin de la tiva a la bicapa lipdica) puede investigarse con reactivos que fosfatidilserma en la superficie externa marca una clula para reaccionan con las cadenas laterales de la protena pero que no su destruccin por apoptosis. pueden cruzar la membrana (reactivos qumicos polares que

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Captulo 11

Membranas biolgicas y transporte

rina abarca la totalidad de la membrana plasmtica. Su dominio amino-terminal (portador de las cadenas de glcidos) se encuentra en la superficie externa y puede cortarse con tripsina. El extremo carboxilo-terminal sobresale hacia el interior, donde no puede reaccionar con reactivos impermeables. Los dominios amino-terminal y carboxilo-terminal contienen muchos residuos aminocidos polares o cargados y son, por tanto, bastante hidroflicos. No obstante, hay un segmento en el centro de la protena (residuos 75 a 93) que contiene mayoritariamente residuos aminocidos hidrofbicos, lo que sugiere que la glicoforina tiene un segmento transmembrana ordenado tal como se muestra en la Figura 11-7. Hay otro hecho que se puede deducir de los resultados de los experimentos con la glicoforina: su disposicin en la raem-

Protena integral (dominio hidrofbico recubierto por detergente)

FIGURA 11-6 Protenas perifricas e integrales. Las protenas de membrana se pueden distinguir operacionalmente por las condiciones requeridas para liberarlas de la membrana. La mayora de las protenas perifricas se pueden liberar por cambios en el pH o en la fuerza inica, la eliminacin de C a por un agente quelante o la adicin de urea o carbonato. Las protenas integrales pueden ser extradas con detergentes, que destruyen las interacciones hidrofbicas con la bicapa lipdica y forman agrupaciones parecidas a micelas alrededor de molculas proteicas individuales. Las protenas integrales unidas covalentemente a un lipido de membrana, tal como el glucosil fosatidilinositol (GPI; vase Fig. 11-14), pueden ser liberadas mediante el tratamiento con fosfolipasa C.
2+

reaccionan con aminas primarias de residuos de Lys, por ejemplo, o enzimas como la tripsina que cortan protenas pero que no pueden cruzar la membrana. Para estos estudios es muy til el eritrocito humano, debido a que no tiene organillos unidos a membrana y a que la membrana plasmtica es la nica membrana presente. Si una pro tena de membrana de un eritrocito intacto reacciona con un agente impermeable a la membrana, una parte de esta protena debe ser expuesta hacia la cara exterior (extracelular) de la membrana. La tripsina corta los dominios extracelulares pero no afecta a los dominios que permanecen sepultados dentro de la bicapa o expuestos solamente en la superficie interior a menos que se rompa la membrana plasmtica y estos dominios sean accesibles al enzima. Experimentos con tales reactivos con especificidad topolgica muestran que la glucoprotena del eritrocito glicofo-

131
FIGURA 11-7 Disposicin transbicapa de la glicoforina en el eritrocito. Un dominio hidroflico, que contiene todos los residuos de azcar, se encuentra en la superficie externa y otro dominio hidroflico sobresale de la cara interna de la membrana. Los hexgonos rojos representan un tetrasacrido [que contiene dos Neu5Ac (cido silico), Gal y GalNAc] unido por O a una Ser o una Thr; el hexgono azul representa una cadena de oligosacrido unida por N a un residuo de Asn. El tamao relativo de las unidades de oligosacrido es mayor que el que aqu se muestra. Un segmento de 1 9 residuos hidrofbicos (residuos del 75 al 93) forma una hlice a que atraviesa la bicapa de la membrana (vase Fig. 11-11 a). El segmento del residuo 64 al 74 tiene algunos residuos hidrofbicos y probablemente penetra en la cara externa de la bicapa lipdica.

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Composicin y arquitectura de las membranas

375

brana es asimtrica. Estudios similares con otras protenas de membrana muestran que cada una tiene una orientacin especfica en la bicapa; un dominio de una protena transmembrana est siempre encajado hacia el exterior mientras que el otro siempre se dirige hacia el interior. Adems, las glucoprotenas de la membrana plasmtica estn situadas invariablemente con sus residuos glucdicos en la superficie externa de la clula. Tal como veremos, el ordenamiento asimtrico de las protenas de membrana les confiere asimetra funcional. Todas las molculas de una bomba inica determinada, por ejemplo, tienen la misma orientacin, por lo que todas ellas bombean en la misma direccin.
Las protenas integrales son sostenidas en la membrana por interacciones hidrofbicas con lpidos

-ooc

H,N

(,4

Tipo III

La unin firme de las protenas integrales a las membranas es el resultado de interacciones hidrofbicas entre los lpidos de membrana y los dominios hidrofbicos de la protena. En algunas protenas existe una sola secuencia hidrofbica en el centro de la protena (tal como sucede en la glicoforina) o en el extremo amino o carboxilo. Otras tienen mltiples secuencias hidrofbicas, cada una de las cuales, cuando adoptan conformacin de hlice a, tiene una longitud suficiente para abarcar la bicapa lipdica (Fig. 11-8). Las mismas tcnicas que han permitido la determinacin de la estructura tridimensional de las protenas solubles pueden, en principio, aplicarse a protenas de membrana. En la prctica, sin embargo, hasta hace poco ha sido difcil cristalizarlas. Las nuevas tcnicas estn superando este obstculo y empiezan a aparecer de forma regular estructuras cristalogrficas de protenas de membrana, con lo que tenemos un mejor conocimiento a nivel molecular de los acontecimientos que tienen lugar en las membranas. Una de las protenas que abarcan la membrana y que est mejor estudiada es la bacteriorrodopsina, que contiene siete secuencias internas muy hidrofbicas y que cruza siete veces la bicapa lipdica. La bacteriorrodopsina es una bomba de protones accionada por la luz que est densamente empaquetada en formaciones regulares en la membrana prpura de la bacteria Halobacterium salinarum. La cristalografa de rayos X revela una estructura con siete segmentos a-helicoidales, cada uno de los cuales atraviesa la bicapa lipdica, que estn conectados mediante bucles no helicoidales en las caras externa e interna de la membrana (Fig. 11-9). En la secuencia de aminocidos de la bacteriorrodopsina pueden identificarse siete segmentos de unos 20 residuos hidrofbicos, cada uno de elfos de longitud suficiente para formar una hlice a que abarca la bicapa lipdica. Interacciones hidrofbicas entre los aminocidos apolares y los grupos acilo graso de los lpidos de la membrana anclan firmemente la protena a la membrana. Las siete hlices se encuentran agrupadas y se orientan de modo no completamente perpendicular al plano de la bicapa, formando una ruta transmembrana para el movimiento de los protones. Tal como veremos en el Captulo 12, este patrn de siete hlices hidrofbicas que abarcan la membrana es un motivo comn en las protemas de membrana que intervienen en la recepcin de seales.

* , . ; v' v Tipo IV ) Tipo V Tipo VI Interior Exterior

FIGURA 11-8 Protenas integrales de membrana. Para protenas conocidas de la membrana plasmtica, las relaciones espaciales de los dominios proteicos con la bicapa lipdica se agrupan en seis categoras, tos tipos I y II tienen slo una hlice transmembrana; el domino amino-terminal est en el exterior de la clula en las protenas de tipo I y en el interior en las de tipo II. Las protenas de tipo III tienen mltiples hlices transmembrana en un nico polippticlo. En las protenas de tipo IV, los dominios transmembrana de varios polipptidos diferentes se unen para formar un canal a travs de la membrana, fas protenas de tipo V estn unidas a la bicapa principalmente por lpidos unidos covalentemente (vase Fig. 11-14) y las protenas de tipo VI tienen tanto hlices transmembrana como anclajes lipdicos (GPI). En esta figura, y en otras a lo largo del libro, representamos segmentos de protenas transmembrana en sus conformaciones ms probables: como hlices a de seis a siete vueltas. A veces estas hlices se muestran simplemente como cilindros. Como se conocen relativamente pocas protenas de membrana por cristalografa de rayos X, nuestra representacin de los dominios extramembrana es arbitraria y no necesariamente a escala.

El centro de reaccin fotosinttico de una bacteria prpura fue la primera protema de membrana resuelta por cristalografa. Aunque es una protena de membrana ms compleja que la bacteriorrodopsina, est construida sobre los mismos principios. El centro ele reaccin tiene cuatro subunidades proteicas, tres de las cuales contienen segmentos en hlice a

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Captulo 11

Membranas biolgicas y transporte

Extremo

carboxilo
FIGURA 11-9 Bacteriorrodopsina, una protena que cruza la membrana. (PDB ID 2AT9) ta cadena polipeptdica sencilla se pliega en siete hlices a hidrofbicas, cada una de las cuales atraviesa la bicapa lipdica de forma aproximadamente perpendicular al plano de la membrana. Las siete hlices transmembrana estn agrupadas y el espacio alrededor y entre ellas se llena con las cadenas acilo de los lpidos de membrana. El retinal, que es un pigmento que absorbe luz (vase Fig. 10-21), est sepultado muy adentro de la membrana en contacto con varios de los segmentos helicoidales (no mostrados), fas hlices estn coloreadas para corresponderse con la grfica hidroptica de la Figura 11-11 b.

grales tienen al menos una de estas secuencias. La aplicacin de esta lgica a secuencias genmicas completas conduce a la conclusin de que en muchas especies entre el 10% y el 20% de todas las protenas son protenas integrales de membrana. Qu podemos predecir sobre la estructura secundaria de las porciones de las protenas integrales de membrana que abarcan la bicapa? Una secuencia a-helicoidal de 20 a 25 residuos es lo suficientemente larga como para abarcar el grosor (30 ) de la bicapa lipdica [recurdese que la longitud de una hlice a es de 1,5 (0,15nm) por residuo aminocido]. Una cadena polipeptdica rodeada de lpidos, sin molculas de agua con las que formar enlaces de hidrgeno, tiende a formar hlices a u hojas 3, en las que se maxmzan los enlaces de hidrgeno intracatenarios. Si las cadenas laterales de los aminocidos de una hlice son apolares, las interacciones hidrofbicas con el entorno lipdico estabilizan an ms la hlice. Varios mtodos sencillos de anlisis de secuencia de aminocidos proporcionan una prediccin de estructura secundaria bastante precisa para las protenas transmembrana. La polaridad relativa de cada aminocido se determina experi-

que abarcan la membrana (Fig. 11-10). Estos segmentos son ricos en aminocidos apolares y sus cadenas laterales hidrofbicas estn orientadas hacia el exterior de la molcula, donde interaccionan con los lpidos de membrana. La arquitectura de la protema del centro de reaccin es, por consiguiente, la inversa de la vista en la mayora de protenas hidrosolubles que tienen sus residuos hidrofbicos enterrados dentro del ncleo proteico y sus residuos hidroflicos en la superficie (recurdense, por ejemplo, las estructuras de la mioglobina y de la hemoglobina). En el Captulo 19 veremos varias protenas de membrana complejas que tienen mltiples segmentos transmembrana helicoidales en los que las cadenas hidrofbicas estn situadas para interaccionar con la bicapa lipdica.
Puede predecirse la topologa de una protena integral de membrana a partir de su secuencia

Determinar la estructura tridimensional de una protema de membrana, o su topologa, es generalmente mucho ms difcil que determinar su secuencia aminocida, la cual se puede obtener por secuenciacin de la protena o de su gen. Se conocen miles de secuencias de protenas de membrana, pero se han establecido relativamente pocas estructuras tridimensionales por cristalografa de rayos X o espectroscopia de NMR. La presencia de secuencias continuas de ms de 20 aminocidos hidrofbicos en una protena de membrana se toma generalmente como prueba de que tales secuencias atraviesan la bicapa lipdica, actuando como anclas hidrofbicas o formando canales transmembrana. Virtualmente todas las protenas inte-

FIGURA 11-10 Estructura tridimensional del centro de reaccin fotosinttico de Rhodopseudomonas viridis, una bacteria prpura. Esta fue la primera protena integral de membrana cuya estructura atmica se determin por mtodos de difraccin de rayos X (PDB ID 1 PRC). Once segmentos a-helicoidales de tres de las cuatro subunidades cruzan la bicapa lipdica, formando un cilindro de 45 A (4,5 nm) de largo; residuos hidrofbicos en el exterior del cilindro interaccionan con lpidos de la bicapa. En esta representacin de cintas, residuos que son parte de las hlices transmembrana se muestran en amarillo. Los grupos prostticos (pigmentos que absorben luz y transportadores electrnicos; vase Fig. 19-45) estn en rojo.

11.1

Composicin y arquitectura de las membranas

377

mentalmente midiendo la variacin de energa libre que se produce cuando la cadena lateral del residuo pasa de un disolvente apolar al agua. Esta variacin de energa libre de transferencia es desde muy exergnica para residuos muy polares o cargados hasta muy endergnica para residuos con cadenas laterales aromticas o hidrocarbonadas alifticas. La ldrofobiciclad global de una secuencia de aminocidos se estima sumando las energas libres de transferencia de los residuos en la secuencia, lo que da un ndice hidroptico para aquella regin (vase Tabla 3-1). Para localizar secuencias con potencial para atravesar las membranas, se calculan los ndices hidropticos de segmentos sucesivos (llamados ventanas) de un tamao determinado que oscila entre 7 y 20 aminocidos. Para una ventana de 7 residuos, por ejemplo, los ndices para los residuos del 1 al 7, del 2 al 8, del 3 al 9, etc., se representan tal como se indica en la Figura 11-11 (se muestra el ndice para el residuo intermedio en cada ventana, el residuo 4 para los residuos 1 a 7, por ejemplo). Una regin con ms de 20 residuos con un alto ndice hidroptico es, presumiblemente, un segmento transmembrana. Cuando las secuencias de protenas de membrana de estructura tridimensional conocida se analizan de esta manera se observa una correspondencia bastante buena entre las predicciones y los segmentos que se sabe que abarcan la membrana. Los anlisis hidropticos predicen un solo segmento hidrofbico en hlice para la glicoforina (Fig. 11-1 la) y siete segmentos transmembrana para la bacteriorrodopsina (Fig. 11-llb), en concordancia con los estudios experimentales. A partir de sus secuencias de aminocidos y los grficos hidropticos, se cree que muchas de las protenas de transporte descritas en este captulo tienen mltiples regiones helicoidales que atraviesan la membrana, es decir, que pertenecen a los tipos III o IV de protenas integrales (Fig. 11-8). Cuando las predicciones son coherentes con los estudios qumicos de localizacin de protenas (tales como los descritos anteriormente para la glicoforina o la bacteriorrodopsina), la suposicin de que las regiones hidrofbicas corresponden a dominios que abarcan la membrana est mucho ms justificada.

H i d r o f b i c o Hi Ir 60 100 N m e r o de residuo (a) Glicoforina 130

Hidrofbico ofl Hidroflico ofli

l

100 150 200 N m e r o de residuo (b) Bacteriorrodopsina

FIGURA 11-11 Grficas hidropticas. El ndice hidroptico (vaseTabla 3-1) se representa frente al nmero de residuo para dos protenas integrales de membrana. El ndice hidroptico para cada residuo aminocido en una secuencia de longitud definida (llamada ventana) se utiliza para calcular la hidropata media de los residuos de esta ventana. El eje horizontal muestra el nmero de residuo de la mitad de la ventana, (a) La glicoforina de eritrocitos humanos tiene una nica secuencia hidrofbica entre los residuos 75 y 93 (amarillo); comprese esto con la Figura 11-7. (b) La bacteriorrodopsina, de la que se sabe por estudios fsicos independientes que tiene siete hlices transmembrana (vase Fig. 11-9), tiene siete regiones hidrofbicas. Obsrvese, sin embargo, que la grfica hidroptica es ambigua en la regin de los segmentos 6 y 7. Estudios fsicos han confirmado que esta regin tiene dos segmentos transmembrana.

993 i

Canal de K+

Maltoporina

Fosfolipasa A de la membrana externa

Fosfoporina E

FIGURA 11-12 Acumulacin de residuos deTyr yTrp de protenas de membrana en la interfase agua-lpido. Se conocen las estructuras detalladas de estas cinco protenas integrales de membrana a partir de estudios cristalogrficos. El canal de K (PDB ID 1BL8) es de la bacteria Streptomyces lividans (vase Fig. 11-48); maltoporina (PDB ID 1AF6), fosfolipasa A de la membrana externa (PDB ID 1QD5), OmpX
+

(PDB ID 1QJ9) y fosfoporina E (PDB ID 1 PHO) son protenas de la membrana externa de E. coli. Los residuos deTyr (naranja) yTrp (rojo) se encuentran predominantemente en el punto en que las regiones apolares de las cadenas aclicas se encuentran con la regin de los grupos de cabeza polares. Los residuos cargados (Lys, Arg, Glu, Asp) se muestran en azul; estn casi exclusivamente en las fases acuosas.

378

Captulo 11

Membranas biolgicas y transporte

FepA

OmpLA

FIGURA 11-13 Protenas de membrana con estructura en barril [i. Se muestran cinco ejemplos, vistos en el plano de la membrana; los cuatro primeros son de la membrana externa de E. coli. FepA (PDB ID 1 FEP), que interviene en la captacin de hierro, tiene 22 cadenas (3 que abarcan la membrana. OmpLA (procedente de PDB ID 1QD5), una fosfolipasa, es un barril j8 de 12 cadenas que se encuentra en forma dedmeroen la membrana, ta maltoporina (de PDB ID 1MAL), un transportador de maltosa, es un trmero con cada uno de los monmeros construido por 1 6 cadenas f. TolC (PDB ID 1 EK9), otro transportador, tiene tres subunidades separadas, cada una de las cuales aporta cuatro cadenas (3 a este barril de 12 cadenas. La toxina a-hemolisina de Staphylococcus aureus (PDB ID 7AHL, en la parte inferior se muestra la vista desde arriba) est compuesta por siete subunidades idnticas, cada una de las cuales aporta un par de cadenas /3 en forma de horquilla al barril de 14 cadenas.

Otra caracterstica notable de muchas protenas transmembrana de estructura conocida es la presencia de residuos de Tyr y Trp en la interfase entre lipido y agua (Fig. 11-12). Las cadenas laterales de estos residuos sirven, aparentemente, como anclas de la interfase de la membrana, capaces de interaccionar simultneamente con la fase lipdica central y con las fases acuosas a ambos lados de la membrana. Los dominios hidrofbicos de algunas protenas integrales de membrana penetran slo en una hoja de la bicapa. La ciclooxigenasa, diana de la accin de la aspirina, es un ejemplo de ello; sus hlices hidrofbicas no abarcan la totalidad de la membrana sino que interaccionan fuertemente con los grupos acilo de un laclo de la bicapa (vase Recuadro 21-2, Fig. la). No todas las protenas integrales de membrana estn formadas por hlices a transmembrana. Otro motivo estructural tambin comn en las protenas de membrana es el barril /3 (vase Fig. 4-20d), en el que 20 o ms segmentos transmembrana organizados forman hojas 3 que recubren la parte interior de un cilindro (Fig. 11-13). Los mismos factores que favorecen la formacin de hlices a en el interior hidrofbico de una bicapa lipdica estabilizan tambin los barriles /3. Cuando no hay molculas de agua disponibles para formar enlaces de hidrgeno con el oxgeno y el nitrgeno del enlace peptdico, la formacin mxima de puentes de hidrgeno intracatenarios da lugar a la conformacin ms estable. Las hojas 3 planas no maximizan estas interacciones, por lo que no se encuentran generalmente en el interior de la membrana; los barriles 3 permiten todos los enlaces de hidrgeno posibles y son, aparentemente, frecuentes en las protenas de mem-

brana. Las porinas, protenas que permiten el paso de ciertos solutos polares a travs de la membrana externa de la bacteria gram-negativa E. coli, presentan muchos barriles /3 de mltiples cadenas que revisten el paso transmembrana polar. Un polipptido es m s extendido en la conformacin 3 que en una hlice a; entre 7 y 9 residuos en una conformacin j8 son necesarios para atravesar la membrana. Recurdese que en la conformacin 3 las cadenas laterales se alternan a uno y otro lado de la hoja (vase Fig. 4-7). En las cadenas 3 de las protenas de membrana, cada segundo residuo del segmento transmembrana es hidrofbico e interacciona con la bicapa lipdica; en la interfase lpido-protena es frecuente encontrar residuos aromticos. Los d e m s residuos pueden ser o no hidroflicos. La grfica hidroptica no es til para predecir segmentos transmembrana en el caso de protenas con motivos de barril /3, pero a medida que aumenta la base de datos de barriles 3 conocidos es factible hacer predicciones de conformaciones 3 transmembrana basadas en la secuencia. Por ejemplo, se ha predicho, por anlisis de secuencia, que un buen nmero de protenas de membrana de bacterias gramnegativas (Fig. 11-13) contiene barriles 3.
Lpidos unidos covalentemente anclan algunas protenas de membrana

Algunas protenas de membrana contienen uno o ms lpidos unidos covalentemente de varios tipos: cidos grasos de cadena larga, isoprenoides, esterles o derivados glucosilados del fosfatidilinositol, GPI (Fig 11-14). El lipido unido proporciona

11.1

Composicin y arquitectura de las membranas

379

^TNH3

Cys C CH 2 COO"

C ~^wwv w Grupo palmitilo en una Cys interna (o Ser)

O N(J /www 11 -CH, H **<S* CCOCT

Grupo JV-miristilo en una Gly amino-terminal

FIGURA 11-14 Protenas de membrana unidas a lipido. Lpidos unidos covalentemente anclan proteicas z-~ ~-~::' a la bicapa lipdica. Un grupo palmitilo se muestra unido por enlace tioster a un residuo de Cys; un grupo \-miristilo se une generalmente a una Gly amino-terminal; los grupos farnesilo y geranilgeranilo unidos a residuos de Cys carbovicterminales son soprenoides de 15 y 20 carbonos, respectivamente. Estos tres conjuntos de lpido-protena se encuentran slo en la superficie interna de la membrana plasmtica. Los anclajes de glucosil fosatidilinositol (GPI) son derivados del fosatidilinositol en los que el inositol lleva un oligosacrido corto unido covalentemente al residuo carboxiloterminal de una protena a travs de fosfoetanolamina. fas protenas unidas por GPI se encuentran siempre en la superficie extracelular de la membrana plasmtica.

