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Anlise histomorfomtrica do reparo sseo em tbias de ratos castrados submetidos ao efeito do alendronato sdico
Histomorphometric analysis of bone repair in tibias of castrated rats submitted to the effects of sodium alendronate
Pedro VICENTE NETO1 Camila Aparecida PECCARO1 Eleny Zanella BALDUCCI2

RESUMO
Objetivo: Avaliar por meio da anlise histomorfomtrica o efeito do alendronato sdico, utilizado para tratamento da osteoporose, na reparao ssea em defeitos previamente confeccionados em tbias direitas de ratos submetidos castrao. Mtodos: Os ratos tratados receberam, uma vez por semana, injeo subcutnea de alendronato sdico diludo em soluo salina na dose de 0,7mg/kg e os controles, a mesma dose de salina. Aos 16, 30 e 44 dias aps a aplicao da primeira dose do alendronato sdico, os animais foram sacrificados, as tbias direitas removidas e processadas para anlise histomorfomtrica. A densidade volumtrica foi estimada por um mtodo de contagem diferencial de pontos, em imagens histolgicas analisadas ao microscpio munido de uma ocular (10X) contendo um retculo com 25 pontos equidistantes totalizando 100 pontos para cada animal analisado. Resultados: A anlise demonstrou que a administrao do alendronato sdico, em ratos castrados, estimulou a formao de tecido sseo, em todos os perodos observados, sendo mais significante, nos perodos de 16 e 30 dias. Concluso: O alendronato sdico interferiu na homeostasia mineral, favorecendo o reparo sseo. Termos de indexao: Alendronato. Ratos. Regenerao ssea.

ABSTRACT
Objective: This study used histomorphometric analysis to investigate the effect of sodium alendronate, used for the treatment of osteoporosis, on the repair of surgically-induced bone defects in the tibia of castrated rats. Methods: The castrated animals were given subcutaneous injections of sodium alendronate (0.7mg/Kg) diluted in saline once a week; the control animals were given the same dose of saline. At 16, 30 and 44 days after the first injection of sodium alendronate, the animals were sacrificed and the right tibias were removed and processed for histomorphometric analysis. The volumetric bone mineral density was estimated by a reticular grid (25 points) attached to a light microscope. The number of points on the bone tissue was counted in the histological sections, totaling 100 points/animal. Results: The results revealed that sodium alendronate stimulated bone formation in castrated rats in all occasions, mainly at 16 and 30 days. Conclusion: Sodium alendronate affects mineral homeostasis, promoting bone repair. Indexing terms: Alendronate. Bone regeneration. Rats.

INTRODUO
O osso um tecido metabolicamente ativo que est em constante renovao, o qual mantm a sua integridade estrutural e homeostasia mineral1-3 dependentes do equilbrio entre os processos de deposio e de reabsoro. A perda deste equilbrio altera a matriz e a mineralizao ssea4. Apesar de sofrer a influncia da dieta, dos estmulos fsicos e de fatores genticos, o controle do metabolismo sseo feito por hormnios, fatores de crescimento, citocinas e pela comunicao celular3-4. O Paratormnio (PTH), a Calcitonina

(CT) e a vitamina D so os principais reguladores da homeostasia mineral5, enquanto o estrgeno, os andrgenos, a tiroxina e a triiodotironina influenciam o metabolismo sseo, controlando, de forma diferenciada, a reabsoro e a aposio ssea2-4. Ao longo da vida vo sendo acumulados desequilbrios entre os dois processos metablicos, principalmente em funo da manuteno da calcemia. Havendo acelerao do processo catablico, a perda de osso acaba por se instalar, principalmente se fatores inibidores da aposio ssea, como os inerentes a senescncia (sntese proteica deficiente, dficit hormonal, absoro deficiente de nutrientes, etc.), estejam associados. A indubitvel consequncia disso a osteoporose2-4,6.

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Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho, Faculdade de Odontologia. Araraquara, SP , Brasil. Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho, Faculdade de Odontologia, Departamento de Morfologia. Rua Humait, 1680, 14801-903, Araraquara, SP , Brasil. Correspondncia para / Correspondence to: EB ROSLINDO. E-mail: <eleny@foar.unesp.br>.

