Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi
DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1 1
PRINSIP TEKNOLOGI PRINSIP TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN DNA REKOMBINAN DEBBIE S. RETNONINGRUM SEKOLAH FARMASI INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2 2 PUSTAKA PUSTAKA 1. Glick, BR and J J Pasternak, 2003, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA,hal. 47-89 dan 101-110 2. Groves MJ , 2006, Pharmaceutical Biotechnology, hal. 44-55 3. Brown TA, 2006, Gene Cloning & DNA analysis, hal. 3-6 dan 8-12; 54-80 dan 87-97 Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 3 3 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Rekombinasi antara molekul DNA dari organisme berbeda: fenomena umum di alam. Corynebacterium diphtheriae yang diinfeksi oleh virus menghasilkan toksin yang bertanggung jawab terhadap gejala difteri. Perubahan genetik dalam bakteri ini disebabkan oleh virus dan merupakan suatu rekayasa genetik dalam alam. Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 4 4 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Duplikasi fenomena alamdi laboratorium Mengembangkan metode introduksi berbagai informasi genetik ke dalam suatu organisme. Manipulasi genetik E. coli dan Bacillus subtilis (bakteri) Saccharomyces cerevisiae (ragi) Produksi bahan mahal atau tidak mungkin dibuat secara tradisional. Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 5 5 CONTOH PRODUK REKOMBINAN CONTOH PRODUK REKOMBINAN ANTIBODI REKOMBINAN PROTEIN TERAPEUTIK: insulin, interferon, albumin serum manusia, hormon pertumbuhan manusia, aktivator plasminogen jaringan, antithrombin, faktor pembekuan darah, limfokin, faktor nekrosis tumor, dismutase superoksida, dan gonadotropin manusia VAKSIN: hepatitis B, herpes, influenza, malaria VAKSIN DNA TERAPI GEN Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 6 6 CONTOH PRODUK REKOMBINAN CONTOH PRODUK REKOMBINAN PRODUK PERTANIAN: tanaman tahan penyakit, resistensi pestisida, bioinsektisida, fiksasi nitrogen PRODUK BIOREMEDIASI: pengurai lemak/minyak, penghilangan herbisida, pendegradasi pestisida Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 7 7 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN) TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN) PENYEDIAAN DNA: SISIPAN DAN VEKTOR (Ex: PLASMID) LIGASI: PENGGABUNGAN DNA SISIPAN DAN VEKTOR (= VEKTOR REKOMBINAN) TRANSFORMASI: TRANSFER INFO GENETIK KE SEL INANG & PERBANYAKAN DNA SELEKSI: SEL YG MENGANDUNG PLASMID/ VEKTOR REKOMBINAN DETEKSI: KEBERADAAN DNA SISIPAN, KEBENARAN DNA SISIPAN (UKURAN DAN URUTAN NUKLEOTIDA) 1972 Stanley Cohen dan Herbert Boyer Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 8 8 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN) TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN) DNA kromosom Potong dengan enzim restriksi DNA plasmid ligasi DNA rekombinan transformasi sel transforman 1 sel tumbuh jadi 1 koloni klon Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 9 9 Kloning Kloning DNA DNA ke ke Plasmid Plasmid Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 10 10 SUMBER DNA SISIPAN SUMBER DNA SISIPAN TIGA PENDEKATAN: KEPUSTAKAAN DNA (DNA LIBRARY): DNA GENOMIK PRODUK PCR mRNA cDNA (eukariot) Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 11 11 Kepustakaan genomik Kepustakaan genomik (genomic library) (genomic library) Koleksi klon yang jumlahnya cukup mencakup semua gen dari suatu organisme Contoh ukuran genom: Bacillus anthracis: 5,1 5,2 Megabasa Escherichia coli: 4 Megabasa Pseudomonas putida: 6,0 6,1 Megabasa Staphylococcus aureus: 2,9 Megabasa Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 12 12 KROMOSOM KROMOSOM vs vs PLASMID PLASMID Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 13 13 PLASMID PLASMID DNA UNTAI GANDA BERBENTUK LINGKARAN BERSALINAN TINGGI BERUKURAN KECIL (MUDAH DIMANIPULASI) DAPAT BEREPLIKASI SENDIRI DI DALAM SEL DAPAT DISISIPI DNA ASING (DNA SISIPAN) ADA DUA GEN MARKER: UNTUK MENDETEKSI ADANYA VEKTOR UNTUK MENDETEKSI ADANYA DNA SISIPAN Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 14 14 VEKTOR (Plasmid) VEKTOR (Plasmid) VEKTOR KLONING HANYA UNTUK MENDAPATKAN DNA VEKTOR EKSPRESI UNTUK