CHoO C

CH CH, S4~W* ' Grupo farnesilo a ____ <j. (o geranilgeranilo) en una NH s Cys carboxilo-terminal lili
I::
+ NH,

^4-

.o

2:

l c N c O p O | Inositol | O | G www c ^
j (

I I I

o
i

OCH2
I

Man |Man|{Man] O
I

V^Sj

' NH

H --|_| 3i

y. OCH2 V A
Vi
m

Interior

Sz

0 = P- -O CHo CH, -NH- -C I "0 O Anclaje GPI en el extremo carboxilo-terminal

Exterior con carbonato alcalino no libera las protenas unidas por GPI, las cuales son, por definicin, protenas integrales. A d e m s de unir una protena a la membrana el lipido unido podra tener una funcin especfica. En la membrana plasmtica, protenas con anclas GPI se presentan exclusivamente en la cara externa y estn confinadas dentro de agrupamientos, tal como veremos ms adelante, mientras que otros tipos de protenas unidas a lpidos (con grupos farnesilo o geranilgeranilo unidos; Fig. 11-14) se encuentran exclusivamente en la cara interior. El anclaje de un lipido especfico a una protena de membrana recin sintetizada tiene, por tanto, una funcin de orientacin, dirigiendo la protena a su correcta localizacin en la membrana.

un anclaje hidrofbico que se inserta en la bicapa lipdica y mantiene la protena en la superficie de la membrana. La fuerza de la interaccin hidrofbica entre una bicapa y una cadena hidrocarbonada simple unida a una protena es suficiente para anclar la protena de forma segura, si bien muchas protenas tienen ms de una porcin lipdica unida. Otras interacciones tales como atracciones inicas entre residuos de L5's de la protena cargados positivamente y los grupos de cabezas polares de los lpidos cargados negativamente, contribuyen probablemente a estabilizar la unin. La asociacin con la membrana de estas protenas unidas a lpidos es ciertamente ms dbil que la asociacin de las protenas integrales de membrana y es, al menos en algunos casos, reversible. Sin embargo, el tratamiento

380

Captulo 11

Membranas biolgicas y transporte

RESUMEN 11.1 Composicin y arquitectura de las membranas

membranas: los movimientos que tienen lugar y las estructuras transitorias permitidas por estos movimientos.
Los grupos acilo del interior de la bicapa estn ordenados en grados diferentes

Las membranas biolgicas definen los lmites de la clula, dividen las clulas en compartimientos discretos, organizan secuencias de reacciones complejas y actan en la recepcin de seales y en transformaciones de energa. Las membranas se componen de lpidos y protenas en una combinacin variable y determinada para cada especie, tipo de clula y orgnulo. El modelo de mosaico fluido describe caractersticas comunes a todas las membranas biolgicas. La bicapa lipdica es la unidad estructural bsica. Cadenas de acilo graso de fosfolpidos y el ncleo esteroideo de los esterles estn orientados hacia el interior de la bicapa; sus interacciones hidrofbicas estabilizan la bicapa pero le dan flexibilidad. Las protenas perifricas estn asociadas dbilmente a la membrana por interacciones electrostticas y puentes de hidrgeno o por anclajes de lpidos unidos covalentemente. Las protenas integrales se asocian fuertemente a las membranas por interacciones hidrofbicas entre la bicapa lpida y sus cadenas laterales de aminocidos apolares, que estn orientadas hacia el exterior de la molcula de protena. Algunas protemas de membrana abarcan la bicapa lipdica varias veces, con secuencias hidrofbicas de aproximadamente 20 residuos aminocidos, formando hlices a transmembrana. Las secuencias hidrofbicas de este tipo detectadas en las protenas pueden ser usadas para predecir su estructura secundaria y la disposicin transmembrana. Barriles 3 multicadena son tambin comunes en las protenas integrales de membrana. Residuos de Tyr y Trp de protemas transmembrana se hallan a menudo en la mterfase lpido-agua. Los lpidos y las protemas de las membranas se insertan en la bicapa con orientacin especfica; as pues, las membranas son estructural y funcionalmente asimtricas. Muchas protenas de membrana contienen oligosacridos unidos covalentemente. Las glucoprotenas de la membrana plasmtica estn siempre orientadas con el dominio portador de glcido en la superficie extracelular. 11.2 Dinmica de membranas Una caracterstica notable de todas las membranas biolgicas es su flexibilidad, es decir, su capacidad de cambiar de forma sin perder su integridad ni dejar salir sus contenidos. La base de esta propiedad se encuentra en las interacciones no covalentes entre lpidos de la bicapa y los mornientos permitidos a los lpidos individuales, ya que no estn unidos entre s de forma covalente. Anaramos seguidamente la dmrvvica de las

Aunque la estructura de la bicapa lipdica es bastante estable, las molculas individuales de fosfolpidos y esterles tienen una gran libertad de movimiento (Fig. 11-15). La estructura y flexibilidad de la bicapa lipdica dependen de la temperatura y de los tipos de lpidos presentes. A temperatura relativamente baja los lpidos de la bicapa forman una fase de gel semislida en la que estn constreidos fuertemente todos los tipos de movimiento de las molculas individuales de lipido; la bicapa es paracristalina (Fig. ll-15a). A temperaturas relativamente elevadas las cadenas hidrocarbonadas individuales de los cidos grasos estn en movimiento constante producido por rotacin alrededor de los enlaces carbono-carbono de las largas cadenas laterales acilo. En este estado lquido desordenado, o estado fluido (Fig. 11-15b), el interior de la bicapa es ms fluido que slido y la bicapa es como un mar de lpidos en movimiento constante. A temperaturas intermedias, los lpidos se encuentran en un estado lquido ordenado; hay menos movimiento trmico de las cadenas acilo de la bicapa lipdica, pero an tiene lugar el movimiento lateral en el plano de la bicapa. Estas diferencias en el estado de la bicapa se observan (a) Estado paracristalino (gel) i [ 91
m m

(b) Estado fluido

El calor produce movimiento trmico de las cadenas laterales (transicin gel > fluido)

FIGURA 11-15 Dos estados de los lpidos de la bicapa. (a) En el estado paracristalino, o fase de gel, los grupos de cabeza polares estn ordenados uniformemente en la superficie y las cadenas acilo estn casi quietas y empaquetadas con una geometra regular; (b) en el estado lquido desordenado, o fluido, las cadenas acilo experimentan mucho movimiento trmico y no tienen una organizacin regular. Entre estos dos extremos se halla el estado lquido ordenado, en el que las molculas de fosfolpidos individuales pueden difundir lateraImente pero 'ios grupos ado permanecen extendidos y ordenados.

11.2

Dinmica de membranas

381

fcilmente en los liposomas compuestos por un nico lipido, pero las membranas biolgicas contienen muchos lpidos con una gran variedad de cadenas acilo graso, por lo que no muestran cambios de fase abruptos con la temperatura. A temperaturas fisiolgicas (entre unos 20 y 40 C) los cidos grasos saturados de cadena larga (tales como 16:0 y 18:0) se empaquetan bien en una disposicin lquida ordenada, pero los giros de los cidos grasos insaturaclos (vase Fig. 10-1) interfieren en este empaquetamiento favoreciendo el estado lquido desordenado. Los grupos acilo graso de cadena corta tienen el mismo efecto. El contenido en esterles de una membrana (que vara muchsimo con el organismo y el organillo; Tabla i 1-1) es otro determinante importante del estado lipdico. La estructura plana rgida del ncleo esteroideo, insertado entre cadenas laterales de acilo graso, reduce la libertad de las cadenas acilo graso vecinas para moverse por rotacin alrededor de los enlaces carbono-carbono, forzando a las cadenas a adoptar su conformacin totalmente extendida. La presencia de esterles reduce, por consiguiente, la fluidez en el centro de la bicapa, favoreciendo de este modo la fase lquida ordenada, al tiempo que incrementa, el grosor de la hoja lipdica (tal como se describe ms adelante). Las clulas regulan su composicin lipdica de forma que se consigue una fluidez constante en diversas condiciones ele crecimiento. Por ejemplo, cuando se cultivan a baja temperatura las bacterias sintetizan ms cidos grasos insaturaclos y menos cidos saturados que cuando se cultivan a temperaturas elevadas (Tabla 11-2). Como resultado de este ajuste en la composicin lipdica, las membranas de las bacterias cultivadas a altas o bajas temperaturas tienen aproximadamente el mismo grado de fluidez.
El movimiento de lpidos transbicapa requiere catlisis

(a) Difusin transversal sin catalizar "flip-flop"

M
muy lenta ( j . en das)

(b) Difusin transversal catalizada por una fiipasa

OCO

o o o

Fiipasa

rpida (t i, en BegUIldos)

XX)

(c) Difusin transversal sin catalizar /// M! 1 i i| j M :'\v.\..i ;.'/\

muy rpida
(1 flm/s)

111;;;;

iMIS
jOOO

A temperatura fisiolgica la clifusin transbicapa -o "flip-flop"de una molcula de una cara a otra de la bicapa (Fig. 1-16a), si es que tiene lugar, es muy lenta en la mayora de membranas.

FIGURA 11-16 Movilidad de fosfolpidos individuales en una bicapa. (a) El movimiento de una cara a la otra es muy lento, a menos que (b) est catalizado por una fiipasa; por el contrario, la difusin lateral dentro de la hoja (c) es muy rpida y no requiere catlisis proteica.

TABLA 11-2 Composicin de cidos grasos de las clulas de E. coli cultivadas a diferentes temperaturas Porcentaje total de cidos grasos*

cido mirstico (14:0) cido palmtico (16:0) cido palmitoleico (16:1) cido oleico (18:1) cido hidroximirstico Relacin insaturados/saturados

4 18 26 38 13 2,9

4 25 24 34 10 2,0

4 29 23 30 10 1,6

8 48 9 12 8 0,38

Fuente: datos de Marr, A.G. & Ingraham, J.t. (1962) Effect of temperatura on the composition of fatty acids n Escherichia coli.J. Bacterio/. 84, 1260. "ta composicin exacta de cidos grasos depende no slo de la temperatura de crecimiento sino tambin de la etapa de crecimiento y de la composicin del medio de cultivo. 'Calculada como porcentaje total de 16:1 ms 18:1 dividido por el porcentaje total de 14:0 ms 16:0. El cido hidroximirstico se omiti en este clculo.

382

Captulo 11

Membranas biolgicas y transporte

El movimiento transbicapa requiere que un grupo de cabeza polar o cargado abandone su entorno acuoso y se traslade al interior hidrofbico de la bicapa, proceso que tiene una gran variacin positiva de energa libre. Hay situaciones, sin embargo, en las que tal movimiento es esencial. Por ejemplo, durante la sntesis de la membrana plasmtica bacteriana, se producen fosfolpidos en la superficie interior de la membrana que han de experimentar una difusin flip-flop para penetrar en la cara externa ele la bicapa. Una difusin transbicapa similar tambin es necesaria en las clulas eucariticas cuando los lpidos de membrana sintetizados en un organillo han de pasar de la hoja interna a la externa y de all a otros orgnulos. Hay una familia de protenas, las flipasas (Fig. ll-16b), que facilitan la difusin flip-flop, proporcionando un paso transmembrana que es energticamente ms favorable que la difusin no catalizada.
Lpidos y protenas difunden lateralmente en la bicapa

rescencia, ya que molculas de lipido no decoloradas difunden al trozo decolorado a la vez que molculas de lipido decoloradas difunden fuera del mismo. La velocidad de recuperacin de la fluorescencia despus de la fotodecoloracin o FRAP (fluorescent recovery after photobleaching) es una medida de la velocidad de difusin lateral de los lpidos. Utilizando la tcnica FRAP se ha demostrado que algunos lpidos de membrana difunden lateralmente a una velocidad de hasta 1 xm/s.

Las molculas de lipido individuales pueden trasladarse lateralmente en el plano de la membrana intercambiando su sitio con molculas lipdicas vecinas (Fig. ll-16c). Una molcula de una de las capas, o cara, de la bicapa -la cara externa de la membrana plasmtica de eritrocito, por ejemplo- puede difundir lateralmente con tal rapidez que puede dar la vuelta completa al eritrocito en segundos. Esta rpida difusin lateral dentro del plano de la bicapa tiende a hacer aleatoria la posicin de las molculas individuales en unos pocos segundos. Se puede demostrar experimentalmente la difusin lateral mediante la unin de sondas fluorescentes a los grupos de cabeza de lpidos y utilizando la microscopa de fluorescencia para seguir las sondas en funcin del tiempo (Fig. 11-17). En una de las tcnicas se decolora una pequea regin (5 u.m2) de una superficie celular con lpidos marcados con fluorescencia por medio de radiacin lser intensa, de modo que el trozo irradiado ya no emite fluorescencia cuando se observa a la luz mucho m s tenue del microscopio de fluorescencia. Sin embargo, en cuestin de milisegundos la regin recupera su fluoFIGURA 11-17 Medicin de las velocidades de difusin lateral de lpidos mediante recuperacin de la fluorescencia despus de la fotodecoloracin (FRAP). tos lpidos de la hoja exterior de la membrana plasmtica se marcan mediante una reaccin con una sonda fluorescente impermeable a la membrana (rojo), de manera que la superficie queda marcada uniforme, cuando se observa al microscopio de fluorescencia. Se decolora una pequea rea por irradiacin con un haz lser intenso, con lo que esta rea deja de ser fluorescente. Con el paso del tiempo, molculas de lipido marcadas difunden hacia la regin decolorada, con lo que vuelve a ser fluorescente. A partir de la recuperacin de la fluorescencia en funcin del tiempo puede determinarse el coeficiente de difusin del lipido marcado. Las velocidades son normalmente elevadas; un lipido que se desplace a esta velocidad podra circunnavegar E. coli en un segundo. (El mtodo FRAP tambin se puede utilizar para medir la difusin lateral de protenas de membrana.)

Un haz lser intenso decolora

11.2

Dinmica de membranas

383

FIGURA 11-18 Difusin a saltos de molculas z- p o individuales. El movimiento de una nica molcula e : : : " : -escente en una superficie celular se registra en vdeo por microscopa de fluorescencia, con una resolucin en el tiempo de 25 fis equivalente a 40.000 marcos/s). El trazo aqu mostrado representa ura ~:.e:.!a seguida durante 56 ms (un total de 2250 marcos;; el trazo empieza en el rea prpura y contina a travs de las reas azul, verde y naranja. El patrn de movimiento indica difusin rpida dentro de j.na -esicr confinada (alrededor de 250 nm de dimetro, sealada por un solo color), con saltos ocasionales a una regin adyacente. Este descubrimiento sugiere que los lpidos se encuentran cercados por vallas moleculares que pueden saltar de vez en cuando.

Otra tcnica, el rastreo de una sola partcula, permite seguir el movimiento de una nica molcula de lipido en la membrana plasmtica en una escala de tiempo mucho menor. Los resultados de estos estudios confirman la rpida difusin lateral dentro de regiones concretas pequeas de superficie celular y demuestran que el movimiento de una de estas regiones a una regin vecina est inhibido; los lpidos se comportan como si estuviesen cercados por vallas que slo pueden saltar ocasionalmente (Fig. 11-18). Protenas intercambiadoras Glicoforina de cloruro-bicarbonato Exterior

Membrana plasmtica Anquirina Espectrina Trazo de una molcula de lipido individual Complejo de unin (actina) Interior
FIGURA 11-19 Movilidad restringida del ntercambiador cloruro-bicarbonato de eritrocito, ta protena abarca la membrana y se liga a la protena citoesqueltica espectrina mediante otra protena, la anquirina, limitando su movilidad lateral, ta anquirina est anclada a la membrana por una cadena lateral de palmitilo unida covalentemente (vase Fig. 11-14). La espectrina, una protena larga y filamentosa, se entrecruza en complejos de unin que contienen actina. Una red de molculas de espectrina entrecruzadas unidas a la cara citoplasmtica de la membrana plasmtica estabiliza la membrana frente a deformaciones. Esta red de protenas de membrana ancladas puede ser el "corral" sugerido por el experimento de la Figura 11-18; los rastros de lipido aqu mostrados estn confinados a subregiones definidas por las protenas de membrana ligadas.

Muchas protenas de membrana parecen flotar en un mar de lpidos. Al igual que los lpidos de membrana, ests protenas tienen libertad para difundir lateralmente en el plano de la bicapa y estn en movimiento constante, tal como se demuestra mediante la tcnica FRAP con protenas de superficie con marcadores fluorescentes. Algunas protenas de membrana se asocian formando grandes agregados ("parches") en la superficie de la clula u orgnulo, donde las protenas no se mueven una con respecto a las otras; por ejemplo, los receptores de acetilcolina (vase Fig. 11-51) forman densos parches en las membranas plasmticas neuronales de las sinapsis. Otras protemas de membrana estn ancladas a estructuras internas que evitan su libre difusin. En la membrana del eritrocito, tanto la glicoforina como el intercambiador de bicarbonato y cloruro (p. 395) estn ligados a la espectrina, una protena filamentosa del citoesqueleto (Fig. 11-19). Una explicacin posible del patrn de difusin lateral de las molculas de lipido mostrado en la Figura 11-18 es que las protenas de membrana inmovilizadas por su asociacin con la espectrina son las "vallas" que definen las regiones de movimiento lipdico relativamente no restringido.
Los esfingolpidos y el colesterol se agrupan conjuntamente en balsas de membrana

Hemos visto que la difusin de los lpidos de membrana de una cara de la bicapa a la otra es muy lenta a menos que est catalizada y que las diferentes especies de lipido de la membrana plasmtica estn distribuidos de manera asimtrica en las dos hojas de la bicapa (Fig. 11-5). Incluso dentro de una misma hoja, la distribucin de lpidos no es aleatoria. Los glucoesfingolpidos (cerebrsidos y ganglisidos), que contienen mayoritariamente cidos grasos saturados de cadena larga, forman agrupaciones transitorias en la hoja externa que excluyen prcticamente los glicerofosfolpiclos, los cuales contienen habitualmente un grupo acilo graso insaturado y un grupo acilo graso saturado ms corto. Los grupos acilo saturados largos de los esfingolpiclos pueden formar asociaciones ms compactas y estables con el largo sistema anular del colesterol que las ca-

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Captulo 11

Membranas biolgicas y transporte

RECUADRO 11-1
Microscopa de fuerza atmica para visualizar protenas de membrana

BIOQUIMICA PRACTICA

En la microscopa de fuerza atmica (AFM), se desplaza la punta fina de una sonda microscpica unida a un brazo de palanca flexible a travs de una superficie irregular tal como una membrana (Fig. 1). Las interacciones electrostticas y de van der Waals entre la punta y la muestra producen una fuerza que desplaza la sonda arriba y abajo (en la dimensin z) a medida que encuentra colinas y valles en la muestra. Un rayo lser reflejado desde el brazo de palanca detecta movimientos de tan slo 1 A. En un tipo de microscopio de fuerza atmica se mantiene constante la fuerza sobre la sonda (en relacin a ma fuerza estndar, del orden de piconewtons) mediante un circuito de retroalimentacin que hace que la plataforma que sostiene la muestra suba o baje para mantener la fuerza constante. Una serie de barridos en las dimensiones X e y (el plano de la membrana) proporciona un mapa de curvas de nivel tridimensional en la superficie con una resolucin prxima a la escala atmica (0,1 nm en la dimensin vertical y de 0,5 a 1,0 nm en las dimensiones laterales). Las balsas de membrana mostradas en la Figura 11-20b se obtuvieron con esta tcnica. En casos favorables, puede utilizarse la AFM para estudiar molculas proteicas mdividuales de ma membrana. Las molculas individuales de la bacteriorrodopsina de las membranas prpura de la bacteria Halobacterium salinarum (vase Fig. 11-9) se ven como estructuras muy regulares (Fig. 2a). Cuando se superponen una serie de imgenes de unidades individuales con la ayuda de un ordenador, se refuerzan entre s las partes reales de la imagen y se elimina el ruido de fondo de las imgenes individuales, se obtiene una imagen de alta resolucin de la protena (inserto de la Fig.

Detector de luz lser

La plataforma se desplaza para mantener una presin constante sobre la punta del brazo de palanca. Se representan desplazamientos en la direccin z en funcin de x, y.