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A preocupao com a osteoporose, durante muitos anos, estava voltada principalmente para o sexo feminino, relacionando-a com as alteraes hormonais causadas pela menopausa. Ultimamente, esta preocupao passou a abranger todas as populaes, no deixando mais a doena no sexo masculino em segundo plano, refletindo-se o grau de importncia que esta doena vem adquirindo em termos de sade pblica7. A presena de receptores para os andrgenos nos osteoblastos e ostecitos8-9 e a comprovada converso da testosterona em diidrotestosterona no osso, aponta para a participao direta dos esterides sexuais masculinos, no metabolismo do tecido sseo9-10. Mas parece que o principal mecanismo pelo qual a testosterona atua no osso mediado por sua transformao em estrgeno, pela ao de uma aromatase11-12. Os osteoblastos possuem uma srie de enzimas, tais como a 20-alfa-hidroxiesteride desidrogenase (HSD), 7-alfa-hidroxilase e 17-beta-HSD, que metabolizam os andrgenos e regulam a responsividade do osso ao deles13. Os andrgenos inibem a diferenciao dos osteoclastos, estimulam a aposio e a mineralizao da matriz ssea por promover a proliferao e diferenciao dos osteoblastos11,14 e controlam a sntese de vrias citocinas com ao parcrina e autcrina no osso, tais como as interleucinas (IL-6), fatores de crescimento semelhantes insulina (IGFs), e prostaglandina (PGE2). Semelhante ao que ocorre na mulher, a perda da funo endcrina dos testculos tambm resulta em desequilbrio entre os processos anablico e catablico e no desenvolvimento de osteoporose no homem9-10. O principal efeito biolgico do alendronato sdico representado pela inibio da reabsoro ssea, tal mecanismo no ainda bem conhecido, porm acredita-se que o alendronato liga-se fortemente aos cristais de fosfato de clcio, inibindo assim, a formao, a agregao e a dissoluo dos cristais, no apresentando o efeito indesejvel de inibir tambm a mineralizao do osso normal, ou ainda, que o alendronato agiria como inibidor da reabsoro ssea atravs de uma ligao direta sobre a gerao e/ou sobre a atividade dos osteoclastos15. Portanto, o alendronato melhora a rigidez do osso atravs de sua ligao com os cristais de hidroxiapatita. Ao mesmo tempo capaz de interromper a atividade aumentada dos osteoclastos, diminuindo, assim, a reabsoro ssea15. Atualmente, a preocupao com a osteoporose est relacionada no s ao sexo feminino, mas tambm ao masculino, devido s alteraes hormonais causadas com o decorrer da idade, refletindo o grau de importncia que esta patologia vem adquirindo em termos de sade pblica7. O objetivo do presente trabalho foi avaliar por meio da anlise histomorfomtrica o efeito do alendronato sdico, medicamento utilizado para tratamento da osteoporose na reparao ssea em tbias de ratos submetidos castrao, trinta dias antes do incio do experimento.

MTODOS
Foram utilizados 30 ratos (Rattus norvegicus albinus, Holtzman) provenientes do Biotrio Central da Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho (Unesp) de Araraquara, com peso corporal em torno de 220g, os quais foram alimentados com rao granulada e gua ad-libitum e mantidos em gaiola individual e ambiente climatizado. Este trabalho, processo 06/05, foi aprovado pelo Comit de tica Experimental em Animal da Faculdade de Odontologia da Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho. Para os procedimentos cirrgicos os animais foram anestesiados injeo intramuscular de Ketamina 10% e Cloridrato de Xilazina 2% - Vibac do Brasil na dosagem de 0,08 ml e 0,04 ml por 100g de peso corporal, respectivamente. Procedimentos cirrgicos Com o animal anestesiado efetuou-se a tricotomia e a assepsia da bolsa escrotal e em seguida realizou-se a cirurgia de castrao. Aps 30 dias, os animais foram novamente anestesiados para serem submetidos cirurgia de defeito sseo na tbia direita. Efetuada a tricotomia e assepsia com lcool 70% na superfcie da tbia, com o uso de um bisturi contendo lmina n0 11 esterilizada, fez-se uma inciso em torno de 1 cm de extenso para possibilitar o deslocamento do retalho e exposio do osso. Com broca esfrica Carbide n.1/2 esterilizada e montada em micromotor, efetuou-se o defeito sseo de 5 mm de largura e 0,5 mm de profundidade, aproximadamente, mantendo sempre irrigao com soro fisiolgico Em seguida, os retalhos foram reposicionados e as bordas da ferida suturada com fio de Vicryl (Poligalactina 910, Johnson & Johnsons, New Brunswick, EUA). Os animais foram divididos em dois grupos, controle (GC) e tratado (GT) e foram subdivididos em trs grupos de acordo com os perodos de observao (16, 30 e 44 dias). Os animais do grupo-tratado receberam at 6 semanas alendronato sdico na dose de 0,7 mg/kg dissolvido em soluo salina e administrado uma vez por semana por via subcutnea. Os animais do grupo-controle passaram pelos mesmos procedimentos do grupo-tratado recebendo somente soluo salina. Decorridos os perodos de 16, 30 e 44 dias aps a aplicao da primeira dose do alendronato sdico, os animais foram sacrificados e a tbia direita removida, fixada em formalina 10% durante 48 horas e na sequncia foi descalcificada em soluo de citrato de sdio e cido frmico, em partes iguais16, e processada para incluso em parafina. Os cortes obtidos foram corados com HE para anlise histolgica e morfomtrica. A anlise de quantidade de tecido sseo neoformado foi realizada por planimetria. Para a contagem de pontos utilizou-se um sistema padro composto com um retculo de 25 pontos, resultante das interseces entre as linhas horizontais e verticais, o qual foi sobreposto imagem histolgica observada em um aumento de 400X.