FIGURA 1

2a). La AFM de la acuaporina purificada de E. coli, reconstituida en bicapas lipdicas y vista como si se mirase desde el exterior de una clula, muestra los detalles finos de los dominios periplasmticos de la protena (Fig. 2b). La AFM tambin revela que F 0 , el rotor impulsado por protones de la ATP sintasa del cloroplasto (p. 742), est compuesta por muchas subunidades (14 en la Fig. 2c) dispuestas en un crculo.

mmih 2

denas ms cortas y a menudo insaturadas de los fosfolpidos. Los microdominios de colesterol-esingolpidos de la hoja externa de la membrana plasmtica, visibles por microscopa de fuerza atmica (Recuadro 11-1), son ligeramente ms gruesos y ms ordenados (menos fluidos) que los microdominios vecinos ricos en fosfolpidos (Fig. 11-20) y son ms difciles de di-

solver con detergentes no inicos; se comportan como balsas de esfingolpido de estructura lquida ordenada a. la deriva en un ocano de fosfolpidos de estructura lquida desordenada. Estas balsas de lpidos contienen una cantidad elevada de dos clases de protenas integrales de membrana: las que estn ancladas a la membrana mediante dos cidos grasos saturados

11.2

Dinmica de membranas

385

Balsa enriquecida en esfingolpidos, colesterol I

(b)
FIGURA 11-20 Microdominios (balsas) de la membrana plasmtica. (a) Asociaciones estables de esfingolpidos y colesterol en la hoja externa producen un microdominio, ligeramente ms grueso que las otras regiones de la membrana, que est enriquecido con tipos especficos de protenas de membrana, tas protenas unidas por CPI se encuentran normalmente en la hoja externa de estas balsas, mientras que protenas con uno o varios grupos acilo de cadena larga unidos covalentemente son frecuentes en la hoja interna. La caveolina se encuentra de modo preferente en balsas curvadas hacia el interior denominadas caveolas (vase Fig. 11-21). Las protenas con grupos premio unidos (tales como Ras; vase Fig. 12-6) tienden a ser excluidas de las balsas. (b) El mayor espesor de las regiones de balsa puede visualizarse mediante microscopa de fuerza atmica (vase Recuadro 11-1). En esta vista de una regin de membrana, podemos ver las balsas sobresaliendo de un ocano de bicapa lipdica; en las balsas, los picos agudos representan las protenas unidas por GPI. Obsrvese que estos picos se encuentran casi exclusivamente en las balsas.

de las balsas de esfingolpido/colesterol (Fig. 11-2" a ' Los dominios "balsa" y "mar" de la membrana plasman::?. r_: separados de manera rgida; las protenas de memcrar.s ::.::::': desplazarse hacia dentro y hacia fuera de las balsas a- a::::: en una escala de tiempo de segundos. Pero en la ie tiempo ms corta (microsegundos), ms adecuada para muchos procesos bioqumicos en los que intervienen merrrar:a=. muchas de estas protenas residen principalmente en la balsa. Se puede calcular la fraccin de superficie celular pada por balsas a partir de la fraccin de membrana plasmtica que resiste la solubilizacin por detergentes, la cual, en algunos casos, puede llegar a ser del 50%: las balsas cubren la mitad del ocano (Fig. ll-20b). Medidas indirectas en cultivos de fibroblastos sugieren que una balsa individual tiene aproximadamente un dimetro de 50 nm, lo que corresponde a un parche con irnos cuantos miles de esfingolpidos y quiz de 10 a 50 protemas de membrana. Debido a que la mayora de clulas expresan ms de 50 clases diferentes de protenas de la membrana plasmtica, es probable que una sola balsa contenga slo un subconjunto de protenas de membrana y que esta segregacin de protenas de membrana sea significativa. Para un proceso en el que interviene la interaccin de dos protenas de membrana, su presencia en una misma balsa aumentara sustancialmente la probabilidad de su colisin. Ciertos receptores de membrana y protenas de sealizacin, por ejemplo, parecen estar segregados conjuntamente en balsas de membrana. Se han hecho experimentos que muestran que se puede interferir en la sealizacin a travs de estas protenas mediante manipulaciones que eliminan el colesterol de la membrana plasmtica y destruyen las balsas de lpidos.
Las caveolinas definen una clase especial de balsas de membrana

de cadena larga unidos de forma covalente (dos grupos palmitilo o un grupo palmitilo 5' uno miristilo) y las que estn unidas por GPI (Fig. 11-14). Probablemente, estas anclas lipdicas, lo mismo que las cadenas acilo de los esfingolpidos, forman asociaciones ms estables con el colesterol y los grupos acilo largos de las balsas que con los fosfolpidos que las rodean. [Es de notar que otras protenas unidas a lpidos, las que contienen grupos isopremlo tales como el farnesilo unidos de forma covalente, no se asocian preferentemente con la hoja externa

La caveolina es una protena integral de membrana con dos dominios globulares conectados por un dominio hidrofbico en forma de horquilla que une la protena a la hoja citoplasmtica de la membrana plasmtica. El anclaje a la membrana se refuerza con tres grupos palmitilo unidos al dominio globular carboxilo-terminal. La caveolina (de hecho una familia de caveolinas relacionadas) une colesterol en la membrana y la presencia ele caveolina fuerza a la bicapa lipdica asociada a curvarse hacia dentro, formando caveolas ("pequeas cuevas") en la superficie de la clula (Fig. 11-21). Las caveolas son balsas especiales: intervienen ambas hojas de la bicapa (la hoja citoplasmtica, de la que se proyectan los dominios globulares de la caveolina, y la hoja exoplasmtica, una balsa tpica de esfingolpidos/colesterol con protenas asociadas ancladas por GPI). Las caveolas intervienen en diversas funciones celulares, entre las que se incluyen el trfico a travs de membranas dentro de las clulas y la transduccin de seales externas en respuestas celulares. Los receptores de la insulina y de otros factores de crecimiento, as como ciertas protenas de unin a GTP y protenas quinasa asociadas con la sealizacin transmembrana, parecen estar localizados en balsas y, quizs, en caveolas. En el Captulo 12 se tratan algunas funciones posibles de las balsas en la sealizacin.

386

Captulo 11

Membranas biolgicas y transporte

Membrana plasmtica

Exterior Interior

Ciertas protenas integrales favorecen las interacciones intercelulares y la adhesin

A.
t

Caveola

^ r

D m e r o de caveolina (seis porciones acilo graso)

FIGURA 11-21 la caveolina fuerza la curvatura hacia adentro de las membranas. La protena caveolina tiene un dominio central hidrofbico y tres grupos acilo de cadena larga sobre cada unidad monomrica que mantienen la molcula en el interior de la membrana plasmtica. Cuando una serie de dmeros de caveolina se concentra en una pequea regin (una balsa) fuerza la curvatura de la bicapa lipdica, formando una caveola.

Varias familias de protenas integrales de la membrana plasmtica proporcionan puntos especficos de anclaje entre clulas o entre una clula y protenas de la matriz extracelular. Las integrinas son protenas heterodimricas (con dos subunidades diferentes, a y f) ancladas a la membrana plasmtica por una simple hlice hidrofbica transmembrana en cada subunidad (Fig 11-22; v a s e tambin Fig. 7-30). Los dominios extracelulares grandes de las subunidades a y 3 se combinan para formar un sitio especfico de unin para protenas extracelulares tales como el colgeno y la fibronectina. Dado que existen 18 subunidades a diferentes y al menos 8 subunidades f3 diferentes, se puede generar una gran variedad de especificidad a partir de diversas combinaciones de a y 3. Un determinante comn de la unin de las integrinas en diversas asociaciones extracelulares de las integrinas es la secuencia Arg-Gly-Asp (RGD). Las integrinas no son meros adhesivos; actan tambin como receptores y transductores de seales transportando informacin a travs de la membrana plasmtica en ambas direcciones. Las integrinas regulan muchos procesos, entre los que se incluyen la agregacin plaquetaria en el sitio de una herida, la reparacin tisular, la actividad de clulas irtrnunitarias y la invasin de un tejido por una tumor. La mutacin de un gen de la integrina que codifica la subunidad 3, conocida como CD18, es la causa de la deficiencia de adhesin leucocitaria en humanos, una extraa enfermedad gentica en la que los leucocitos son incapaces de atravesar los vasos sanguneos para alcanzar el sitio de la infeccin (vase Fig. 7-33). Nios con una deficiencia grave en CD18 mueren normalmente a causa de infecciones en los dos primeros aos de vida.
FIGURA 11-22 Cuatro ejemplos de tipos de protenas integrales que actan en interacciones intercelulares. Las integrinas consisten en polipptidos a y / 3 transmembrana; sus dominios extracelulares se combinan para formar sitios de unin de iones metlicos clivalentes y protenas de la matriz extracelular (tales como el colgeno y la fibronectina) o protenas de superficie especficas de otras clulas, ta caderina tiene cuatro dominios extracelulares que unen Ca , el ms dista! de los cuales contiene el sitio que se une a caderina en otra superficie celular. N-CAM (molcula de adhesin a clulas neuronales) es una de una familia de protenas similares a inmunoglobulinas que facilitan las interacciones independientes de Ca con protenas de superficie de clulas cercanas. Las selectinas se unen fuertemente a glcidos en clulas vecinas; la unin es dependiente de Ca .
2+ 2+ 2+

R e g i n que une ligando 0 Exterior afila

Dominio adhesivo

Dominios similares a inmunoglobulinas Dominio lectina (une glcidos)

f"
^lly - ,

5
Membrana plasmtica )Yr Selectina

! 'W< N-CAM

' v

<

Interior Integrina

Caderina

11.2

Dinmica de membranas

387

Al menos otras tres familias de protenas de membrana plasmtica intervienen tambin en la adhesin superficial (Fig. 11-22). Las caderillas experimentan interacciones homoflicas ("con la misma clase") con caderinas idnticas en clulas adyacentes. Las protenas tipo inmunoglobulinas pueden experimentar interacciones homoflicas con sus copias idnticas de otra clula o heteroflicas con una integrina de una clula vecina. Las selectinas tienen dominios extracelulares que, en presencia, ele Ca 2+ , unen polisacridos especficos de la superficie de una clula adyacente. Estn presentes principalmente en los diversos tipos de clulas sanguneas y endoteliales que tapizan los vasos sanguneos (vase Fig. 7-33). Son una parte esencial del proceso de coagulacin de la sangre. Las protenas integrales intervienen en muchos otros procesos celulares. Actan como transportadores y canales inicos (como se tratar en la Seccin 11.3) y como receptores de hormonas, neurotransmisores y factores de crecimiento (Captulo 12). Son esenciales en la fosforilacin oxidativa y la fotosntesis (Captulo i 9) y en el reconocimiento clula-clula y antgeno-clula del sistema inmunitario (Captulo 5). Las protenas integrales de membrana tambin juegan un importante papel en la fusin de membranas que acompaa a la exocitosis, la endocitosis y la entrada de un gran nmero de virus en las clulas husped.
La fusin de las membranas es crucial en muchos procesos biolgicos

Brote de vesculas desde el complejo de Golgi Exocitosis Endocitosis Fusin de endosoma y lisosoma Infeccin vrica ||

Fusin de pequeas vacuolas (plantas) Separacin de dos membranas plasmticas en la divisin celular /
FIGURA 11-23 Fusin de membranas, ta fusin de dos membranas es fundamental en multitud de procesos celulares en los que intervienen tanto orgnulos como la membrana plasmtica.

Una propiedad notable de las membranas biolgicas es su capacidad para fusionarse con otras membranas sin perder su continuidad. Aunque las membranas son estables, ello no quiere decir que sean estticas. Dentro del sistema endomembranoso eucaritico (que incluye la membrana nuclear, el retculo endoplasmtico, el Golgi y varias vesculas pequeas) hay una reorganizacin constante de los compartimientos membranosos. Hay pequeas vesculas que brotan del retculo endoplasmtico para llevar lpidos y protenas recin sintetizados a los restantes orgnulos y a la membrana plasmtica. La exocitosis, endocitosis, divisin celular, fusin del huevo y el espermatozoide y la entrada de un virus con envoltura membranosa dentro ele la clula husped implican la reorganizacin de la membrana, donde la operacin fundamental es la fusin ele dos segmentos membranosos sin prdida de continuidad (Fig. 11-23). La fusin especfica de dos membranas requiere que (1) se reconozcan entre s; (2) sus superficies estn muy cerca, lo que requiere la elmnacin ele las molculas ele agua normalmente asociadas con los grupos de cabeza polares ele los lpidos; (3) sus estructuras en bicapa se rompan localmente dando lugar a la fusin de la hoja externa de cada membrana (hemifusin); y (4) sus bicapas se fusionen formando una bicapa nica continua. La endocitosis mediada por receptor, o secrecin regulada, tambin requiere que (5) el proceso ele fusin se desencadene en el momento apropiado o como respuesta a una seal especfica. Las protenas integrales llamadas protenas de fusin favorecen estos procesos, promoviendo un reconocimiento especfico y una distorsin local transitoria ele la

estructura de la bicapa que favorecen la fusin de la membrana. (Obsrvese que estas protenas de fusin no estn relacionadas con el producto de dos genes fusionados, tambin llamados protemas de fusin, descritos en el Captulo 9.) Dos casos ele fusin de membrana estn muy bien estudiados: la entrada en una clula husped de un virus con envoltura membranosa tal como el virus de la gripe y la liberacin de neurotransmisores por exocitosis. Ambos procesos necesitan complejos de protenas de fusin que experimentan cambios de conformacin espectaculares. El virus de la gripe est rodeado por una membrana que contiene, entre otras protenas, muchas molculas de la protena hemaglutinina (HA) (su nombre proviene de su capacidad de aglutinar eritrocitos). El virus entra en una clula husped por induccin de endocitosis, que encierra el virus en un endosoma, una vescula membranosa pequea con un pH de alrededor de 5 (Fig. 11-24). A este pH se produce un cambio ele conformacin de la protena HA, que expone una secuencia dentro de la protema HA llamada pptido de fusin que permite que la protena penetre en la membrana endosmica. La membrana endosmica y la membrana vrica estn ahora conectadas a travs de la protena HA. A continuacin la protena HA se curva por la mitad formando una horquilla que pone en contacto los dos extremos. Esto tira de las dos membranas, ciue se sitan una al lado de la otra, y produce la fusin de la

388

Captulo 11

Membranas biolgicas y transporte

Citosol Vescula secretora

La vescula llena de neurotransmisor se acerca a la membrana plasmtica. Molculas de neurotransmisor v-SNARE t-SNARE Membrana plasmtica v-SNARE y t-SNARE se unen entre s, cerrndose como una cremallera desde los extremos amino-terminales y acercando las dos membranas.

Clula h u s p e d Virus

El virus se une a los receptores de cido silico en la superficie del husped.

El virus desencadena la endocitosis; queda encerrado en un endosoma. La protena HA en la forma a pH 7 tiene los pptidos de fusin sepultados. Protena HA (trmero) El bajo pH del endosoma provoca la extensin de los pptidos de fusin de la protena HA, que se insertan en la membrana e n d o s m i c a .

El cierre de la cremallera produce curvatura y tensin lateral sobre las bicapas, favoreciendo la hemifusin entre las hojas externas y dando lugar a la formacin de un espacio vaco desfavorable energticamente.

Espacio vaco inestable Las hojas internas de las dos membranas se ponen en contacto.

Pptido de fusin

La protena HA se pliega en horquillas, poniendo en contacto las membranas vrica y e n d o s m i c a . Horquillas HA El pptido de fusin de HA rompe localmente la membrana, d n d o s e la hemifusin; la monocapa externa del virus se funde con la monocapa interna del endosoma. fusin completa permite que los contenidos vricos entren el citoplasma.

La fusin completa crea un poro de fusin. El poro se ensancha; el contenido de las vesculas se vierte al exterior de la clula.

FIGURA 11-24 Fusin inducida por la protena hemaglutinina (HA) durante la infeccin vrica, (a) La protena HA est expuesta en la superficie de la membrana del virus de la gripe. Cuando el virus pasa del pH neutro del fluido intersticial al compartimiento de pH bajo (endosoma) de la clula husped, HA experimenta un cambio importante de forma que facilita la fusin de las membranas vrica y endosmica, liberando los contenidos vricos en el citoplasma.

FIGURA 11-25 Fusin durante la liberacin de neurotransmisor en una sinapsis. La membrana de la vescula secretora contiene la v-SNARE sinaptobrevina (rojo). La membrana diana (plasmtica) contiene las t-SNARE sintaxina (azul) y SNAP25 (violeta). Cuando un aumento local de [Ca ] seala la liberacin del neurotransmisor, v-SNARE, SNAP25 y t-SNARE interaccionan formando un haz enrollado de cuatro hlices a, tirando conjuntamente de las dos membranas y rompiendo localmente la bicapa, lo que lleva a la fusin de membranas y liberacin de neurotransmisor.
2+

11.3 membrana vrica con la membrana endosmica. La protena HA funciona como un trmero (Fig. 11-24). En su forma a pH bajo, tres dominios de la HA en el extremo cerrado de la horquilla se retuercen entre s, con lo que se forma una estructura estable helicoidal. En el proceso de fusin hay una etapa intermedia (hemifusin) en la que la hoja externa de la membrana vrica est fusionada con la hoja interna de la membrana endosmica mientras que las otras dos hojas mantienen su continuidad. En el punto de la hemifusin, la bicapa lipdica ha de desorganizarse temporalmente, probablemente a causa de los dominios del pptido de fusin de HA. La fusin completa da lugar a la liberacin del contenido vrico en el citoplasma de la clula husped. Los neurotrasmisores se liberan en las sinapsis cuando vesculas intracelulares cargadas con neurotransmisor se fusionan con la membrana plasmtica. Este proceso requiere una familia de protenas Damadas SNARE (Fig. 11-25). Las protenas SNARE de la cara citoplasmtica de las vesculas intracelulares se llaman v-SNARE; las que estn en las membranas diana con las que se fusionan las vesculas se llaman t-SNARE. Tambin intervienen otras dos protenas, SNAP25 y NSF Durante la fusin las v- y t-SNARE se unen entre s y experimentan un cambio estructural que produce un haz de varillas largas y delgadas formadas por hlices de las v- y t-SNARE as como dos hlices de SNAP25 (Fig. 11-25). Inicialmente las dos SNARE interaccionan por sus extremos y a continuacin cierran como una cremallera el haz de hlices. Este cambio estructural pone en contacto las dos membranas y se inicia la fusin de sus bicapas lipccas. El complejo de SNARE y SNAP25 es la diana de la potente toxina de Closlridium botulinum, una proteasa que corta enlaces especficos de estas protenas, impidiendo la neurotransmisin y causando la consiguiente muerte del organismo. Debido a su elevaclsima especificidad por estas protenas, se ha utilizado la toxina botulnica purificada como herramienta para analizar el mecanismo de la liberacin de neurotransmisores in vivo e in vitro.
RESUMEN 11.2 Dinmica de membranas

Transporte de solutos a travs

de membranas

389

membrana que estn unidas per : a ." -porciones acilo graso de cadena a-a -. La caveolina es una protena integral a- - -:: :rarra que se asocia con la hoja interna a a 1?. raarrt narra plasmtica, obligndola a curvarse hacia dentro para formar caveolas, que intervienen en el transporte a travs de membranas y en la sealizacin. Las caveolinas son protenas transmembrana de 1:-. membrana plasmtica que actan para unir clulas entre s y para transportar mensajes entre la matriz extracelular y el citoplasma. Protenas especficas intervienen en la fusin de dos membranas que acompaa a procesos tales como la invasin vrica, la endocitosis y la exocitosis.
11.3 Transporte de solutos a travs de membranas

Los lpidos de una membrana biolgica pueden existir en estado lquido ordenado o desordenado; en este ltimo caso, el movimiento trmico de las cadenas acilo hace que el interior de la bicapa sea fluido. La fluidez se ve afectada por la temperatura, la composicin de cidos grasos y el contenido en esterles. La difusin flip-flop de lpidos entre las hojas interna y externa de una membrana es muy lenta excepto cuando est catalizada especficamente por flipasas. Los lpidos y protenas pueden difundir lateralmente dentro del plano de la membrana, pero esta movilidad est limitada por interacciones de las protenas de membrana con estructuras internas del citoesqueleto e interacciones de lpidos con balsas de lpidos. Una clase de balsas de lpidos contiene esfingolpidos y colesterol con un subconjunto de protenas de

Todas las clulas vivas deben adquirir de su alrededor las materias primas para la biosntesis y para la produccin de energa y deben liberar a su entorno los productos secundarios del metabolismo. Unos pocos compuestos apolares pueden disolverse en la. bicapa lipdica y cruzar la membrana sin ms ayuda, pero en el caso de compuestos polares o cargados o iones es esencial una protena de membrana para el transporte transmembrana. En algunos casos una protena de membrana simplemente facilita la difusin de un soluto a favor de su gradiente de concentracin, pero en muchas ocasiones el transporte tiene lugar contra un gradiente de concentracin, carga elctrica o ambos, en cuyo caso los solutos han de "bombearse" en un proceso que requiere energa (Fig. 11-26). La energa puede venir directamente de la hidrlisis del ATP o puede suministrarse en forma de movimiento de otro soluto a favor de su gradiente electroqumico con suficiente energa como para transportar otro soluto contra gradiente. Los iones tambin pueden ser transportados a travs de las membranas va canales inicos formados por protemas o pueden ser transportados por ionforos, que son molculas pequeas que enmascaran la carga de los iones y permiten que difundan a travs de la bicapa lipdica. Con unas pocas excepciones, el trfico de molculas pequeas a travs de la membrana plasmtica est mediado por protenas tales como canales transmembrana, transportadores y bombas. Dentro de la clula eucaritica, los diferentes compartimientos tienen diferentes concentraciones de intermediarios metablicos, productos e iones, y stos tambin deben transportarse a travs de las membranas intracelulares en procesos mediados por protenas sujetos a una fuerte regulacin.
Protenas de membrana facilitan el transporte pasivo

Cuando dos compartimientos acuosos que contienen diferentes concentraciones de un componente soluble o un ion estn separados por una divisin permeable (membrana), el soluto se desplaza por difusin simple desde la regin con una concentracin ms elevada, a travs de la membrana, a la regin

390

Captulo 11

Membranas biolgicas y transporte

Difusin simple (compuestos apolares nicamente, a favor de gradiente de concentracin)

Difusin facilitada (a favor de gradiente electroqumico) Transporte activo primario (contra gradiente electroqumico)

Transporte inico facilitado por ionforo (a favor de gradiente electroqumico)

Canal inico (a favor de gradiente electroqumico; puede presentar entrada regulada por un O ligando o ion) Ion
FIGURA 11-26 Resumen de los tipos de transporte.

Transporte activo secundario (contra gradiente electroqumico, impulsado por el movimiento inico a favor de gradiente)

C i

Antes del equilibrio Flujo neto

(a)

En el equilibrio No hay flujo neto

V m >0 Antes del equilibrio

(b)
m

En el equilibrio
q 2

=o

FIGURA 11-27 Desplazamiento de solutos a travs de una membrana permeable, (a) El movimiento neto de solutos elctricamente neutros es hacia el lado de menor concentracin de soluto hasta que se alcanza el equilibrio, fas concentraciones de soluto a la izquierda y a la derecha de la membrana se designan C, y C . La velocidad de movimiento transmembrana (indicado por las flechas grandes) es pro2

porcional al gradiente de concentracin, C /C . (b) El movimiento neto de solutos cargados elctricamente viene dictado por una combinacin del potencial elctrico (V ) y la diferencia de concentraciones qumicas a travs de la membrana; el movimiento neto de iones contina hasta que su potencial electroqumico llega a cero.

11.3

Transporte de solutos a travs de membranas

391

de concentracin ms baja, hasta que los dos compartimientos tienen concentraciones iguales de soluto (Fig. ll-27a). Cuando iones de cargas opuestas estn separados por una membrana permeable, se crea un gradiente elctrico transmembrana, un potencial de membrana, V (expresado en voltios o milivoltios). Este potencial de membrana produce una fuerza que se opone al movimiento de los iones que aumentan Vm e impulsa el movimiento de los iones que reducen Vm (Fig. 11 -27b). As, la direccin en la que un soluto cargado tiende a desplazarse espontneamente a travs de una membrana depende tanto clel gradiente qumico (la diferencia en concentracin de soluto) como del gradiente elctrico (V^) a travs de la membrana. Juntos, estos dos factores se conocen como gradiente electroqumico o potencial electroqumico. Este comportamiento de los solutos est de acuerdo con la segunda ley de la termodinmica: las molculas tienden a adoptar espontneamente una distribucin de mxima aleatoriedad y mnima energa. Para traspasar la bicapa lipdica, un soluto polar o cargado debe primero eliminar sus interacciones con las molculas de agua en su capa de hidratacin y a continuacin difundir unos 3 nm (30 A) a travs de un disolvente (lipido) en el que es poco
m

Soluto hidratado (a)

a 'S Ee
c

soluble (Fig. 11-28). La energa utilizada para :.: a. a: aa. r-apa de hidratacin y desplazar el compuesto polar . a -1 .-.ra al interior y a travs del lipido se recupera cuando el oonpaesto abandona la membrana del otro lado y se rehidrata. Sin embargo, el estado intermedio del paso transmembrana es un estado de alta energa comparable al estado de transicin de una reaccin qumica catalizada por un enzima. En ambos casos, se debe superar ma barrera de activacin para alcanzar el estado intermedio (Fig. 11-28; comprese con Fig. 6-3). La energa de activacin (AG*) para la translocacin de un soluto polar a travs de la bicapa es tan grande que las bicapas lipdicas puras son virtualmente impermeables a las especies polares y cargadas durante perodos de tiempo significativos para el crecimiento y divisin celulares. Las protemas de membrana disminuyen la energa de activacin para el transporte de compuestos polares e iones proporcionando una ruta alternativa a travs de la bicapa para solutos especficos. Las protemas que llevan a cabo esta difusin facilitada o transporte pasivo no son enzimas en el sentido habitual; sus "sustratos" se desplazan de un compartimiento a otro, pero no son alterados qumicamente. Las protenas de membrana que aceleran el movimiento de un soluto a travs de una membrana facilitando la difusin se conocen como transportadores o permeasas. Al igual que los enzimas, los transportadores unen sus sustratos con especificidad estereoqumica a travs de mltiples interacciones dbiles no covalentes. La variacin de energa libre negativa asociada con estas interacciones dbiles, AGunin, contrarresta la variacin de energa libre positiva que acompaa, a la prdida de agua de hidratacin del sustrato, AGcieshidratacin> dando lugar a una disminucin de la AG* clel paso transmembrana (Fig. 11-28). Los transportadores abarcan la bicapa lipdica varias veces formando un canal transmembrana recubierto con cadenas laterales de aminocidos hidrofbicos. El canal es una ruta alternativa para que un sustrato especfico se traslade a travs de la bicapa lipdica sin tener que disolverse en la bicapa, disminuyendo an ms la AG* para la difusin transmembrana. El resultado es un incremento de la velocidad de paso transmembrana del sustrato.
Los transportadores pueden agruparse en superfamilias segn sus estructuras

(b) Transportador
FIGURA 11-28 Cambios energticos que acompaan al paso de un soluto hidroflico a travs de la bicapa lipdica de una membrana biolgica, (a) En la difusin simple, la eliminacin de la capa de hidratacin es altamente enclergnica y la energa de activacin (AC*) para la difusin a travs de la bicapa es muy alta, (b) Una protena transportadora reduce la AC* para la difusin transmembrana del soluto. Lo hace estableciendo interacciones no covalentes con el soluto deshidratado para reemplazar los puentes de hidrgeno por el agua y proporcionando una va de paso hidroflica transmembrana.

Sabemos, a partir de estudios genmicos, que los transportadores constituyen una parte importante del total de protenas codificadas en los genomas tanto de organismos sencillos como complejos. Existen probablemente un millar o ms de transportadores diferentes en el genoma humano. Se han estudiado unos cuantos centenares de transportadores de diferentes especies utilizando mtodos bioqumicos, genticos y electrofisiolgicos, pero slo se ha determinado la estructura tridimensional de unos pocos. El anlisis de los genes de muchos transportadores pone de manifiesto similitudes de secuencia obvias entre los subconjuntos de transportadores. Y, tal como ha demostrado la experiencia, secuencias similares de aminocidos en las protenas son generalmente un reflejo de estructuras tridimensionales parecidas y, con frecuencia,

392

Captulo 11

Membranas biolgicas y transporte

TABLA 1 1 - 3 Sistema de clasificacin de transportadores

l .A. Canales tipo hlice a l.A.l. Superfamilia de canales inicos de compuerta regulada por voltaje (VIC) Canales de K de compuerta regulada por voltaje l.A.3. Canal de Ca ~ del receptor rianodina/IP l.A.8. Familia de protena intrnseca principal Acuaporinas l.A.9. Canal inico de compuerta regulada por ligando (LIC) de receptores de neurotransmisores Receptor/canal de acetilcolina l.B. Porinas en barril /3 l.B.l. Familia de porinas bacterianas generales (GBP) 1. C. Toxinas formadoras de poros l.C.7. Familia de la toxina diftrica 1. C.18. Familia de la melitina (veneno de abejas)
+ 2 3

2. A. Transportadores: simples, cotransportadores paralelos y antlparalelos 2. A.I. Superfamilia del facilitador principal (MFS) Transportador de lactosa/permeasa de coli 2.A.1.1, Transportador de glucosa GLUT1 de eritrocitos Familia de transportadores de azcares 2.A.I.9. Cotransportador paralelo P-H 2.A.12. Familia del cotransportador antiparalelo ATP-ADP (AAA) 2.A.13. Familia de la captacin de C -dicarboxllato (Dcu) 2.A.21. Familia del cotransportador paralelo soluto-Na (SSS) Cotransportador paralelo Na -glucosa de las clulas epiteliales 2.A.73. Transportadores de HC0" Cotransportador antiparalelo H C O 3 2. B. Transportadores no sintetizados en los ribosomas 2. B.I. Familia de transportadores de la valinomicina Valinomiclna
+ 4 + +

3. A. Transportadores impulsados por hidrlisis de enlace difosfato (utilizan PP, no ATP) 3. A . I . Superfamilia de la csete de unin de ATP (ABC) Canal de C r CFTR; transportador multifrmacos MDR1 3.A.2. Superfamilia de ATPasas translocadoras de H o N a de tipo F, tipo V o tipo A Bomba de protones FoF, ATPasa; VqVj ATPasa; AqAj ATPasa 3.A.3. Superfamilia de ATPasas de tipo P Cotransportador antiparalelo N a K ATPasa, bomba de Ca SERCA
+ + + + 2+

Nota: los tras grandes grupos corresponden a los grupos 1,2 y 3 de la Figura 11-29. Los transportadores Individuales Indicados aqu (con fondo amarillo) se describen en este captulo.

de mecanismos de accin similares. Es lgico esperar que determinando la estructura y mecanismo de accin de al menos un miembro de cada familia de transportadores podamos saber mucho acerca de los otros miembros de la familia: acerca de sus estructuras, especificidad de sustrato, velocidad de transporte y mecanismos de acoplamiento energtico. Un rbol filogentico en el que las protenas estn agrupadas en funcin de homologas de secuencia puede decirnos muchas cosas sobre las propiedades transportadoras de las protenas individuales del rbol. Cuando se combina esta filogenia con el conocimiento de la estructura, especificidad o mecanismo, tenemos una representacin muy til y relativamente sencilla del enorme grupo de transportadores (Tabla 11-3).

Es til clasificar los transportadores en superfamilias cuyos miembros tienen una similitud de secuencia considerable, por lo que es de esperar que compartan propiedades estructurales y funcionales. Existen dos amplias categoras de transportadores: portadores (transportadores) y canales (Fig. 11-29). Los portadores (transportadores) unen sus sustratos con estereoespecificidad elevada, catalizan el transporte a velocidades que estn muy por debajo de los lmites de la difusin libre y son saturables en el mismo sentido que lo son los enzimas: hay una concentracin de sustrato por encima de la cual un aumento no se traduce en un mayor grado de actividad. Los canales permiten, generalmente, el desplazamiento transmembrana a velocidades que son varios rdenes de mag-

11.3 Transportadores Portadores (transportadores) Canales

Transporte de solutos a

travs de membranas

393

Transportadores I i activos Transportadores Transportadores primarios activos sencillos (uniporters) secundarios

FIGURA 11-29 Clasificacin de los transportadores. Los nmeros se corresponden con las principales subdivisiones de la Tabla 11 -3.

gradiente de concentracin; son la superfiartalla de los transportadores de compuerta nica (unipor.-:-r=" 1 ::. .portadores activos) pueden impeler sirstrat.s a travs de la membrana contra un gradiente de concentracir.: algunos utilizan energa proporcionada directamente por una reaccin qumica (transportadores activos primarios) mientras que otros acoplan el transporte contra gradiente de un sustrato con el transporte a favor de gradiente clel otro (transportadores activos secundarios). A continuacin describiremos algunos representantes bien estudiados de las principales superfamilias ele transportadores. Volveremos a encontrar algunos de estos transportadores en las rutas en las que participan.
El transportador de glucosa de los eritrocitos facilita el transporte pasivo

nitud superiores a las tpicas de los transportadores, velocidades que se aproximan al lmite de la difusin no entorpecida. Los canales muestran, tpicamente, menos estereoespecificidad que los transportadores y habitualmente no son saturables. La mayora ele canales son complejos oligomricos de varias subunidades, a menudo idnticas, mientras que muchos transportadores funcionan como protenas monomricas. La clasificacin entre transportador o canal es la principal distincin dentro del grupo. Dentro de cada una de estas categoras existen superfamilias de diversos tipos que se definen no slo por sus secuencias primarias sino por su estructura secundaria. Algunos canales estn constituidos principalmente por segmentos helicoidales transmembrana mientras que otros tienen estructuras en barril /3 (Tabla 11-3). Entre los transportadores, algunos simplemente facilitan la difusin a favor de un (a) O Hidrofbico O Polar O Con carga

El metabolismo productor de energa del eritrocito depende de un suministro constante de glucosa que proviene del plasma sanguneo, donde la concentracin se mantiene alrededor de 5 mil. La glucosa penetra en el eritrocito por difusin facilitada va un transportador de glucosa especfico a una velocidad unas 50.000 veces mayor que la difusin no catalizada. El transportador de glucosa de los eritrocitos (llamado GLUT1 para distinguirlo de los transportadores de glucosa de otros tejidos) es una protena integral de tipo III (M ~ 45.000) que tiene 12 segmentos hidrofbicos, cada uno de los cuales se cree que forma una hlice que abarca la membrana. La estructura detallada de GLUT1 no se conoce todava, pero un modelo plausible sugiere que la unin lado por lado de varias hlices
t

(b) -Ser-Leu-Val-Thr-Asn-Phe-Ile2

(c)

Exterior Interior +NH

FIGURA 11-30 Estructura propuesta para GLUT1. (a) Las hlices transmembrana estn representadas como filas oblicuas (en ngulo) de tres o cuatro residuos aminocidos, representando cada fila una vuelta de la hlice a. Nueve de las 12 hlices contienen tres o ms residuos aminocidos polares o con carga, a menudo separados por varios residuos hidrofbicos. (b) Un diagrama de rueda helicoidal muestra la distribucin de residuos polares y apolares en la superficie de un segmento helicoidal. La hlice est esquematizada como si se observase a lo largo de su eje desde el extremo amino-terminal. Los residuos adyacentes de la secuencia lineal estn conectados con flechas y cada residuo est puesto alrededor de la rueda en la posicin que ocupa en la hlice; recurdese que se requieren 3,6 residuos para una vuelta completa de la hlice a. En este ejemplo, los residuos polares (azul) estn en una cara de la hlice y los residuos hidrofbicos (amarillo) en la otra. Esto es, por definicin, una hlice antiptica, (c) La asociacin lado a lado de cinco o seis hlices antipticas, cada una con su cara polar orientada hacia la cavidad central, puede producir un canal transmembrana revestido con residuos polares y con carga. Este canal proporciona muchas oportunidades para la formacin de puentes de hidrgeno con la glucosa que se desplaza a travs del transportador. La estructura tridimensional de CLUTI no ha sido determinada an por cristalografa de rayos X, pero se espera que los canales hidroflicos transmembrana de ste y de muchos otros transportadores y canales inicos se parecern a este modelo.

394

Captulo 11

Membranas biolgicas y transporte

Concentracin extracelular de glucosa, [S]out (mM) (a)

iH

Las ecuaciones de la velocidad de este proceso se pueden deducir exactamente igual que para las reacciones catalizadas por enzimas (Captulo 6), dando una expresin anloga a la ecuacin de Michaelis-Menten: Vmx[S]out Kt + [S]out en la que V0 es la velocidad inicial de acumulacin de glucosa en el interior de la clula cuando la concentracin en el medio circundante es [S] out y la K (transporte) e s una constante anloga a la constante de Michaelis, es decir, una combinacin de constantes de velocidad caracterstica de cada sistema de transporte. Esta ecuacin describe la velocidad inicial, la velocidad observada cuando [S]in = 0. Como en el caso de las reacciones catalizadas por enzimas, la forma interseccin-pendiente de la ecuacin describe una grfica lineal de 1/V0 frente Glucosa
t

-f

1 * m x

[Slout M/
(b)

FIGURA 11-31 Cintica del transporte de glucosa a los eritrocitos. (a) La velocidad inicial de entrada de glucosa a un eritrocito, V , depende de su concentracin inicial en el exterior, [S] . (b) Grfica de dobles recprocos de los datos de (a). La cintica de la difusin facilitada es anloga a la cintica de una reaccin catalizada por un enzima. Comprense estas grficas con la Figura 6-11 y la Figura 1 del Recuadro 6-1. Obsrvese que K es anloga a K la constante de Michaelis.
0 oul l m

produce un canal transmembrana revestido de residuos hidroflicos que pueden formar un enlace por puente de hidrgeno con la glucosa al desplazarse por el canal (Fig. 11-30). El proceso de transporte de glucosa se puede describir por analoga con una reaccin enzimtica en la que el "sustrato" es la glucosa del exterior de la clula (S out ), el "producto" es la glucosa del interior (Sj,,) y el "enzima" es el transportador, T. Cuando se mide la velocidad de captacin de glucosa en funcin de la concentracin externa de glucosa (Fig. 11-31), la grfica resultante es hiperblica; a concentraciones externas de glucosa elevadas la velocidad de captacin se acerca a Vmx. Formalmente, un proceso de transporte de este tipo se puede describir segn las ecuaciones Sout + Ti S out T, k_l S,,, + T2
11

Sjn
-3

T2

donde ku k-i, etc., son las constantes de velocidad directa e inversa para cada paso. T es la conformacin del transportador que apunta hacia el exterior y T 2 la que apunta hacia el interior. Las etapas estn resumidas en la Figura 11-32.

FIGURA 11-32 Modelo del transporte de glucosa a los eritrocitos por GLUT1. El transportador existe en dos conformaciones: T,, con el sitio de unin a glucosa expuesto en la superficie externa de la membrana plasmtica, yT , con el sitio de unin en la superficie interna. El transporte de glucosa tiene lugar en cuatro etapas. En la etapa (T), la glucosa clel plasma sanguneo se une a un sitio estereoespecfico en T-, rebajando as la energa de activacin para un cambio de conformacin (etapa @ ) desde S , T, a S T , efectuando el paso transmembrana de la glucosa. En la etapa (5) , la glucosa es liberada desde T al citoplasma y en la etapa (7) el transportador vuelve a la conformacin T listo para transportar otra molcula de glucosa.
2 ou n 2 2 1;

11.3

Transporte de solutos a travs de membranas

395

a 1/[S] out a partir de la cual podemos obtener los valores de Kt y 7 m x (Fig- ll-31b). Cuando [S] = Kt, la velocidad de captacin es Y2 Vm&x, el proceso de transporte est semisaturado. La concentracin de glucosa en la sangre. 4,5 a 5 rlM, es unas tres veces superior al valor de Kt, lo que asegura que GLUT1 est casi saturado con sustrato y opera cerca de la Vmix. Dado que en la conversin de S out en Siri no se rompen ni se forman enlaces qumicos, ni el "sustrato" ni el "producto" son intrnsecamente ms estables y el proceso de entrada es totalmente reversible. Cuando [S]in se acerca a [S] out , las velocidades de entrada y salida se igualan. Dicho sistema es, por tanto, incapaz de acumular el sustrato (glucosa) dentro de las clulas a concentraciones superiores a las del medio circundante; simplemente logra el equilibrio de la glucosa a ambos lados de la membrana a una velocidad mucho mayor de la que tendra lugar en ausencia de un transportador especfico. GLUT1 es especfico para la D-glucosa, para la que la Kt es 1,5 mu. Para los anlogos prximos D-manosa y D-galactosa, que slo difieren en la posicin de un grupo hidroxilo, los valores de Kt son 20 y 30 n-i, respectivamente, y para la L-glucosa, i~t es superior a 3000 IUM. De este modo, GLUT1 muestra los tres rasgos del transporte pasivo: velocidades de difusin elevadas a favor de un gradiente de concentracin, saturabilidad y especificidad. En el genoma humano se encuentran codificados doce transportadores de glucosa, cada uno con propiedades cinticas, patrones de distribucin y funciones diferentes (Tabla 11-4). En el hgado. GLUT2 transporta glucosa fuera de los hepatocitos cuando se degrada el glucgeno clel hgado para reponer la glucosa sangunea. GLUT2 tiene una Kt de aproximadamente 66 IUM, de manera que puede responder a niveles elevados de glucosa intracelular (debido a la degradacin del glucgeno) incrementando el transporte hacia el exterior. El msculo esqueltico y el tejido adiposo tienen otro transportador de glucosa, GLUT4 (/{"t = 5 IUM), que se distingue por su estimulacin por insulina: su actividad aumenta cuando la liberacin de insulina seala que existe una elevada concentraTABLA 11-4 Transportador GLUT1 GLUT2

cin de glucosa en sangre, con lo que se aa._:a aaarua la velocidad de captacin de glucosa por el msculo y el tejido adiposo. (El Recuadro 11-2 describe algunos raa.:.::a.aa:_ar.::s a a e c tuosos de este transportador.)
El intercambiador de cloruro-bicarbonato cataliza el cotransporte electroneutro de aniones a travs de la membrana eritrocitaria

El eritrocito contiene otro sistema de difusin facilitada, mi intercambiador ele aniones, que es esencial en el transporte de C0 2 desde tejidos tales como el msculo y el hgado a los pulmones. El C0 2 de desecho liberado en el plasma sanguneo por los tejidos durante la respiracin entra en el eritrocito, donde es convertido en bicarbonato (HCO r ) por el enzima carbnico anhidrasa. (Recurdese que el HCO3 es el principal tampn del pH sanguneo; v a s e Recuadro 2-4.) El HCOi" vuelve a entrar en el plasma sanguneo para ser transportado a los pulmones (Fig. 11-33). Debido a que el HCO3 es mucho ms soluble en el plasma sanguneo que el C0 2 , esta ruta indirecta aumenta la capacidad clel plasma sanguneo para transportar dixido de carbono desde los tejidos a los pulmones. En los pulmones, el HCO3 vuelve a entrar en el eritrocito y se convierte en C02> eme es finalmente exhalado. Para eme esta lanzadera sea efectiva se requiere un movimiento muy rpido del HCO3 a travs de la membrana del eritrocito. El intercambiador de cloruro-bicarbonato, tambin llamado protena intercambiadora de aniones (AE), aumenta la permeabilidad de la membrana clel eritrocito al HCO3 en un factor de ms de un milln. Al igual que el transportador de glucosa, es una protena integral de membrana que la abarca al menos 12 veces. Esta protena facilita el movimiento simultneo de dos aniones: por cada ion HCO3 que se traslada en una direccin, se traslada tambin un ion CP en la direccin opuesta (Fig. 11-33) sin transferencia neta ele carga; el intercambio es electroneutro. El acoplamiento ele CP y

Transportadores de glucosa en el genoma humano Tejido(s) donde se expresa Ubicuo Hgado, islotes pancreticos, intestino Gen SLC2A1 SLC2A2 Funcin'' Captacin basal de glucosa En el hgado, eliminacin de exceso de glucosa de la sangre; en el pncreas, regulacin de la liberacin de insulina Captacin basal de glucosa Actividad incrementada por la insulina Principalmente transporte de fructosa Posiblemente sin funcin transportadora

GLUT3 GLUT4 GLUT5 GLUT6 GLUT7 GLUT8 GLUT9 GLUT10 GLUT11 GLUT12

Cerebro (neuronal) Msculo, grasa, corazn Intestino, testculos, rion, esperma Bazo, leucocitos, cerebro Microsomas hepticos Testculos, blastocisto, cerebro Hgado, rion Hgado, pncreas Corazn, msculo esqueltico Msculo esqueltico, adiposo, intestino delgado

SLC2A3 SLC2A4 SLC2A5 SLC2A6 SLC2A7 SLC2A8 SLC2A9 SLC2A10 SLC2A11 SLC2A12

Un guin indica funcin incierta.