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Alendronato sdico no reparo sseo

A quantidade de tecido sseo neoformado, em porcentagem de rea, foi obtida pela razo entre os nmeros de pontos incidentes no tecido e o nmero total de pontos no retculo. Para a anlise histomorfomtrica os dados foram submetidos anlise de varincia (ANOVA) e em seguida, ao Teste de Tukey (p 0,05). Para a anlise histolgica dos resultados, observou-se a presena de exsudato, clulas inflamatrias e clsticas, e, neoformao tanto de fibras colgenas quanto de tecido sseo. Como protocolo para dor aps os atos cirrgicos, foi administrado durante trs dias, cido acetil saliclico na dose de 120-300 mg/kg por via oral17.

e o tratado, 88,2%, resultando em uma diferena de 10,2%. Observa-se tambm que aos 44 dias tanto o grupo-controle quanto o tratado, no apresentaram aumento significante na densidade ssea, pois o controle mostrou 90,2% e o tratado, 93,8% de tecido sseo neoformado, resultando em uma diferena de apenas 3,6%.

RESULTADOS
Anlise histolgica No grupo-controle, aos 16 dias o defeito sseo encontrou-se parcialmente preenchido por trabculas sseas imaturas, com muitos ostecitos, distribudas por toda extenso do defeito sseo e amplos espaos vazios (Figura 1). Aos 30 dias, o tecido sseo mostrou trabculas espessas e maturas, apesar de ainda apresentar algumas reas de osso imaturo (Figura 3). A proliferao angioblstica foi intensa. Aos 44 dias o defeito sseo est preenchido em toda a extenso por tecido sseo maturo e os espaos vazios aparecem como falhas do tecido. No grupo-tratado aos 16 dias, verificou-se a presena de trabculas sseas volumosas, imaturas, com linhas reversas basfilas, alm de intensa proliferao vascular distribuda por toda a extenso do defeito e raros espaos vazios (Figura 2). Aos 30 dias, o tecido sseo formado apresentou-se com grau de maturao mais avanado quando comparado com o perodo anterior e ao controle (Figura 4). Aos 44 dias, o defeito sseo est preenchido por tecido sseo maturo em toda sua extenso e os espaos vazios aparecem como pequenas falhas sseas semelhantes ao grupo-controle (Figura 5). Anlise histomorfomtrica Os resultados estatsticos permitiram comparar a progressiva formao ssea nos grupos de animais controle e tratado, nos perodos observados, aps a realizao do defeito sseo e a administrao do alendronato sdico 0,7 mg/kg. A anlise estatstica da densidade de volume de tecido sseo (%) com nvel de significncia p 0,05, nos grupos controle e tratado nos perodos de 16, 30 e 44 dias demonstrou variao na formao de tecido sseo. A anlise comparativa entre os grupos-controle e tratado de cada perodo demonstra uma diferena significante de densidade dos dados volumtricos (Figura 6). O grupocontrole aos 16 dias, mostrou uma densidade ssea de 72,6%, e o tratado, 85,2%, ou seja, uma diferena de 12,6%. Aos 30 dias o grupo-controle apresentou uma densidade ssea de 78,0%,

Figura 1. Grupo-controle 16 dias - defeito sseo parcialmente preenchido por trabculas sseas imaturas e amplos espaos. HE. 125x.

Figura 2. Grupo-tratado 16 dias - tecido sseo imaturo, com muitos ostecitos e presena de linhas reversas basfilas. HE. 125x.

Figura 3. Grupo-controle 30 dias - tecido sseo mostrando trabculas sseas espessas, maturas e proliferao angioblstica. HE. 125x.