RECUADRO 11-2
Transporte defectuoso de glucosa y de agua en dos formas de diabetes

BIOQUIMICA EN MEDICINA

vilizar los transportadores de glucosa) provoca una baja velocidad de captacin de glucosa en msculo y tejido adiposo. Una consecuencia de ello es un perodo prolongado de altos Cuando la ingestin de una comida rica en glcidos hace niveles de glucosa en sangre despus de una ingesta rica en que el nivel de glucosa en la sangre exceda la concentracin glcidos. Esta condicin es la base de la prueba de tolerannormal entre comidas (5 IUM). el exceso de glucosa (que se cia a la glucosa que se utiliza en el diagnstico de la diabetes almacena en forma de glucgeno) es captado por los mioci(Captulo 23). tos del msculo cardaco y del msculo esqueltico y por los La permeabilidad al agua de las clulas epiteliales que readipocitos (que la convierten en triacilgliceroles). El transcubren el conducto colector del rion es debida a la presencia portador de glucosa GLUT4 interviene en la captacin de de una acuaporina (AQP-2) en sus membranas plasmticas glucosa por los miocitos y adipocitos. Entre comidas, la apicales (en la cara de la luz del conducto). La hormona antimembrana plasmtica de estas clulas contiene algo de diurtica (ADH) regula la retencin del agua movilizando GLUT4, pero la mayora est secuestrado en las membranas molculas de AQP-2 almacenadas en las membranas de vesde pequeas vesculas intracelulares (Fig. 1). La insulina libeculas dentro de las clulas epiteliales, de forma muy parecida rada por el pncreas en respuesta a la alta glucosa sangunea a como la insulina moviliza el GLUT4 en el msculo y el teprovoca el desplazamiento de estas vesculas intracelulares jido adiposo. hacia la membrana plasmtica, donde se fusionan, expoCuando las vesculas se fusionan con la membrana plasniendo las molculas de GLUT4 en la cara externa de la clula mtica de la clula epitelial, la permeabilidad al agua au(vase Fig. 12-8). Con ms molculas de GLUT4 en accin, la menta drsticamente y se reabsorbe ms agua en el velocidad de captacin de glucosa aumenta 15 veces o ms. conducto colector que se retorna a la sangre. Cuando los niCuando los niveles de glucosa en la sangre vuelven a la norveles de ADH disminuyen, se reacumula AQP-2 dentro de las malidad, disminuye la liberacin de insulina y la mayora de vesculas, reduciendo la retencin de agua. En la enfermedad las molculas de GLUT4 se elmnan de la membrana plasm- humana relativamente poco comn diabetes inspida, un detica y se almacenan en vesculas. fecto gentico en AQP-2 provoca una reabsorcin de agua defectuosa por el rion. El resultado es la excrecin de granEn la diabetes mellitus de tipo I (aparicin juvenil), la indes volmenes de orina muy diluida. capacidad para liberar insulina (y, por consiguiente, para moCuando la insulina interacciona con su receptor, las vesculas se desplazan hacia la superficie y se fusionan con la membrana plasmtica, incrementando el n m e r o de transportadores de glucosa en la membrana Insulina plasmtica.

Receptor Membrana de insulina plasmtica

Transportador de glucosa

Cuando los niveles de insulina decaen, los transportadores de glucosa son eliminados de la membrana plasmtica por endocitosis, formando pequeas vesculas.

Transportadores de glucosa "almacenados" en la clula en vesculas de membrana.

i
Las vesculas ms pequeas se fusionan con endosomas mayores.

Regiones del endosoma enriquecidas con transportadores de glucosa brotan para convertirse en pequeas vesculas, listas para volver a la superficie cuando los niveles de insulina aumenten de nuevo.

FIGURA 1 Regulacin por insulina clel transporte de glucosa por GLUT4 al interior de un miocito.

El dixido de carbono producido por el catabolismo entra en el eritrocito.

El bicarbonato se disuelve en el plasma sanguneo.

11.3

Transporte de solutos a travs de membra-as

397

El genoma humano contiene ger.es t i r a :re= or .rercambiadores de cloruro-bicarbonato : * rol -rimados, todos ellos con la misma prediccin i r : : ; : 1: roo r r o r o r r . e m brana. Los eritrocitos contienen el ir 000 r r t a d i r _-_Zl rl AE2 predomina en el hgado y el AE3 esta presenta ar. la raoratrao.a plasmtica clel cerebro, corazn y retina. Tarr.tc-r. roar oaoraarabiadores de aniones similares en plantas y mico rganlo:
El transporte activo da lugar al movimiento de soluto contra un gradiente de concentracin o gradiente electroqumico

El dixido de carbono sale del eritrocito y es exhalado.

El bicarbonato entra en el eritrocito desde el plasma sanguneo.

FIGURA 11-33 Intercambiador de cloruro-bicarbonato de la membrana de eritrocito. Este sistema cotransportador permite la entrada y salida de HCOT sin cambios en el potencial elctrico transmembrana. Incrementar la capacidad transportadora de C 0 de la sangre.
2

HCO3 es obligado; en ausencia de cloruro, se detiene el transporte de bicarbonato En este aspecto, el intercambiador a m nico es tpico de todos los sistemas, denominados sistemas de cotransporte, que trasladan a la vez dos solutos a travs de la membrana. Cuando, como en este caso, los dos sustratos se mueven en direcciones opuestas, el proceso es antiparalelo (antiport). En el cotransporte paralelo (simport), los dos sustratos se trasladan a la vez en la misma direccin. Tal como se ha mencionado los transportadores que slo llevan un sustrato, tal como el de la glucosa clel eritrocito, son sistemas de transporte nico (uniport) (Fig. 11-34).
4 m f

En el transporte pasivo, la especie transportada siempre se mueve a favor del gradiente electroqumico y no se produce nunca una acumulacin neta por encima de la concentracin de equilibrio. Por el contrario, el transporte activo da lugar a la acumulacin por encima del punto de equilibrio. El transporte activo est desfavorecido termodinmicamente (endergnico) y se da solamente cuando est acoplado (directa o indirectamente) a un proceso exergnico tal como la absorcin de luz solar, una reaccin de oxidacin, la rotura clel ATP o el flujo concomitante ele otra especie qumica a favor de su gradiente electroqumico. En el transporte activo primario, la acumulacin de soluto est acoplada directamente a una reaccin qumica exergnica tal como la conversin de ATP en ADP + P (Fig. 11-35). El transporte activo secundario tiene lugar cuando el transporte endergnico (cuesta arriba) de un soluto est acoplado al flujo exergnico (cuesta abajo) de un soluto diferente que ha sido bombeado originariamente cuesta arriba mediante un transporte activo primario. La cantidad de energa necesaria para el transporte de un soluto contra gradiente puede calcularse a partir clel gradiente de concentracin inicial. La ecuacin general para la variacin de energa libre en el proceso qumico que transforma S en P es L\G = L\G' + RT ln [P]/[S] (11-1)

nico (uniport)

Paralelo Antiparalelo (simport) (antiport) Cotransporte

(a) Transporte activo primario

(b) Transporte activo secundario

FIGURA 11-34 Tres clases generales de sistemas transportadores. Los transportadores difieren en el nmero de solutos (sustratos) transportados y en la direccin en la que cada uno es transportado. En el texto se tratan ejemplos de los tres tipos de transportadores. Obsrvese que esta clasificacin no nos dice nada sobre si son procesos que requieren energa (transporte activo) o procesos independientes de energa (transporte pasivo).

FIGURA 11-35 Dos tipos de transporte activo, (a) En el transporte activo primario, la energa liberada por la hidrlisis de ATP impulsa el movimiento del soluto en contra de un gradiente electroqumico, (b) En el secundario, se ha establecido un gradiente de un ion X (a menudo Na ) por transporte activo primario. El movimiento de X a favor de su gradiente electroqumico da la energa para impulsar el cotransporte de un segundo soluto (S) contra su gradiente electroqumico.
+

398

Captulo 11

Membranas biolgicas y transporte

donde R es la constante ele los gases, 8,315J/mol K, y T es la temperatura absoluta. Cuando la "reaccin" es simplemente el transporte de un soluto desde una regin donde su concentracin es Cj a otra, regin en la que su concentracin es C2> no se forman ni rompen enlaces, por lo que la variacin de energa, libre estndar, AG', es cero. La variacin de energa libre para el transporte, \G es
t

3 (11-2) Si hay una diferencia de diez veces en la concentracin entre los dos compartimientos, el coste de trasladar 1 mol de un soluto no cargado a 25 C a travs ele una membrana que separa los compartimientos es, por consiguiente t\G = (8,315 J/mol KX298 K)(ln 10/1) = 5,700 J/mol = 5,7 kJ/mol La Ecuacin 11-2 es vlida para todos los solutos sin carga. Cuando el soluto es un ion, su movimiento sin un contrain correspondiente da lugar a la separacin enclergnica de cargas positivas y negativas, produciendo un potencial elctrico; un proceso de transporte de este tipo se dice que es electrognico. El coste energtico de mover un ion depende del potencial electroqumico (p. 391), la suma de los gradientes qumico y elctrico:

\Gt = RT ln c.

A O, - H 7 , i n | ^ ) + ZJ Ar

a (n-3)

donde Z es la carga del ion, 3 la constante de Faraday (96.480 J/V mol) 5^ Ai// es el potencial elctrico transmembrana (en voltios). Las clulas eucariticas tienen, tpicamente, potenciales elctricos a travs de sus membranas plasmticas clel orden de 0,05 a 0,1 V (con el interior negativo con respecto al exterior) por lo que el segundo trmino de la Ecuacin 11-3 puede contribuir significativamente a la variacin total de energa libre para el transporte de un ion. La mayora de clulas mantienen gradientes inicos con diferencias de ms de diez veces a travs de sus membranas plasmticas o intracelulares, por lo que en muchas clulas y tejidos el transporte activo constituye un proceso principal de consumo de energa. El mecanismo del transporte activo es de importancia fundamental en biologa. Tal como veremos en el Captulo 19, la formacin de ATP en las mitocondrias y cloroplastos tiene lugar mediante un mecanismo que es, fundamentalmente, el transporte de iones impulsado por el ATP operando a la inversa. La energa disponible a partir del flujo espontneo de protones a travs de la membrana se puede calcular mediante la Ecuacin 11-3; recurdese que para el flujo a favor de un gradiente electroqumico, el signo de AG es negativo mientras que el valor de AG para el transporte de iones en contra ele un gradiente electroqumico tiene un signo positivo.
Las ATPasas tipo P experimentan fosforilacin durante sus ciclos catalticos

La familia de transportadores activos denominados ATPasas tipo P son transportadores de cationes impulsados por ATP que se fosforilan reversiblemente por accin clel ATP durante

el ciclo de transporte; la fosforilacin obliga a un cambio de conformacin que es crucial para el transporte del catin a travs de la membrana. Todas las ATPasas transportadoras tipo P presentan similitudes en la secuencia de aminocidos, especialmente cerca clel residuo ele Asp que experimenta fosforilacin, y todas son sensibles a la inhibicin por el anlogo clel fosfato vanadato. oO 0= I o- 0= =V( =P I I Vanadato OH OH Cada transportador ATPasa tipo P es una protena integral en Fosfato diez regiones que abarcan la memla que pueden predecirse brana en un polipptido nico; algunas tienen una segunda subunidad. Los transportadores de tipo P estn distribuidos muy ampliamente. En tejidos animales, la Na + K + ATPasa (cotransportador antiparalelo de Na + y K + ) y la Ca 2+ ATPasa (transportador simple de Ca 2+ ) son ATPasas tipo P ubicuas que mantienen diferencias en la composicin inica del citosol y el medio extracelular. Las clulas parietales que forran el estmago de los mamferos tienen una ATP tipo P que bombea H + y K + a travs ele la membrana plasmtica, aciclificando de este modo el contenido del estmago. En las plantas vasculares, una ATPasa tipo P bombea protones fuera de la clula, estableciendo una diferencia electroqumica de hasta 2 unidades de pH y 250raVa travs ele la membrana plasmtica. Una ATPasa tipo P similar del hongo del pan Neurospora bombea protones fuera de las clulas para establecer un potencial ele membrana con el interior negativo, el cual se usa para impulsar la captacin de sustratos y iones clel medio circundante mediante transporte activo secundario. Las bacterias utilizan ATPasas tipo P para bombear al exterior iones de metales pesados txicos tales como Ccl2+ y Cu 2+ . En casi todos los tipos de c- Jens Skou lulas animales, la concentracin de Na + es menor en la clula que en el medio exterior, mientras que la concentracin de K + es mayor dentro (Fig. 11-36). Esta descompensacin se mantiene gracias a un sistema de transporte activo primario en la membrana plasmtica. El enzima Na + K + ATPasa, descubierto por Jens Skou en 1957, acopla la ruptura clel ATP y el movimiento simultneo de Na + y K + en contra de sus gradientes electroqumicos. Por cada molcula de ATP convertida en ADP y Pi, el transportador mueve dos iones K + hacia el interior y 3 iones Na + hacia el exterior a travs de la membrana plasmtica. La Na + K + ATPasa es una protena integral con dos subunidades (Mr - 50.000 y ~ 110.000) que abarcan la membrana. El mecanismo detallado gracias al cual la hidrlisis del ATP se acopla al transporte requiere la determinacin de la estructura tridimensional de la protena, pero un modelo actual

11.3

Transporte de solutos a travs de membranas

399

(Fig. 11-37) propone que la ATPasa oscila entre dos formas, una forma fosforilada (designada P-Enzn) con alta afinidad por el K + y baja afinidad por el Na + , y una forma desfosforilada (Enz,) con alta afinidad por el Na + y baja afinidad por el K + . La conversin de ATP a ADP y P se produce en dos pasos catalizados por el enzima, mtei-vinienclo la formacin y posterior hidrlisis del fosioenzima: (1) ATP + Enz, -> ADP + P-Enz u (2) P-Enzn + H 2 0 > Enzi + P Sumo: ATP + H 2 0 > ADP + P Debido a que se desplazan 3 iones Na + hacia fuera por cada 2 iones K + que se desplazan hacia dentro, el proceso es electrognico -crea una separacin neta de carga a travs de la membrana-. El resultado es un potencial transmembrana de 50 a 70 mV (interior negativo con respecto al exterior) que es caracterstico de la mayora de las clulas animales y esencial en la conduccin de potenciales de accin en las neuronas. El papel central de la Na + K + ATPasa se refleja en la energa invertida en esta simple reaccin: cerca de un 25% del consumo total de energa del ser humano en reposo! El derivado esteroide ouabaina (clel somal waa bayyo, "veneno de flecha") es un inhibidor potente y especfico de la Na + K + ATPasa. La ouabaina se une preferentemente a la forma clel enzima que est abierta por el laclo extracelular, bloqueando dos iones Na + e impidiendo los cambios de conformacin necesarios para el transporte. Otra toPotencial de membrana -50 a -70 mV 3Na + Na + K + ATPasa
+

3 Xa-del i de la clula. La fosforilacin favorece a P-Enzr;. P-Enzu.^W El transportador libera 3 Na~ al exterior y une 2 KT del exterior de la clula. II 2K+
O Xjf^" 3 Na"

La desfosforilacin favorece a Enz,. El transportador libera 2 K + al interior. Interior Exterior

+

FIGURA 11-37 Mecanismo propuesto para el transporte de N a y K por la ATPasa.

ATP 2K + Citosol [K+] = 140 mM [Na + ] = 12 mM

+ + +

xina muy potente, la palitoxina (producida por un coral de la costa hawaiana) tambin acta sobre la Na + K + ATPasa, pero se une a la protena de manera que la bloquea en una posicin en la que sitios de unin de los iones estn accesibles de modo permanente a ambos lados, lo que convierte el transportador en un canal inico inespecfico. Esto permite la salida de K + de las clulas y hace desaparecer el gradiente inico (esencial) a travs de la membrana plasmtica, lo que da cuenta de la toxicidad de este compuesto. O V

Fluido extracelular [K+] = 4 mM o plasma sanguneo [Na + ] = 145 mM

FIGURA 11-36 N a K ATPasa. En clulas animales, este sistema de transporte activo es responsable principalmente de establecer y mantener las concentraciones intracelulares de N a y K y de generar el potencial elctrico transmembrana. Esto lo hace expulsando tres Na de la clula por cada dos K que introduce. El potencial elctrico es fundamental para la sealizacin elctrica en las neuronas y el gradiente de N a es usado para impulsar el cotransporte de solutos cuesta arriba en muchos tipos celulares.
+ + + + + + +

OH OH

Ouabaina

400

Captulo 11

Membranas biolgicas y transporte

La ouabaina y otro derivado esteroideo, la digitoxigenina, son los ingredientes activos de la digitalina, un extracto de las hojas de la digital. (La ouabaina se encuentra a menor concentracin en diversa plantas, probablemente para repeler a los herbvoros.) La digitalina se ha usado para tratar ataques congestivos de corazn desde su introduccin con este propsito (tratamiento de la "hidropesa") por el mdico ingls William Withering en 1785. Refuerza las contracciones del msculo cardaco sin aumentar la frecuencia cardaca con lo que aumenta la eficiencia del corazn. La digitalina inhibe la salida de Na + , con lo que aumenta la concentracin de Na + en las clulas lo suficiente como para activar un transportador antiparalelo de Na + -Ca 2+ en el msculo cardaco. El incremento clel influjo de Ca 2+ a travs de este antiport produce elevados niveles de Ca 2+ citoslicos, que refuerzan las contracciones del msculo cardaco. La potencia de la ouabaina en los animales condujo a la sugerencia (hace 50 aos) de que esta planta podra actuar imitando un regulador normal de la Na + K + ATPasa producida en los animales, cosa que ahora parece ser cierta. La misma ouabaina ha sido aislada de las glndulas suprarrenales bovinas y se ha detectado en el plasma sanguneo y en el hipotlamo de mamferos.
Las bombas de C a tipo P mantienen una baja concentracin de calcio en el citosol
2 +

Dominio N

90

H. Dominio A

(Asp35l)

Sitio de fosforilacin Dominio P

| * -

Citoplasma

La concentracin citoslica de Ca 2+ libre es generalmente 100 nM o menos, muy por debajo del medio extracelular, ya sea el agua de una charca o plasma sanguneo. La presencia ubicua de fosfatos inorgnicos (P y PP) en concentraciones nlimolares en el citosol necesita bajas concentraciones de Ca 2+ citoslico, porque el fosfato inorgnico combina con el calcio para formar fosfatos de calcio relativamente insolubles. Los iones calcio son bombardeados fuera clel citosol por una ATPasa tipo P, la bomba de Ca 2 + de la membrana plasmtica. Otra bomba de Ca 2+ tipo P del retculo endoplasmtico transporta Ca 2+ dentro de la luz del RE, un compartimiento separado del citosol. En los miocitos, el Ca z+ se secuestra normalmente en una forma especializada de retculo endoplasmtico llamado retculo sarcoplasmtico. Las bombas de calcio del retculo sarcoplasmtico y del retculo endoplasmtico (SERCA) estn muy relacionadas en estructura y mecanismo y ambas son inhibiclas por el agente promotor de tumores tapsigarclina, que no afecta a la bomba de Ca 2+ de la membrana plasmtica. La bomba de Ca 2+ de la membrana plasmtica y las bombas SERCA son protenas integrales que oscilan entre una conformacin fosforilada y una desfosforilada en un mecanismo similar al de la Na + K + ATPasa (Fig. 11-37). La fosforilacin favorece una conformacin con un sitio de fijacin de Ca 2+ de alta afinidad expuesto al lado citoplasmtico mientras que la desfosforilacin favorece una conformacin con un sitio de unin de Ca 2+ a baja afinidad en el lado luminar. Con este mecanismo, la energa liberada por hidrlisis clel ATP durante un ciclo de fosforilacin-desfosforilacin impulsa el Ca 2+ a travs de la membrana contra un gran gradiente electroqumico. La bomba de Ca 2+ del retculo sarcoplasmtico, que comprende el 80% de las protenas de esta membrana, consiste en

FIGURA 11-38 Estructura de la bomba de C a del retculo sarcoplasmtico. (PDB ID 1EUL) Diez hlices transmembrana rodean la ruta para el desplazamiento del C a a travs de la membrana. Dos de las hlices estn interrumpidas cerca del centro de la bicapa y sus regiones no helicoidales forman los sitios de unin de dos iones C a (verde). Los grupos carboxilato de un residuo de Asp en una hlice y de un residuo de Glu en otra son fundamentales para los sitios de fijacin de Ca . Desde el lado citoplasmtico se extienden tres dominios globulares: el dominio N (unin de nucletido) tiene tres sitios de unin de ATP; el dominio P (fosforilacin) contiene el residuo de Asp (azul) sometido a fosforilacin reversible y el dominio A (actuador) facilita de algn modo los cambios estructurales que alteran la afinidad por el C a del sitio de unin de C a y su exposicin al citoplasma o a la luz. Obsrvese la larga distancia existente entre el sitio de fosforilacin y el sitio de unin de Ca . Existen muchas pruebas de que, durante un ciclo de transporte, el dominio N se desplaza unos 20 hacia la derecha, haciendo que el sitio del ATP est ms cercano al Asp , y de que durante cada ciclo cataltico el dominio A gira unos 90 alrededor de la perpendicular a la membrana. Estos cambios de conformacin han de exponer el sitio de unin de Ca primero a un lado de la membrana y despus al otro, cambiando la afinidad por el Ca clel sitio de alta en el lado citoplasmtico a baja en el lado de la luz. Para comprender totalmente el acoplamiento entre fosforilacin y transporte de C a se tendr que esperar a la determinacin de todas las conformaciones implicadas en el ciclo.
2 + 2+ 2+ 2+ 351 2+ 2+ 2+ 351 2 + 2+ 2+

un polipptido sencillo (Mr -100.000) que atraviesa la membrana diez veces y tiene tres dominios citoplasmticos formados por bucles que conectan las hlices transmembrana (Fig. 11-38). Los dos sitios de fijacin de Ca 2+ estn localizados cerca del medio de la bicapa de la membrana, a unos 40 a 50 A del residuo de Asp fosforilado caracterstico de todas las ATPasas tipo P, por lo que los efectos de la fosforilacin de Asp no son

11.3

Transporte de solutos a travs de membranas

401

directos. stos deben estar facilitados por cambios de conformacin que alteran la afinidad por el Ca 2+ y abren una ruta para la liberacin de Ca 2+ al laclo de la luz de la membrana. Las secuencias de aminocidos de la bombas SERCA y de la Na + K + ATPasa comparten un 30% de identidad y un 65% de similitud de secuencia y su topologa con respeto a la membrana tambin es la misma. De este modo, parece probable que la estructura de la Na + K + ATPasa sea similar a la de las bombas SERCA y que todos los transportadores ATPasa tipo P compartan la misma estructura bsica.
Las ATPasas tipo F son bombas de protones reversibles impulsadas por el ATP

ATP

i -:-

Los transportadores activos ATPasa tipo F juegan un papel central en las reacciones de conservacin de la energa en mitocondrias, bacterias y cloroplastos; este papel se tratar en detalle cuando describamos la fosforilacin oxiclativa y la fotofosforilacin en el Captulo 19. Las ATPasas tipo F catalizan el paso transmembrana a contracorriente de protones impulsado por la hidrlisis clel ATP (el "tipo F" del nombre proviene ele la identificacin de estas ATPasas como /actores de acoplamiento de energa). El complejo de protena integral de membrana F 0 (Fig. 11-39; el subndice o denota su inhibicin por el frmaco oligomicina) proporciona un poro transmembrana para protones y la protena perifrica F, (el subndice 1 indica que fue el primero de entre una serie de factores aislados de las mitocondrias) es una mquina molecular que utiliza la energa clel ATP para impulsar protones cuesta arriba (a una regin de mayor concentracin de H + ). La organizacin FoF,

FIGURA 11-40 Reversibilidad de las ATPasas tipo F. Un transportador de protones impulsado por ATP cataliza tambin la sntesis de ATP (flechas rojas) a medida que los protones fluyen a favor de su gradiente electroqumico. Esta es la reaccin central en los procesos de la fosforilacin oxiclativa y fotofosforilacin descritos en detalle en el Captulo 19.

FIGURA 11-39 Estructura de la F F-, ATPasa/ATP sintasa. Las ATPasas tipo F tienen un dominio perifrico, F-i, compuesto por tres subunidades a, tres subunidades i, una subunidad S (prpura) y un eje central (subunidad y en verde). La porcin integral de las ATPasas tipo F, F (amarillo), tiene mltiples copias de subunidades c, una a y dos b. F proporciona un canal transmembrana a travs del cual se bombean unos cuatro protones (flechas rojas) por cada ATP hidrolizado en las subunidades 0 de F,. El extraordinario mecanismo mediante el cual se acoplan estos dos acontecimientos se describe en detalle en el Captulo 19. Interviene una rotacin de F relativa a F (flecha negra). Las estructuras de VVi y AA, son esencialmente similares a la de F F|, y el mecanismo probablemente tambin lo sea.
0 D Q n D

de transportadores de protones debi de desarollarse muy al principio de la evolucin. Eubacterias tales como E. coli utilizan un complejo F^Fi ATPasa en su membrana plasmtica para bombear protones hacia el exterior mientras que las arquebacterias poseen una bomba de protones homologa prxima, la AqAj ATPasa. La reaccin catalizada por las ATPasas tipo F es reversible, por lo que un gradiente de protones puede suministrar la energa para impulsar la reaccin inversa, la sntesis de ATP (Fig. 11-40). Cuando funcionan en esta direccin, las ATPasas tipo F se llaman ms apropiadamente ATP sintasas. Las ATPasas son de importancia crucial en la produccin de ATP en las mitocondrias durante la fosforilacin oxiclativa y en los cloroplastos durante la fotofosforilacin, lo mismo que en las eubacterias y arquebacterias. El gradiente de protones necesario para impulsar la sntesis de ATP en la fosforilacin oxidativa y fotofosforilacin se establece por otros tipos de bombas ele protones cuyo poder proviene ele la oxidacin de sustratos o ele la luz solar. Como ya se ha dicho, volveremos a una descripcin detallada de estos procesos en el Captulo 19. Las ATPasas tipo V, una clase de ATPasas transportadoras de protones relacionadas estructuralmente (y, con toda probabilclacl, mecansticamente), son responsables de la acidificacin de los compartimientos intracelulares en muchos organismos (de ah V, uacuolar). Las vacuolas de hongos y plantas superiores mantienen el pH entre 3 y 6, bastante por debajo que el clel citosol circundante (pH 7,5), gracias a la accin de bombas protnicas de este tipo. Las ATPasas tipo V son tambin responsables de la acidificacin de los lisosomas, endosomas, complejo ele Golgi y vesculas secretoras en clulas animales. Todas las ATPasas tipo V tienen una estructura compleja similar, con un dominio integral (transmembrana) (VQ) eme acta como un canal de protones y un dominio perifrico (V,) que contiene el sitio de unin de ATP y la actividad ATPasa. El mecanismo por el que las ATPasas tipo V acoplan la hidrlisis del ATP al transporte cuesta arriba de protones no se conoce en detalle.

402

Captulo 11

Membranas biolgicas y transporte

Los transportadores ABC utilizan ATP para impulsar el transporte activo de una amplia gama de sustratos

Los transportadores ABC (Fig. 11-41) constituyen una extensa familia de transportadores dependientes de ATP que bombean aminocidos, pptidos. protenas, iones metlicos, diversos lpidos, sales biliares y muchos compuestos hidrofbicos, incluidos medicamentos, fuera de las clulas contra un gradiente de concentracin. Un transportador ABC en humanos, el transportador multifrmacos (MDR1) es responsable de la extraordinaria resistencia de ciertos tumores a algunos frmacos antitumorales generalmente efectivos. MDR1 tiene una amplia especificidad de sustrato para compuestos hidrofbicos, entre los que se cuentan, por ejemplo, los frmacos quimioteraputicos adriamicina, doxorrubicina y vinblastina. Al bombear estos frmacos fuera de la clula, el transportador impide su acumulacin dentro clel tumor y de este modo bloquea sus efectos teraputicos. MDR1 es una protena integral de membrana (Mr 170.000) con 12 segmentos transmembrana y dos sitios de unin de ATP ("casetes") que dan nombre a la familia: transportadores ATP-omding cassette. Todos los transportadores ABC tienen dos dominios de unin de nucletidos (NBD) y dos dominios trasmembrana (Fig. 11-41). En algunos casos todos estos dominios se encuentran en un solo polipptido largo; otros transportadores ABC tienen dos subunidades, cada una de las cuales aporta un NBD y un dominio con seis (o en algunos casos diez) hlices transmembrana. Aunque muchos de los transportadores ABC se encuentran en la membrana plasmtica, algunos tipos tambin se encuentran en el retculo endoplasmtico y en las membranas de las mitocondrias y lisosomas. La mayora de transportadores ABC actan como bombas, pero al menos algunos miembros de la superfamilia actan como canales inicos que se abren y cierran por hidrlisis clel ATP. El transportador CFTR (Recuadro 11-3) es un canal de Cl~ operado mediante hidrlisis del ATP. Los NBD de todas las protenas ABC son similares en secuencia y probablemente en estructura tridimensional; son el motor molecular conservado que puede acoplarse a una amNBD

plia gama de bombas y canales. Cuando estn acoplados a ma bomba, el motor impulsado por ATP transporta solutos contra un gradiente de concentracin; cuando estn acoplados a un canal inico, el motor abre y cierra el canal utilizando ATP como fuente de energa. La estequiometra de las bombas ABC es de aproximadamente un ATP hidrolizado por molcula de sustrato transportada, pero no se conocen ni el mecanismo de acoplamiento ni el sitio de unin de sustrato. Algunos transportadores ABC son muy especficos para un solo sustrato; otros son ms promiscuos. El genoma humano contiene al menos 48 genes que codifican transportadores ABC, muchos de los cuales participan en el mantenimiento de la bicapa lipdica y en el transporte de esterles, derivados de esterles y cidos grasos por todo el cuerpo. Las flipasas que desplazan lpidos de membrana desde una hoja de la bicapa a la otra son transportadores ABC y la maquinaria celular que exporta el exceso de colesterol incluye un transportador ABC. Mutaciones en los genes que codifican algunas de estas protenas contribuyen a la aparicin de varias enfermedades genticas entre las que se incluyen la fibrosis qustica (Recuadro 11-3), la enfermedad de Tangier (p. 827), la degeneracin de la retina, la anemia y el fallo heptico. Los transportadores ABC tambin se hallan presentes en animales ms sencillos y en plantas y microorganismos. La levadura tiene 31 genes que codifican transportadores ABC, Drosophila tiene 56, E. coli 80, lo que representa el 2% de su genoma completo. La presencia de transportadores ABC que confieren resistencia a antibiticos en microbios patgenos (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Neisseria gonorrhoeae y Plasmodium falciparum) constituye una preocupacin seria para la salud pblica y convierte estos transportadores en dianas atractivas en el diseo de medicamentos.

Los gradientes de iones proporcionan la energa para el transporte activo secundario

Los gradientes de iones formados gracias al transporte primario de Na + o H + pueden, a su vez, proporcionar la fuerza im-

NBD
FIGURA 11-41 Estructuras de dos transportadores ABC de E. coli. (a) ta lipido A fiipasa MsbA (PDB ID 1JSQ) y (b) el importador de vitamina B BtuCD (PDB ID 1L7V). Las dos estructuras son homoclmeros. Los dos dominios de unin de nucletido (NBD, en rojo) se extienden hacia el citoplasma. En (b) se muestran los residuos que intervienen en la unin e hidrlisis de ATP como estructuras de bolas y varillas. Cada monmero de MsbA tiene seis segmentos helicoidales transmembrana (azul) y cada monmero de BtuCD tiene diez.
12

Ili
f r

Espacio extracelular (a) MsbA (b) BtuCD

11.3

Transporte de solutos a travs de membranas

403

RECUADRO 11 -3

BIOQUMICA EN MEDICINA

La fibrosis qustica (CF) es una enfermedad hereditaria grave y relativamente comn en humanos. Cerca de un 5% de los norteamericanos blancos son portadores al tener una copia clel gen defectuosa y otra normal. Slo los individuos con dos copias defectuosas muestran los sntomas graves de la enfermedad: obstruccin de los tractos gastrointestinal y respiratorio, que conduce comnmente a una infeccin bacteriana en las vas areas y a la muerte por insuficiencia respiratoria antes de los 30 aos de edad. En la CF, la fina capa de mucosidad que normalmente recubre las superficies internas clel pulmn es anormalmente gruesa, obstruyendo el flujo de aire y proporcionando un refugio para las bacterias patgenas, especialmente Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa. El gen defectuoso en los pacientes de CF se descubri en 1989. Codifica una protena de membrana llamada regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis qus-

Un canal inico defectuoso en la fibrosis qustica

tica o CFTR. Anlisis de hidropata predicen que el CFTR tiene 12 hlices transmembrana y es:a v a l . -~ _ a.:aralmente con transportadores multifrmaa: s a 1. v :aaa: resistentes a frmacos (Fig. 1). La protena CFTR ramal es un canal inico especfico para iones Cl~. La a::a.aaaa aal canal de C F aumenta considerablemente cuando se transfieren grupos fosforilo del ATP a varias cadenas laterales de la protena, lo que est catalizado por la protena quinasa dependiente de cAMP (Captulo 12). La mutacin responsable de la CF es en el 70% de los casos una clelecin de un residuo ele Phe en la posicin 508, cuyo efecto es que la protena mutante no se pliega correctamente y no se inserta en la membrana plasmtica. Otras mutaciones dan lugar a una protena que se inserta correctamente pero que no se puede activar por fosforilacin. En todos los casos, el problema fundamental es un canal de CF no funcional en las clulas epiteliales que recubren las vas areas (Fig. 2), el tracto digestivo y las glndulas exocrinas (pncreas, glndulas sudorparas, conductos biliares y conductos deferentes). Normalmente, las clulas epiteliales que recubren la cara interna del pulmn secretan una sustancia que atrapa y mata las bacterias, y los cilios de las clulas epiteliales barren constantemente los desechos resultantes. Cuando no hay CFTR, o ste es defectuoso, este proceso es mucho menos eficiente, con lo que las infecciones frecuentes por bacterias tales como S. aureus y P. aeruginosa daan progresivamente los pulmones y reducen la eficacia respiratoria.

FIGURA 1 Topologa clel regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis qustica, CFTR. Hay 12 hlices transmembrana y tres dominios funclonalmente significativos se extienden desde la cara citoslica: NBD, y NBD son dominios que unen nucletidos a los que se une el ATP y un dominio regulador (dominio R) es el sitio de la fosforilacin por una protena quinasa dependiente de cAMP. Las cadenas de oligosacridos estn unidas a varios residuos en la cara externa del segmento entre las hlices 7 y 8. La mutacin ms frecuente que lleva a la CF es la clelecin ele Phe en el dominio NBD,. La estructura del CFTR es muy parecida a la del transportador multifrmacos de tumores, descrito en el texto.
2 508

FIGURA 2 La mucosidad que recubre la superficie de los pulmones atrapa bacterias. En pulmones sanos, stas son exterminadas por la accin de los cilios. En la CF, la actividad bactericida est deteriorada, provocando infecciones recurrentes y dao progresivo a los pulmones.

pulsora para el cotransporte de otros solutos. Muchos tipos de clulas contienen sistemas de transporte que acoplan el flujo espontneo cuesta abajo ele estos iones con el bombeo simultneo cuesta arriba de otro ion, azcar o aminocido (Tabla

11-5). El transportador de lactosa (lactosa permeasa) de E. coli constituye el prototipo bien conocido de cotransportador impulsado por protones. Esta protena consiste en una sola cadena polipeptdica (417 residuos) que funciona en

404

Captulo 11

Membranas biolgicas y transporte

TABLA 11-5 Sistemas de cotransporte impulsados por gradientes de Na o H

+

Organismo/tejido/tipo celular E. coli

Soluto transportado (contra gradiente) Lactosa Prollna cidos dicarboxlicos Glucosa Aminocidos Ca K K
2+ + +

Soluto cotransportado (a favor de gradiente) H H H

+

Tipo de transporte Paralelo Paralelo Paralelo Paralelo Paralelo Antiparalelo Antiparalelo Antiparalelo

Intestino, rion (vertebrados) Clulas de vertebrados (muchos tipos) Plantas superiores Hongos (Neurospora)

Na Na Na H H
+ +

forma de monmero para transportar un protn y una molcula de lactosa dentro de la clula con acumulacin neta de lactosa (Fig. 11-42). E. coli produce normalmente un gradiente de protones y carga a travs de su membrana plasmtica gracias a la oxidacin de combustibles y a la utilizacin de la energa de oxidacin para bombear protones hacia fuera. (Este mecanismo se describe en detalle en el Captulo 19.) La bicapa lipdica es impermeable a los protones, pero el transportador de lactosa proporciona una ruta para la reentrada de protones y la lactosa se transporta simultneamente dentro de la clula por el cotransporte paralelo (simport). La acumulacin endergnica de lactosa se acopla de este modo al flujo exergnico de protones al interior de la clula con una variacin global de energa libre negativa. El transportador de lactosa es un miembro de la superfamilia facilitadora principal (major facitator superfamily, MFS) de transportadores que comprende 28 familias. Casi toBomba de protones (inhibida por CN )

das las protenas de esta superfamilia tienen 12 dominios transmembrana (las pocas excepciones tienen 14). Las protenas comparten relativamente poca homologa de secuencia, pero la similitud de sus estructuras secundarias y topologa sugiere que tienen una estructura terciaria comn. La resolucin cristalogrfica del transportador de lactosa de E. coli por Ron Kaback y So Iwata en 2003 permite entrever esta estructura general (Fig. 11-43a). La protena tiene 12 hlices transmembrana y bucles de conexin que sobresalen hacia el citoplasma o el espacio periplasmtico. Las seis hlices amino-ternnales y las seis carboxilo-terminales forman dominios muy similares, dando lugar a una estructura con ma simetra binaria aproximada. En la forma cristalizada de la protena hay una gran cavidad acuosa que est expuesta en el lado citoplasmtico de la membrana. El sitio de unin clel sustrato se encuentra en esta cavidad, ms o menos en el centro de la membrana. El lado del transportador que mira hacia fuera (la cara periplas(b) Inhibicin por C N _ de la oxidacin de combustible Transporte \ \ o activo > ^ g / \a ta u> / +CN~ o mutacin \ / enGlu 32B oArg 302 \ [Lactosa] MEDI7^->

(interior)
FIGURA 11-42 Captacin de lactosa en f. coli. (a) El transporte primario de H fuera de la clula, impulsado por la oxidacin de una multitud ele combustibles, establece tanto un gradiente protnico como un potencial elctrico (negativo en el interior) a travs de la membrana. El transporte activo secundario de lactosa al interior de la clula precisa un cotransporte paralelo de H y lactosa por el transportador de lactosa. La captacin de lactosa contra su gradiente de concentracin depende en+ + +

Tiempo
teramente de este flujo de H hacia el interior impulsado por el gradiente electroqumico, (b) Cuando las reacciones de oxidacin generadoras de energa del metabolismo son bloqueadas por el cianuro (CN~), el transportador de lactosa permite que se equilibre la lactosa dentro y fuera de la clula va transporte pasivo. Mutaciones que afectan a Glu o Arg tienen el mismo efecto que el cianuro. La lnea a trazos representa la concentracin de lactosa en el medio circundante.
325 302

11.3

Transporte de solutos a travs de membranas

405

Espacio periplasmtico
FIGURA 11-43 Estructura del transportador de lactosa (lactosa permeasa) de E. coli. (a) En la representacin de cintas vista en paralelo al plano de la membrana se ven las 12 hlices transmembrana dispuestas en dos dominios casi simtricos que se muestran en diferentes tonos de azul. En la forma de la protena para la que se determin la estructura cristalina, el azcar sustrato (rojo) est unido cerca del centro de la membrana donde se encuentra expuesto al citosplasma (de PDB ID 1PV7). (b) Cambios estructurales postulados que tienen lugar durante un ciclo de transporte. Las dos mitades clel transporta-

XXJJ

dor experimentan un cambio de conformacin grande y reversible en el que los dos dominios se inclinan uno hacia el otro y exponen el sitio de unin clel sustrato primero al periplasma (estructura de la derecha), donde es captada la lactosa, y despus al citoplasma (izquierda), donde se libera la lactosa. La interconversin de las dos formas est impulsada por cambios en el apareamiento de cadenas laterales cargadas (que se pueden protonar) tales como las de C l u y Arg (verde), que estn afectados por el gradiente protnico transmembrana.
325 302

mtica) est fuertemente cerrado sin que haya un canal lo suficientemente grande como para que entre la lactosa. El mecanismo propuesto para el paso transmembrana del sustrato (Fig. ll-43b) implica un movimiento oscilante entre los dos dominios, impulsado por la unin del sustrato y el movimiento de protones que exponen de forma alternada el dominio de unin de sustrato al citoplasma y al periplasma. Este modelo, conocido como de banana oscilante, es similar al que se muestra en la Figura 11-32 para GLUT1. Cmo se acopla el movimiento de protones hacia el interior de la clula con la captacin de lactosa? Estudios genticos extensos clel transportador de lactosa han establecido que, de los 417 residuos de la protena, slo 6 son absolutamente esenciales para el cotransporte de H + y lactosa: algunos para la fijacin de lactosa, otros para el transporte de protones. Una mutacin en cualquiera de los residuos (Glu32 y Arg 302 ; Superficie apical Luz intestinal Microvilli
*

Fig. 11-43) da como resultado una protena que es an capaz de catalizar la difusin facilitada de la lactosa pero que es incapaz de acoplar el flujo de H + para el transporte cuesta arriba de la lactosa. Puede observarse un efecto similar en clulas salvajes (sin mutar) cuando se bloquea su capacidad de generar un gradiente de protones con CN~: el transportador lleva a cabo la difusin facilitada con normalidad pero no puede bombear lactosa contra un gradiente de concentracin (Fig. ll-42b). Cambios en el apareamiento de cargas entre cadenas laterales afectan al equilibrio entre las dos conformaciones del transportador de lactosa. En clulas epiteliales del intestino, la glucosa y ciertos aminocidos se acumulan por cotransporte paralelo con Na + , a favor del gradiente de Na + establecido por la Na + K + ATPasa de la membrana plasmtica (Fig. 11-44). La superficie apical de las clulas epiteliales del intestino est recubierta por microvi-

Superficie basal Sangre 2K + Na 4 Na + K + ATPasa

3 FIGURA 11-44 Transporte de glucosa en clulas del epitelio intestinal. La glucosa se cotransporta con Na a travs de la membrana plasmtica apical al interior de la clula epitelial. Se desplaza a travs de la clula hasta la superficie basal, donde pasa a la sangre va GLUT2, un transportador pasivo de glucosa. La N a K ATPasa contina bombeando Na hacia fuera para mantener el gradiente de Na que impulsa la captacin de glucosa.
+ + + +

Glucosa Cotransportador paralelo de Na + glucosa (impulsado por alta [Na+]) ansportador nico de glucosa GLUT2 (facilita la salida cuesta abajo)

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Captulo 11

Membranas biolgicas y transporte

lli, que son proyecciones largas y delgadas de la membrana plasmtica que incrementan enormemente el rea superficial expuesta al contenido clel intestino. Los cotransportadores paralelos de Na + -glucosa de la membrana plasmtica apical captan glucosa clel intestino en un proceso impulsado por el flujo cuesta debajo de Na + : 2Naout + glucosa ou 2SaJ + glucosa in La energa requerida para este proceso proviene de dos fuentes: la mayor concentracin de Na^ afuera (potencial qumico) y el potencial transmembrana (potencial elctrico), que es negativo en el interior y por lo tanto facilita la entrada de Na + . El potencial electroqumico de Na + es: [Na+]in \G = ETlnnJKE [Na+ donde n = 2, es el nmero de iones Na + cotransportados con cada molcula de glucosa. Dados el potencial de membrana tpico de 50mV, una [Na + ] mtracelular de 12 mM y una [Na + ] extracelular de 145 IUM, la energa, AG, disponible por la reentrada de 2 iones Na + es 22,5 kJ, suficiente para bombear glucosa en contra de un alto gradiente de concentracin: [glucosa] in AG t = -22,5 kJ = RT ln [glucosa] out
n

Debido al papel esencial de los gradientes de iones en el transporte activo y la conservacin de la energa, los compuestos que colapsan los gradientes de iones a travs de las membranas celulares son venenos eficaces, mientras que aquellos que son especficos para microorganismos infecciosos pueden servir como antibiticos. Una de tales sustancias es la valinomicina, un pptido cclico pequeo que neutraliza la carga del K + al rodearlo con seis oxgenos carbonlicos (Fig. 11-45). El pptido hidrofbico acta entonces como lanzadera transportando el K + a travs de la membrana a favor de su gradiente de concentracin, destruyndolo. Los compuestos que lanzan iones a travs de membranas de esta forma se llaman ionforos ("portadores de iones"). Tanto la valinomicina como la monensina (un ionforo transportador de Na + ) son antibticos; matan clulas microbianas gracias a la destruccin de los procesos de transporte secundario y de las reacciones de conservacin de la energa.
Las acuaporinas forman canales transmembrana hidroflicos para el paso de agua

y asi

[Glucosa] n [Glucosa] out 9000 Esto es, el cotransportador puede bombear glucosa hacia dentro hasta que su concentracin dentro de las clulas epiteliales sea unas 9000 veces la del intestino. A medida que la glucosa se bombea desde el intestino hasta el interior de la clula epitelial en la superficie apical, se desplaza simultneamente desde la clula hasta la sangre por transporte pasivo a travs de un transportador de glucosa (GLUT2) de la superficie basal (Fig. 11-44). El papel crucial del Na + en los sistemas de cotransporte paralelo y antiparalelo descritos requiere el bombeo continuo de Na + hacia el exterior para mantener el gradiente de Na + transmembrana.