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DISCUSSO
Esto disponveis no mercado, vrias substncias para o tratamento da osteoporose, porm a grande maioria apresenta efeitos colaterais indesejveis. Os bisfosfanatos, por exemplo, so muito usados pelos profissionais de sade, por apresentarem menores efeitos colaterais para o tratamento desta patologia15. Neste trabalho, estudou-se a reparao ssea em tbias de ratos machos castrados com osteoporose, tratados com alendronato sdico na dose de 0,7mg/Kg, uma vez por semana, at seis semanas e sacrificados nos perodos de 16, 30 e 44 dias. Verificou-se formao ssea nestes animais, corroborando os achados de Salgado18 que estudou ratos machos castrados ou no e tratados com risedronato durante um ms na dose de 0,1mg/Kg/dia, e verificou que houve maior reparao ssea nos machos castrados. Estes resultados so concordantes com os de Piai et al.7 que utilizou a mesma dosagem durante cinco dias consecutivos em ratos machos e fmeas castrados e observou que houve maior neoformao ssea nos machos em comparao com as fmeas. Silva19, avaliando a ao de diferentes doses de alendronato sdico (0,25, 0,5 e 0,75mg/Kg/dia) na reparao ssea de tbia de ratas ovarectomizadas, observou que os melhores resultados foram obtidos com a dosagem de 0,5mg/ Kg. Assim, este mesmo autor pode concluir que a ao dos bisfosfonatos dose-dependente. De acordo com os resultados desta pesquisa, o alendronato sdico estimulou a reparao ssea, contrariando os achados de Fayad20 que estudou alm do alendronato, o clodronato em ratos machos, no obtendo resultados efetivos no processo de reparao ssea, talvez por ter usado a dose de 0,1mg/Kg /por dia e por um curto perodo. Na anlise estatstica desta pesquisa, foi demonstrada uma crescente porcentagem de rea ssea neoformada no decorrer dos perodos analisados. Observou-se um significante aumento de densidade ssea entre os gruposcontrole e tratado, sendo esta diferena de 12,6% aos 16 dias e, uma diferena de 10,2% aos 30 dias. J aos 44 dias, diferena de 3,6%, no foi significante, confirmando que a queda de testosterona no representou danos relevantes a neoformao ssea em longo prazo. Estes resultados corroboram com as observaes de Borelli21 e com Anderson22 que relacionaram a existncia de fatores de diversas origens interagindo na osteoporose senil masculina, como o fumo, uso abusivo de lcool, terapia com corticosterides, sedentarismo, aliados observao de que apenas um nmero reduzido de homens desenvolve osteoporose associada ao hipogonadismo.

Figura 4. Grupo-tratado 30 dias - tecido sseo com grau de maturao mais avanado que no perodo anterior e rica vascularizao. HE. 125x.

Figura 5. Grupo-tratado 44 dias - tecido sseo maturo mostra espaos vazios como pequenas falhas. 125x.

Figura 6. Densidade de volume de tecido sseo (%).

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Alendronato sdico no reparo sseo

A anlise histolgica mostrou no grupo-controle aos 16 dias, que o defeito sseo estava preenchido por trabculas sseas imaturas com muitos ostecitos e entre elas amplos espaos vazios. Aos 30 dias, a osteognese apresentou-se imatura em algumas regies com intensa proliferao angioblstica. Aos 44 dias, o tecido sseo maturo preenchia toda a extenso do defeito e os pequenos espaos vazios pareciam como falhas do tecido, corroborando com os achados de Piai et al.7 e Salgado18. No grupo-tratado, aos 16 dias ocorreu no tecido sseo neoformado imaturo, intensa proliferao vascular, enquanto aos 30 dias o defeito sseo apresentou-se parcialmente preenchido por tecido sseo maturo e aos 44 dias, toda a extenso do defeito estava ocupado por tecido sseo maturo e os espaos vazios caracterizavam pequenas falhas sseas. Estes resultados esto de acordo com os achados de Piai et al.7 e Salgado18 em ratos castrados e Silva19 em ratas ovariectomizadas, nos quais o Alendronato Sdico estimulou a formao de tecido sseo. Os resultados mostram que o efeito biolgico do medicamento inibiu a reabsoro ssea, interrompendo a atividade aumentada dos osteoclastos22 e melhorando a rigidez do osso devido sua ligao com os cristais de hidroxiapatita.

CONCLUSO
Com os resultados obtidos pode-se concluir que a administrao do alendronato sdico interferiu na homeostasia mineral, favorecendo a formao ssea.

Agradecimentos
Aos tcnicos do Departamento de Morfologia Pedro Srgio Simes e Luis Antonio Potenza, pelo auxlio nas fases laboratoriais de nossa pesquisa.

Colaboradores
P VICENTE NETO e CA PRECCARO executaram os procedimentos cirrgicos: castrao e preparo do defeito sseo nas tbias dos ratos, administrao do medicamento e os procedimentos laboratoriais: preparao do fixador e do descalcificador, identificao das lminas e colorao dos cortes obtidos pela microtomia (realizada pelos Tcnicos). EZ BALDUCCI executou o trabalho, metodologia e orientao.

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