Una familia de protenas integrales descubierta por Peter Agre, las acuaporinas (AQP), proporciona canales para el transporte rpido de molculas de agua a travs de la membrana plasmtica (en la Tabla 11-6 se mencionan unos cuantos ejemplos). Cada una de las diez acuaporinas conocidas en la especie humana tiene un papel especializado. Los eritrocitos, que se hinchan o encogen rpidamente en respuesta a cambios bruscos en la osmolaridad extracelular cuando la sangre pasa a travs de la mdula renal, tienen una alta densidad de Peter Agre acuaporina en su membrana plasmtica (2 X 105 copias de AQP-1 por clula). En el nei'rn (unidad funciona] del rion) las membranas plasmticas de las

FIGURA 11-45 La valinomicina, un ionforo peptdico que une K . En esta imagen, los contornos de superficie se muestran como un malla transparente, a travs de la cual son visibles una estructura en varillas del pptido y un tomo de K (verde). Los tomos de oxgeno (rojo) que unen K forman parte de una cavidad hidroflica central. Cadenas laterales de aminocidos hidrofbicos (amarillo) recubren el exterior de la molcula. Debido a que el exterior del complejo K -valinomiclna es hidrofbico, el complejo difunde fcilmente a travs de membranas, transportando K a favor de su gradiente de concentracin. La disipacin clel gradiente inico transmembrana resultante mata las clulas microbianas, por lo que la valinomicina es un potente antibitico.
+ + + + +

11.3

Transporte de solutos a tra.es de membranas

407

clulas tubulares proximales del rion tienen cinco tipos diferentes de acuaporinas. Estas clulas reabsorben agua durante la formacin de la orina, un proceso para el que es esencial el paso del agua a travs de membranas (Recuadro 11-3). La planta Arabidopsis thaliana tiene 38 genes que codifican varios tipos de acuaporinas, lo que refleja el papel crtico clel transporte de agua en la fisiologa vegetal. Por ejemplo, los cambios en la presin de turgencia requieren un desplazamiento rpido del agua a travs de una membrana. Las molculas de agua atraviesan el canal de la AQP-1 a una velocidad de aproximadamente 109 s - 1 . En comparacin, el nmero de recambio ms alto conocido para un enzima es el de la catalasa, 4 X 10' s , y muchos enzimas tienen un nmero de recambio de entre 1 s _ 1 y 104 s - 1 (vase Tabla 6-7). La baja energa de activacin para el paso clel agua a travs de los canales de acuaporina (AG* < 15 kJ/mol) sugiere que el

agua se mueve a travs de los G n a l e s en uraa : : arlante continua en la direccin dictada por el jra a-:.:- : ;a.::ico. (Para una discusin sobre la osmosis, v a s e -. : " I - esencial eme las acuaporinas no permitan el p as: a a a r a r a ; a ae; a: lia ro, H 3 0 + ), que colapsaranlos potenciales alaran rainal: as de las membranas. Y no lo hacen. Cul es la lasa aa esaa extraordinaria selectividad? Encontramos una respuesta en la estructura de AQP-1, determinada por anfisis de difraccin de rayos X (Fig. 11-46). La AQP-1 tiene cuatro monmeros (cada uno con Af~r 28.000) asociados en un tetrmero, en el que cada monmero forma un poro transmembrana tetramrico con un dimetro (2 a 3 A) suficiente para permitir el paso de molculas de agua en fila. Cada m o n m e r o consiste en seis segmentos helicoidales transmembrana y dos hlices ms cortas, cada una de las cuales contiene la secuencia Asn-Pro-Ala (NPA). Las hlices cortas

(b)
FIGURA 11-46 Estructura de una acuaporina, AQP-1. La protena es un tetrmero de unidades monomricas idnticas, cada una de las cuales forma un poro transmembrana (de PDB ID 1J4N). (a) Modelo de la superficie, vista perpenclicularmente al plano de la membrana. La protena contiene cuatro poros, uno en cada subunidad. (La abertura en el punto de unin de las subunidades no es un poro.) (b) Un tetrmero de AQP-1, visto desde el plano de la membrana. Las hlices de cada subunidad se agrupan alrededor de un poro transmembrana central. En cada monmero dos bucles helicoidales cortos, uno entre las hlices 2 y 3 y el otro entre las 5 y 6, contienen las secuencias Asn-Pro-Ala (NPA) que estn en todas las acuaporinas y que forman parte clel canal de agua, (c) Superficie de una subunidad simple, vista

(d)
desde el plano de la membrana. Se ha eliminado la parte frontal de la AQP-1 para mostrar el canal que transcurre de arriba abajo. Las molculas de agua (esferas naranja) muestran el paso probable de stas a travs del canal de la acuaporina, segn predicciones hechas mediante simulaciones de dinmica molecular en las que se han utilizado las propiedades del agua y de la acuaporina para calcular los estados de mnima energa. Los tomos hlclroflicos que dan interacciones selectivas con el agua en el canal se muestran en rojo, (d) Vista a lo largo del canal en la que se muestra la regin de constriccin clel poro de especificidad, que slo permite que pase una molcula tan pequea como el agua, fas cadenas laterales de Phe , His , Cys y A r g crean esta constriccin.
58 182 191 197

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Captulo 11

Membranas biolgicas y transporte

TABLA 11-6 Acuaporinas

Acuaporina AQP-1 Funcin y/o localizacin Reabsorcin de fluidos en el tbulo renal proximal; secrecin del humor acuoso en el ojo y lquido cefalorraqudeo en el sistema nervioso central; homeostasis del agua en el pulmn Permeabilidad del agua en el conducto colector renal; (mutaciones producen la diabetes nefrognica inspida) Retencin de agua en el conducto colector renal Reabsorcin del lquido cefalorraqudeo en el sistema nervioso central; regulacin del edema cerebral Secrecin de fluido en las glndulas salivares, glndulas lacrimales y epitelio alveolar del pulmn Rion Tbulo renal proximal, Intestino Hgado, pncreas, colon, placenta Hgado, leucocitos Regulacin de la presin de turgencia en el tonoplasto de plantas Membrana plasmtica vegetal Membrana plasmtica de levaduras

AQP-2 AQP-3 AQP-4 AQP-5

AQP-6 AQP-7 AQP-8 AQP-9 TIP PIP AQY

que contienen NPA se extienden hacia el centro de la bicapa desde lados opuestos y sus regiones NPA se solapan en el centro de la membrana para formar parte del filtro de especificidad, la estructura que permite que slo pase agua. Los residuos que recubren el canal de cada monmero de AQP-1 son, generalmente, apolares, pero los oxgenos carbonlicos del esqueleto polipeptdico, que se proyectan hacia la parte estrecha del canal a intervalos, pueden formar puentes de hidrgeno con las molculas de agua individuales que pasan a travs del mismo; los dos residuos Asn (Asn7(> y Asn 192 ) de los bucles NPA tambin forman puentes de hidrgeno con el agua. La estructura no admite la presencia de molculas de agua muy cercanas unas de otras, ya que podran formar una cadena que permitira el salto de protones (vase Fig. 2-14), lo cual transportara de manera efectiva protones a travs de la membrana. Los residuos crticos de Arg e His y los dipolos elctricos formados por las hlices cortas de los bucles NPA proporcionan cargas positivas en posiciones que repelen cualquier protn que se hubiera podido escapar a travs clel poro.
Los canales selectivos de iones permiten el movimiento rpido de iones a travs de las membranas

Inicialmente reconocidos en neuronas mientras que ahora se sabe que estn presentes en las membranas plasmticas de todas las clulas, as como en las membranas intracelulares de los eucariotas, los canales selectivos de iones proporcionan otro mecanismo para transportar iones inorgnicos a travs de las membranas. Los canales inicos, junto con las bombas de iones tales como la Na + K + ATPasa, determinan la permeabilidad de una membrana plasmtica a iones especficos y regulan la concentracin citoslica de iones as como el potencial de

membrana. En neuronas, cambios muy rpidos en la actividad de los canales inicos provocan cambios en el potencial de membrana (los potenciales de accin) que transportan seales desde el extremo de una neurona a otra. En los miocitos, la abertura rpida de los canales de Ca 2+ en el retculo sarcoplasmtico libera el Ca 2+ que desencadena la contraccin muscular. Trataremos las funciones de sealizacin de los canales inicos en el Captulo 12. Aqu describiremos las bases estructurales de la funcin de los canales inicos, usando como ejemplos un canal de K + bacteriano, el canal neuronal de Na + y el canal inico clel receptor de acetilcolina. Los canales inicos se distinguen de los transportadores de iones en al menos tres cosas. Primero, la velocidad de flujo a travs de los canales puede ser varios rdenes de magnitud mayor que el nmero de recambio de un transportador (10' a 10 8 iones/s para un canal inico, cercano al mximo terico para la difusin no restringida). Segundo, los canales inicos no se saturan; sus velocidades no se acercan a un mximo a una concentracin de sustrato elevada. Tercero, son "compuertas", abiertas o cerradas en respuesta a algn proceso celular En los canales de compuerta regulada por ligando (que son generalmente oligomricos), la unin de una molcula extracelular o intracelular pequea fuerza una transicin alostrica de la protena, que abre o cierra el canal. En los canales inicos de compuerta regulada por voltaje, un dominio de una protena cargada se mueve con relacin a la membrana como respuesta a un cambio de potencial elctrico transmembrana (U m ), abriendo o cerrando el canal inico. Los dos tipos de compuerta pueden ser muy rpidos. Un canal tpico se abre en una fraccin de milisegundo y puede permanecer abierto slo milisegundos, haciendo que estos dispositivos moleculares sean efectivos para una transmisin muy rpida de seal en el sistema nervioso.

11.3

Transporte de solutos a travs de membranas

409

ping han revelado que hasta 104 iones pueden pasar a travs de un solo canal en un milisegundo. Este flu; asenta una enorme amplificacin de la seal inicial; para el receptor de acetilcolina, por ejemplo, slo dos molculas de acetilcolina son necesarias para abrir un canal receptor de acetilcolina (tal como se describe ms adelante).
La estructura de un canal de K' muestra las bases de su especificidad
Erwin Neher Bert Sakmann

La funcin del canal inico se mide elctricamente

Debido a que un canal inico sencillo normalmente se mantiene abierto durante unos pocos milisegundos, el seguimiento de este proceso est ms all del lmite de la mayora de las medidas bioqumicas. El flujo de iones tiene que ser medido por lo tanto elctricamente, ya sea como cambios en Vm (en la zona de milivoltios) o como corrientes elctricas / (en microamperios o picoamperios), utilizando microelectrodos y amplificadores adecuados. El patch-clamping, una tcnica desarrollada por Edwin Neher y Bert Sakmann en 1976, mide corrientes muy pequeas a travs de una minscula regin de la superficie de la membrana que contiene slo una o una pocas molculas de canal inico (Fig. 11-47). Se pueden medir el tamao y la duracin de la corriente que fluye durante una abertura de un canal inico y se puede medir con qu frecuencia se abre un canal y c m o queda afectada esta frecuencia por el potencial transmembrana, los ligandos reguladores, toxinas y otros agentes. Los estudios de patch-clamCanal

La estructura del canal de potasio de la bacteria Streptomyces lividans, detemnada cristalogrficamente por Roderick MacKinnonn en 1998, proporciona mucha informacin sobre el funcionamiento de los canales de iones. Este canal inico bacteriano est relacionado en secuencia con todos los d e m s canales de K + conocidos y sirve como prototipo de dichos canales, incluidos los canales de K + de compuerta regulada por voltaje de neuronas. Entre los miembros de esta familia de protenas, las similitudes ele secuencia son mximas en la "re- Roderick MacKinnon gin del poro" que contiene un filtro de selectividad de ion que permite el paso de K + (radio 1,33 ) 10.000 veces ms fcilmente que el Na + (radio 0,95 ) a una velocidad (mos 108 iones por segundo) cercana al lmite terico de la difusin libre. El canal de K + est formado por cuatro subunidades idnticas que abarcan la membrana y forman un cono dentro de un

Micro-pipeta aplicada fuertemente a la membrana plasmtica

Porcin de membrana arrancada de la clula Porcin de membrana colocada en una disolucin acuosa

Micropipeta Electrodos Componentes electrnicos para mantener un potencial transmembrana (Vm) constante y medir la corriente que fluye a travs de la membrana

FIGURA 11-47 Mediciones elctricas de la funcin de un canal inico. La "actividad" de un canal inico se determina midiendo el flujo de Iones a travs del mismo, usando la tcnica de patch-clamping. Se presiona una micropipeta muy fina contra la superficie celular y la presin negativa en la pipeta se usa para formar un sello de presin entre la pipeta y la membrana. Cuando la pipeta es retirada de la clula, arranca un pequeo trozo (patch) de membrana (que puede contener uno o unos pocos canales inicos). Cuando la pipeta y el trozo adherido se colocan en una solucin acuosa, se puede medir la actividad del canal en funcin de la corriente elctrica que fluye entre los contenidos de la pipeta y la solucin acuosa. En la prctica, se crea un circuito que "sujeta" (clamps) el potencial transmembrana a un valor dado y mide la corriente que debe fluir para mantener este voltaje. Con detectores de corriente muy sensibles, se puede medir la corriente que fluye a travs de un canal inico individual, que es, tpicamente, de unos pocos picoamperios. La traza que muestra la corriente en funcin del tiempo (en milisegundos) revela la rapidez a la cual se abre y se cierra el canal, la frecuencia de abertura y el tiempo que permanece abierto. "Sujetando" el V a diferentes valores se consigue la determinacin del efecto del potencial de membrana sobre estos parmetros de la funcin del canal.
m

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Captulo 11

Membranas biolgicas y transporte

Exterior

O x g e n o s carbonlicos de la cadena principal forman una caja a la que se adapta precisamente el K+, reemplazando aguas de la esfera de hidratacin Espacio extracelular

Sitios alternantes de K+ (azul o verde) ocupados El dipolo de la hlice estabiliza elK +

Interior (a)
+

(b)

FIGURA 11-48 Estructura y funcin del canal de K de Streptomyees lividans. PDB ID 1 BL8) (a) Visto en el plano de la membrana, el canal est formado por ocho hlices transmembrana (dos de cada una de las cuatro subunidades idnticas), formando un cono con su extremo ancho hacia el espacio extracelular. Las hlices internas del cono (de color ms claro) revisten el canal transmembrana, mientras que las hlices externas interaccionan con la bicapa lipdica. Segmentos cortos de cada subunidad convergen en el extremo abierto del cono para formar un filtro selectivo, (b) Esta vista perpendicular al plano de la membrana muestra las cuatro subunidades dispuestas alrededor de un canal central lo suficientemente ancho como para que pase un nico ion K . (c) Diagrama de un canal de K en seccin transversal que muestra las caractersticas crticas para su funcin. (Vase tambin Fig. 11-49.)
+ +

El amplio vestbulo lleno de agua permite la hidratacin del K+ K+ con molculas de agua de hidratacin

(C)

cono en torno al canal inico, con el extremo ancho clel doble cono mirando hacia el espacio extracelular (Fig. 11-48). Cada subunidad tiene dos hlices a transmembrana y una tercera hlice ms corta que contribuye a la regin del poro. El cono externo est formado por una de las hlices transmembrana de cada subunidad. El cono interior, formado por las cuatro hces transmembrana restantes, rodea al canal inico y contiene el filtro de selectividad de ion. La especificidad inica y el alto flujo por el canal son explicables a partir de lo que conocemos sobre la estructura del canal. En las superficies externa e interna de la membrana plasmtica, los caminos de entrada al canal tienen varios residuos aminocidos con cargas negativas, que presumiblemente incrementan la concentracin local de cationes tales como K + y Na + . La ruta del ion a travs de la membrana comienza (en la cara externa) como un canal ancho, relleno de agua, en el que el ion puede mantener su esfera de hidratacin. Se logra una mayor estabilizacin gracias a las hlices a cortas en la regin del poro de cada subunidad, con las cargas negativas parciales de sus dipolos elctricos apuntando hacia el K + en el canal. A los dos tercios del camino a travs de la membrana, este canal se estrecha en la regin clel filtro de selectividad obligando al ion a perder sus molculas de agita de hidratacin. Los tomos de oxgeno del grupo carbonilo de la cadena principal del filtro de selectividad reemplazan las molculas de agua de la esfera de hidratacin, formando ima serie de capas de hidratacin perfectas a travs de las cuales se mueve el K + . Esta interaccin favorable con el filtro no es posible para el Na + , que es muy pequeo para establecer los contactos con todos los ligan-

dos oxgeno potenciales. La estabilizacin preferencial clel K + es la base de la selectividad inica clel filtro, por lo que mutaciones que cambian residuos en esta parte de la protena eliminan la selectividad inica del canal. En el filtro de selectividad existen cuatro sitios potenciales de fijacin de K + , cada uno de ellos formado por una "jaula" de oxgeno que proporciona ligandos para los iones K + (Fig. 11-49). En la estructura cristalina son visibles dos K + dentro del filtro de selectividad, separados unos 7,5 , mientras que dos molculas de agua se encuentran en las posiciones no ocupadas. Los iones K + pasan a travs del filtro en una nica fila; muy probablemente sus repulsiones electrostticas mutuas equilibran la interaccin de cada ion con el filtro de selectividad, mantenindolos en movimiento. El desplazamiento de los dos iones K + es concertado: en primer lugar ocupan las posiciones 1 y 3, saltando despus a las posiciones 2 y 4 (Fig. 11-48c). La diferencia energtica entre estas dos configuraciones (1, 3 y 2, 4) es muy pequea; energticamente, el poro de selectividad no es un conjunto de colinas y valles sino una superficie plana que es ideal para el desplazamiento rpido a travs del canal. Parece que la estructura clel canal se ha optimizado durante la evolucin para dar velocidades de flujo mximas y alta especificidad.
El canal de Na' neuronal es un canal inico de compuerta regulada por voltaje

Los canales del ion Na + de la membrana plasmtica de las neuronas y de los miocitos del corazn y msculo esqueltico

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Transporte de solutos a tra\s ce membranas

411

Se cree que la inactivacin del ranal ::er.e lurar gracias a un mecanismo de bola y cadena. Ur. :.:r ara: .- .: a r .reina de la cara citoslica del canal de Na~. Lama a r rr aer: a aa Inactivacin (la bola), est atado al canal arar aa: sepa era: rano del polipptido (la cadena) (Fig. ll-50b). H a r drmarar aeae libertad para moverse cuando el canal est cerrado, rr-err ruando se abre aparece un sitio en la cara interna del canal para la bola atada bloqueando el canal. La longitud de la aradura parece determinar el tiempo que el canal est abierto: cuanto ms larga es la atadura, mayor es el perodo de aberrara. La inactivacin de otros canales inicos podra transcurrir por un mecanismo similar.
FIGURA 11-49 Sitios de unin de K en el poro de selectividad del canal de K . (PDB ID 1J95) tos oxgenos carbonlicos (rojo) clel esqueleto peptdico en el filtro de selectividad sobresalen en el canal, nteraccionando con un ion K que pasa por el mismo, estabilizndolo. Estos liganclos estn poslcionados perfectamente para interaccionar con cada uno de los cuatro iones K , pero no con los iones Na , que son ms pequeos. Esta interaccin preferencial con el K constituye la base de la selectividad inica, ta repulsin mutua entre iones K hace que slo dos de los cuatro sitios de K estn ocupados simultneamente (los dos verdes o los dos azules) al tiempo que contrarresta la tendencia de un ion K solitario a permanecer unido en un sitio. El efecto combinado de la unin de K a oxgenos carbonlicos y la repulsin entre iones K asegura que un ion se mantenga en movimiento, cambiando posiciones en 10 a 100 ns, y que no existan barreras energticas grandes para el flujo inico a lo largo del paso a travs de la membrana.
+ + + + + + + + T + +

El receptor de acetilcolina es un canal inico de compuerta regulada por ligando

detectan gradientes elctricos a travs de la membrana y responden abrindose y cerrndose. Estos canales de compuerta regulada por voltaje son tpicamente muy selectivos para Na + con respecto a otros cationes monovalentes o divalentes (con factores de 100 o ms) y tienen una velocidad de flujo muy alta (>10 7 iones/s). Normalmente (en estado de reposo) en la conformacin cerrada, los canales de Na + se abren (activan) por una reduccin del potencial elctrico transmembrana y a continuacin experimentan una inactivacin muy rpida. En cuestin de milisegundos despus de su abertura, el canal se cierra y permanece inactivo durante muchos milisegundos. La activacin seguida de la inactivacin de los canales de Na + es la base de la sealizacin por las neuronas (vase Fig. 12-5). El componente esencial de un canal de Na + es un polipptido largo y sencillo (1840 residuos aminocidos) organizado en cuatro dominios agrupados alrededor de un canal central (Fig. ll-50a, b), proporcionando un paso para el Na + a travs de la membrana. Este paso es especfico para Na + gracias a una "regin de poro" compuesta por segmentos entre las hlices transmembrana 5 y 6 de cada dominio, que se pliegan dentro del canal. La hlice 4 de cada dominio tiene una alta densidad de residuos con cargas positivas; se cree que este segmento se mueve dentro de la membrana en respuesta a cambios en el voltaje transmembrana, desde el potencial de "reposo" de unos - 6 0 mV (negativo dentro) a irnos +30 mV. El movimiento de la hlice 4 provoca la abertura del canal, siendo sta la base de la compuerta regulada por voltaje (Fig. ll-50c).

Otro canal inico muy bien estudiado es el receptor nicotnico de acetilcolina, que es esencial para el paso de una seal elctrica de una neurona motora a ma fibra muscular en la unin neuromuscular (seala al msculo para que se contraiga). (Los receptores mcotnicos se distinguieron originariamente de los receptores muscarnicos por la sensibilidad de los primeros para la nicotina y de los segundos para el alcaloide fngico muscarina. Son estructural y funcionalmente diferentes.) La acetilcolina liberada por la neurona motora difunde unos pocos micrmetros hacia la membrana plasmtica de un miocito, donde se une al receptor de acetilcolina. Esto fuerza a un cambio de conformacin en el receptor, provocando la abertura de su canal inico. El movimiento resultante de las cargas positivas hacia el interior despolariza la membrana plasmtica desencadenando la contraccin. El receptor de acetilcolina permite que Na + , Ca 2+ y K + entren con igual facilidad, pero impide el paso a otros cationes y a cualquier anin. El movimiento de Na + a travs del canal inico del receptor de acetilcolina es insaturable (su velocidad es lineal con respecto a la concentracin extracelular de Na + ) y muy rpido, cerca de 2 X 107 iones/s en condiciones fisiolgicas. ^H3 O CH 2 CH 2 N CH 3 CH 3 Acetilcolina Este canal receptor es caracterstico de muchos otros canales inicos que producen o responden a seales elctricas: tiene una "compuerta" que se abre en respuesta a la estimulacin por una molcula seal (en este caso acetilcolina) y un mecanismo intrnseco de temporizacin que cierra la compuerta al cabo de un instante. a\s, la seal de acetilcolina es transitoria, lo que es una caracterstica esencial de la conduccin de seales elctricas. Los cambios estructurales que son la base de la abertura del receptor de acetilcolina son conocidos, pero no as el mecanismo de "desensibilizacin" o cierre de la compuerta, incluso en presencia continua de acetilcolina. El receptor nicotnico de acetilcolina est compuesto por cinco subunidades: copias simples de las subunidades 3, y y 6, y dos copias idnticas de la subunidad a, cada una de estas lCH3-c( O

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Captulo 11

Membranas biolgicas y transporte

Exterior +++++

Compuerta de activacin

Sensor de voltaje IV-

Filtro selectivo (poro) Compuerta de activacin

\^(Qk&l

Interior

-Sensor Membrana polarizada, voltaje canal cerrado Canal i n i c o acuoso

e

Exterior

Atadura
+

(b)

Compuerta de inactivacin (abierta)

Interior

Na 4 Membrana despolarizada, canal abierto (c)

+ +

FIGURA 11-50 Canales de Na de entrada regulada por voltaje de neuronas. Los canales de sodio de varios tejidos y organismos tienen una serie de subunidades, pero slo la subunidad principal (a) es esencial, (a) La subunidad a es una protena grande con cuatro dominios homlogos (del I al IV); cada uno de ellos contiene seis hlices transmembrana (1 a 6). La hlice 4 de cada dominio (azul) es el sensor de voltaje; se cree que la hlice 6 (naranja) es la compuerta de activacin. Los segmentos entre las hlices 5 y 6, la regin del poro (rojo), forman el filtro selectivo, mientras que el segmento que conecta los dominios III y IV (verde) es la compuerta de inactivacin, (b) Los cuatro dominios envuelven un canal transmembrana central revestido de residuos aminocidos polares. Los segmentos que unen las hlices 5 y 6 (rojo) en cada dominio se disponen juntos cerca de la superficie extracelular para formar el filtro selectivo, que se con-

serva en todos los canales de Na . El filtro dota al canal de capacidad para discriminar entre N a y otros iones de tamao similar. La compuerta de inactivacin (verde) se cierra (lneas punteadas) poco despus de que se abra la compuerta de activacin, (c) El mecanismo sensor de voltaje supone el movimiento de la hlice 4 (azul) perpendicular al plano de la membrana en respuesta a un cambio del potencial transmembrana. Tal como se muestra en la parte superior, la fuerte carga positiva de la hlice 4 la desplaza hacia dentro en respuesta al potencial (interior negativo) de membrana (V ). La despolarizacin reduce este desplazamiento y la hlice 4 se relaja al moverse hacia fuera (parte inferior). Este movimiento se comunica a la compuerta de activacin (naranja), induciendo cambios conformacionales que abren el canal en respuesta a la despolarizacin.
m

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Transporte de solutos a travs de membranas

413

timas con un sitio de unin para acetilcolina. Las cinco subunidades estn relacionadas en secuencia y estructura terciaria y cada una tiene cuatro segmentos helicoidales transmembrana (MI a M4) (Fig. ll-51a). Las cinco subunidades rodean un poro central, que est recubierto por sus hlices M2. El poro
+

es de aproximadamente 20 A de gres : r en las r. ar.es del canal que sobresalen de las caras citoplasma:: .. dar. pero se estrecha cuando pasa a travs l e la i .-. _;. iliea. Cerca del centro de la bicapa hay un anille l e -,-; a :;as caleas laterales hidrofbicas de resida ? ":e . a ." . -a:e; l ' _
1

Las h l i c e s antipticas M2 envuelven el canal Las cadenas voluminosas laterales de La u n i n de dos m o l c u l a s Leu de las h l i c e s M2 de acetilcolina provoca la cierran el canal. torsin de las h l i c e s M2. Las h l i c e s M2 tienen ahora residuos polares ms pequeos recubriendo el canal.
FIGURA 11-51 Estructura del canal inico del receptor de acetilcolina. (a) Cada una de las cinco subunidades (a fyS) tiene cuatro hlices transmembrana, de MI a M4. Las hlices M2 son anfipticas; las otras tienen principalmente residuos hidrofbicos. Las cinco subunidades estn dispuestas alrededor de un canal transmembrana central, que est recubierto por los lados polares de las hlices M2. En la parte superior y en la inferior del canal hay anillos de residuos aminocidos cargados negativamente, (b) Esta vista superior de una seccin transversal a travs clel centro de las hlices M2 muestra cinco cadenas laterales de Leu (una de cada hlice M2) sobresaliendo dentro clel canal, constrinclolo a un dimetro demasiado pequeo para permitir el paso de iones tales como Ca , N a y K . Cuando ambos sitios receptores de acetilcolina (uno en cada subunidad a) estn ocupados, tiene lugar un cambio conformacional. A medida que las hlices M2 se tuercen ligeramente, los cinco residuos de leu (amarillo) giran alejndose clel canal y son reemplazados por residuos polares ms pequeos (azul). Este mecanismo de abertura abre el canal, permitiendo el paso de Ca , Na o K .
2 2+ + + 2+ + +

2 Acetilcolina

(b)

Abierto

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Captulo 11

Membranas biolgicas y transporte

posicionadas tan cerca unas de otras que impiden el paso de los iones por el canal. Los cambios de conformacin alostrieos inducidos por la unin de acetilcolina a las dos subunidaTABLA 11 -7

des a incluyen un ligero giro de las hlices M2 (Fig. ll-51b), que desplaza estas cadenas laterales hidrofbicas fuera del centro del canal y lo abre para el paso de los iones.

Sistemas de transporte descritos en otras partes de este libro

Nmero de figura Funcin 19-26 17-6 19-26 19-27 19-27 21-10 21-10 17-3 19-15 Importa el sustrato ADP para la fosforilacin oxidativa y exporta el producto ATP Importa cidos grasos a la matriz para la (3-oxidacin Suministra P para la fosforilacin oxidativa Lanza equivalentes de reduccin (en forma de malato) desde la matriz al citosol Completa la accin iniciada por la lanzadera de malato-a-cetoglutarato Proporciona citrato al citosol como fuente de acetil-CoA para la sntesis de lpidos Forma parte del mecanismo de la lanzadera de citrato desde la matriz al citosol Importa cidos grasos para ser utilizados como combustible Acta como mecanismo conservador de la energa en la fosforilacin oxidativa, convirtiendo el flujo electrnico en un gradiente de protones Permite la disipacin del gradiente protnico de la mitocondria como medio de termognesis y/o eliminacin de exceso de combustible Acta como bomba de protones, impulsada por el flujo electrnico a travs del esquema en Z; fuente de un gradiente de protones para la formacin fotosinttica de ATP Es la fuente del gradiente de protones impulsado por la luz para la sntesis de ATP en la bacteria halfila Interconvierte la energa del gradiente de protones y del ATP durante la fosforilacin oxidativa y la fotofosforilacin Exporta productos fotosintticos desde el estroma; importa P para la sntesis de ATP Exporta protenas secretadas a travs de la membrana plasmtica Transporta protenas al RE destinadas a la membrana plasmtica, a la secrecin o a orgnulos Lanzadera de protenas entre el ncleo y el citoplasma Importa, mediante endocitosis facilitada por receptor, partculas transportadoras de lpidos Aumenta la capacidad del msculo y del tejido adiposo para captar el exceso de glucosa de la sangre Permite la sealizacin mediante cambios en la concentracin citoslica de Ca Permite la sealizacin va rodopsina unida a cAMP fosfodiesterasa en el ojo de vertebrados Crea potenciales de accin en la transmisin de la seal neuronal
2+

Sistema de transporte y localizacin Cotransportador antiparalelo de nucletidos de adenina de la membrana mitocondrial interna Transportador de acil-carnitina/carnitina de la membrana mitocondrial interna Cotransportador paralelo P-H~ de la membrana mitocondrial interna Transportador de malato-a-cetoglutarato de la membrana mitocondrial interna Transportador de glutamato-aspartato de la membrana mitocondrial interna Transportador de citrato de la membrana mitocondrial interna Transportador de piruvato de la membrana mitocondrial interna Transportador de cidos grasos de la membrana plasmtica del miocito Transportadores de protones a travs de los Complejos 1, III y IV de la membrana mitocondrial interna Termogenina (protena desacopladora), un poro protnico de la membrana mitocondrial interna Complejo del citocromo b f, transportador de protones del tilacoide del cloroplasto
e

19-30,23-22

19-50, 19-54

Bacteriorrodopsina, bomba de protones impulsada por la luz mitocondrial interna, tilacoide del cloroplasto y membrana plasmtica bacteriana Cotransportador antiparalelo P-triosa fosfato de la membrana interna del cloroplasto Transportador proteico bacteriano Protena translocasa del RE Protena translocasa del poro nuclear Receptor de LDL en la membrana plasmtica de clulas animales Transportador de glucosa de la membrana plasmtica de clulas animales; regulado por insulina Canal de Ca regulado por IP del retculo endoplasmtico Canal de Ca regulado por cGMP de los bastones y conos de la retina Canal de Na de compuerta regulada por voltaje de la neurona
2+ 3 2+ +

19-59 19-58

F Fi ATPasa/ATP sintasa de la membrana

0

20-15,20-16 27-39 27-33 27-37 21-42 12-8 12-19 12-32 12-5

11.3

Transporte de solutos a travs de iembranas

415

B a s n d o s e en similitudes entre las secuencias de aminocidos de otros canales inicos de compuerta regulada por ligando y el receptor de acetilcolina, los canales receptores que responden a las seales extracelulares cido y-annobutrico (GABA), glicina y serotonina se han clasificados en la superfamilia del receptor de acetilcolina; todos ellos comparten probablemente la estructura tridimensional y los mecanismos de compuerta. Los receptores GABAA y de glicina son canales amnicos especficos para Cl~ o HCOg , mientras que el receptor de serotonina, al igual que el receptor de acetilcolina, es especfico para cationes. Las subunidades de cada uno de estos canales, como las del receptor de acetilcolina, tienen cuatro segmentos helicoidales transmembrana y forman canales oligomricos. Una segunda clase de canales inicos de compuerta por ligando responde a ligandos intracelulares: el nucletido guanosina 3',5'-cclico (cGMP) en el ojo de vertebrados, cGMP y cAMP en neuronas olfativas, y ATP e inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3) en muchas tipos celulares. Estos canales estn compuestos por mltiples subunidades que contienen cada una seis donnios helicoidales transmembrana. Describiremos las funciones de sealizacin de estos canales inicos en el Captulo 12. En la Tabla 11-7 se muestran una serie de transportadores no descritos en este captulo pero que se encontrarn ms adelante en el contexto de las rutas en las que actan.
Canales inicos defectuosos pueden tener consecuencias fisiolgicas adversas

una mutacin que modifica un antir.iaiii: en la ;r::ena CFTR, un canal de iones Cl . Aqu, el proceso defectivo no es una neurotransmisin, sino la secrecin por vanas clulas glandulares exocrinas cuyas actividades estn ligadas a ios u:_s del ion CP; el proceso defectuoso en este caso no es la r.eurotraiismisin sino la secrecin por las clulas de diversas glndulas exocrinas que precisan flujos de iones Cl . Muchas toxinas presentes en la naturaleza actan a menudo sobre canales inicos y la potencia de estas toxinas ilustra an ms la importancia de que el funcionamiento de los canales inicos sea normal. La tetrodoxina (producida por el pez soplador, Sphaeroides rubripes) y la saxitoxina (producida por el dinoflagelado marino Gonyaidax, causante de las "mareas rojas") actan unindose a los canales de Na + de compuerta regulada por voltaje de las neuronas impidiendo de este modo los potenciales de accin normales. El pez soplador es un

H9N = HOCH 2 OH H OH

La importancia de los canales inicos en los procesos fisiolgicos est clara a partir de los efectos de mutaciones en protenas de canales inicos especficos (Tabla 11-8). Los defectos genticos en el canal de Na + de compuerta regulada por voltaje de la membrana plasmtica de miocito causan a enfermedades en las que los msculos se paralizan peridicamente (tal como sucede en la parlisis peridica hipercalimica) o se vuelven rgidos (como en la paramiotona congnita). Tal como ya se ha descrito, la fibrosis qustica es el resultado de

Tetrodotoxina
H,N NH,

Saxitoxina

TABLA 1 1 - 8 Algunas enfermedades debidas a canales inicos defectuosos

Canal inico Na (compuerta regulada por voltaje, msculo esqueltico)
+

Gen afectado SCN4A SCN1A SCN5A CACNA1A CACNA1F PKD1 KCNQ4 KCNQ2 CNCG1 CHRNA1 CFTR

Enfermedad Parlisis peridica hipercalimica (0 paramiotona congnita) Epilepsia generalizada con ataques febriles Sndrome 3 de largo QT Migraa hemipljica familiar Ceguera nocturna estacionaria congnita Enfermedad renal poliqustica Sordera dominante Convulsiones neonatales familiares benignas Retinitis pigmentosa Sndrome miastnico congnito Fibrosis qustica

Na (compuerta regulada por voltaje, neuronal) Na (compuerta regulada por voltaje, msculo cardaco) Ca (neuronal) Ca (compuerta regulada por voltaje, retina) Ca (policistina-1) K (neuronal) K (compuerta regulada por voltaje, neuronal) Catin inespecfico (regulado porcGMR retinal) Receptor de acetilcolina (msculo esqueltico)
+ + 2+ 2+ 2+ + +

en

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Captulo 11

Membranas biolgicas y transporte

D-Tubocurarina. cloruro

ingrediente de la exquisitez iaponesafugu, que slo puede ser preparada por chefs especialmente formados para separar la suculenta carne del veneno mortal. Comer marisco que se haya alimentado con Gonyaulax puede ser tambin fatal; el marisco no es sensible a la saxitoxina, pero la concentra en sus msculos, que pasan a ser altamente venenosos para organismos que se hallan ms arriba en la cadena alimentaria. El veneno de la serpiente mamba negra contiene dendrotoxina, que interfiere en el canal de K + de compuerta regulada por voltaje. La tubocurarina, componente activo del curare (usado como veneno para flechas en el Amazonas) y otras dos toxinas de venenos de serpiente, cobrotoxina y bungarotoxina, bloquean el receptor de acetilcolina o impide la abertura de su canal inico. Al bloquear seales desde los nervios a los msculos, todas estas toxinas provocan parlisis y posiblemente la muerte. En el lado positivo, la extremadamente elevada afinidad de la bungarotoxina por el receptor de la acetilcolina (K = 10~ 15 M) ha sido til experimentalmente: la toxina marcada radiactivamente fue usada para cuantificar el receptor durante su purificacin.
RESUMEN 11.3 Transporte de solutos a travs de membranas

El movimiento de iones y de compuestos polares a travs ele las membranas biolgicas requiere transportadores proteicos. Algunos slo facilitan la difusin pasiva a travs de la membrana desde el lado de mayor concentracin al de menor. Otros realizan el transporte activo de solutos en contra de un gradiente electroqumico; este transporte ha de estar acoplado a una fuente de energa metablica. Los transportadores, como los enzimas, presentan saturacin y estereoespecificidad para sus sustratos. El transporte a travs de estos sistemas puede ser pasivo o activo. El activo primario est impulsado por ATP o reacciones de transferencia electrnica; el activo secundario, por el flujo acoplado de dos solutos, uno de los cuales (H + o Na + ) fluye a favor de su gradiente electroqumico al tiempo que el otro es impulsado en contra de su gradiente. Los transportadores GLUT, tales como GLIJT1 de los eritrocitos, transportan glucosa al interior de las clulas por difusin facilitada. Estos transportadores son transportadores sencillos o uniport y acarrean un

solo sustrato. Los cotransportadores paralelos o simport permiten el paso simultneo de dos sustancias en la. misma direccin; el transportador de lactosa de E. coli impulsado por la energa de un gradiente de protones (simport lactosa-H + ) y el transportador de glucosa de las clulas epiteliales del intestino, impulsado por un gradiente de Na + (simport glucosa-Na + ) son ejemplos de cotransportadores paralelos. Los cotransportadores antiparalelos (antiport) facilitan el paso simultneo de dos sustancias en direcciones opuestas; ejemplos son el intercambiador de cloruro-bicarbonato de los eritrocitos y la Na + K + ATPasa que es ubicua. En las clulas animales, la Na + K+ ATPasa mantiene las diferencias entre las concentraciones citoslica y extracelular de Na + y K + . El gradiente de Na + resultante se usa como fuente de energa para diversos procesos de transporte activo secundarios. La Na + K + ATPasa de la membrana plasmtica y los transportadores de Ca 2+ de los retculos sarcoplasmtico y endoplasmtico (las bombas SERCA) son ejemplos de ATPasas tipo P; experimentan fosforilacin reversible durante su ciclo cataltico y son mhibidas por el vanadato, que es un anlogo del fosfato. Las bombas de protones tipo F (ATP sintasas) son fundamentales para los mecanismos de conservacin de energa en mitocondrias y cloroplastos. Las ATPasas tipo V producen gradientes de protones a travs de diversas membranas intracelulares. Los transportadores ABC acarrean diversos sustratos, entre ellos muchos frmacos, fuera de las clulas, utilizando ATP como fuente de energa. Los ionforos son molculas liposolubles que unen iones especficos y los transportan pasivamente a travs de las membranas, disipando la energa de gradientes inicos electroqumicos. El agua se transporta, a travs de las membranas mediante acuaporinas. Los canales inicos proporcionan poros hidroflicos a travs de los cuales pueden difundir iones seleccionados, a favor de sus gradientes elctricos o de concentracin qumica. Tienen como caracterstica su insaturabilidad as como niveles de flujo muy elevados. Muchos canales inicos son sumamente especficos para un ion y la mayora presentan un mecanismo de compuerta regulada por voltaje o por ligando. En los canales de K + bacterianos, un filtro de selectividad proporciona ligandos que tienen la geometra correcta para poder reemplazar el agua de hidratacin de un ion K + cuando cruza la membrana. Algunos canales de K + estn regulados por voltaje. El receptor/canal de acetilcolina est regulado por la acetcolina, la cual desencadena cambios de conformacin sutiles que abren y cierran el paso transmembrana.