MENDAPATKAN PROTEIN (tambahan komponen untuk mempermudah proses downstream/pemurnian) Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 15 15 Beberapa contoh vektor kloning Beberapa contoh vektor kloning Nama Tipe Sel inang Keterangan pBR322 Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, tetrasiklin. Vektor untuk tujuan umum pUC8 Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, skrining lac. Vektor untuk tujuan umum pBluescript Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, skrining lac. gt10 Bakteriofaga E. coli Kloning cDNA YEp24 Plasmid E. coli/ragi Resistensi ampisilin. Vektor ragi shuttle Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 16 16 PETA PLASMID PETA PLASMID Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 17 17 ENZIM RESTRIKSI ENZIM RESTRIKSI MEMBATASI PERTUMBUHAN VIRUS PADA INFEKSI VIRUS PADA BAKTERI TIPE II: DIGUNAKAN PADA DNA REKOMBINAN MEMOTONG IKATAN FOSFODIESTERASE MENGENALI URUTAN PALINDROM 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 18 18 DNA (ligase) 5- NNNG OH P AATTCNNN -3 3- NNNCTTAA P OH GNNN -5 ligase 5- NNNGAATTCNNN -3 3- NNNCTTAAGNNN -5 ENZIM RESTRIKSI & LIGASE ENZIM RESTRIKSI & LIGASE DNA (enzim restriksi) 5- NNNGAATTCNNN -3 3- NNNCTTAAGNNN -5 EcoRI 5- NNNG OH P AATTCNNN -3 3- NNNCTTAA P OH GNNN -5 Sisi pengenalan enzimrestriksi Urutan nukleotida rantai atas = Urutan nukleotida rantai bawah Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 19 19 CONTOH CONTOH ENZIM RESTRIKSI ENZIM RESTRIKSI EcoRI (Escherichia coli galur R): GAATTC (ujung lancip) BamHI (Bacillus amyloliquefaciens): GGATCC (ujung lancip) BglII (Bacillus globigii): AGATCT (ujung lancip) SalI (Streptomyces albus): GTCGAC (ujung lancip) PstI (Providencia stuartii 164): CTGCAG (ujung lancip) HindIII (Haemophilus influenzae): AAGCTT (ujung lancip) KpnI (Klebsiella pneumonia): GGTACC (ujung lancip) XbaI (Xanthomonas bradii): TCTAGA (ujung lancip) HaeIII (Hemophilus aegyptius): GGCC (ujung tumpul) Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 20 20 Kloning Kloning Produk Produk PCR PCR PCR S. pyogenes M12 Gen ska Ligasi pGEMT rekombinan SDM Transformasi pGEMT/ska E. coli XL-Blue Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 21 21 LIGASI PRODUK PCR KE LIGASI PRODUK PCR KE pGEM pGEM - - T T Gen ska A A pGEM-T + pGEM-T REKOMBINAN ligasi Transformasi E. coli J M109 E. coli pGEM-T REK Kontrol + Kontrol LB/Amp LB/Amp/X-Gal/IPTG LB/Amp Streptococcus pyogenes Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 22 22 Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 23 23 Transformasi Transformasi info genetik ditransfer ke sel inang dengan metode transformasi Sel inang dibuat kompeten (siap menerima DNA asing) modifikasi struktur dinding sel Metode transformasi : heat shock/elektroporasi Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 24 24 Transformasi Sel kompeten Seleksi Biru-Putih Seleksi Seleksi Transforman Transforman Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 25 25 SELEKSI BIRU PUTIH SELEKSI BIRU PUTIH MENGETAHUI APAKAH DNA SISIPAN SUDAH ADA? PADA MCS TERDAPAT GEN lacZ (MENGKODE GALAKTOSIDASE) X-GAL BIRU DNA SISIPAN AKAN MERUSAK GEN lacZ GALAKTOSIDASE TIDAK DIPRODUKSI X-GAL TIDAK DIURAIKAN PUTIH Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 26 26 Deteksi Deteksi keberadaan keberadaan DNA DNA sisipan sisipan Analisis migrasi Analisis restriksi Elektroforesis gel PCR Penentuan urutan DNA sisipan (sekuensing) Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 27 27 ELEKTROFORESIS ELEKTROFORESIS GEL GEL Gel agarosa atau poliakrilamid DNA bermuatan negatif (ada gugus fosfat): bergerak dari kutub negatif ke kutub positif DNA bermigrasi tergantung dari ukurannya: migrasi DNA ukuran kecil > ukuran besar Visualisasi: etidium bromida / Syber Green (DNA berfluorosensi dengan pemaparan UV) Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 28 28 Elektroforesis Elektroforesis G G el el Agarosa Agarosa Joe Sambrook dan Bill Sugden: elektroforesis gel agarose untuk DNA Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 29 29 KONFIRMASI KONFIRMASI pGEM pGEM - - T REKOMBINAN T REKOMBINAN Isolasi pGEM-T/ska (kit Qiaprep, Qiagene) 1 = pGEM-T rekombinan 2 = pGEM-T tanpa DNA sisipan 1 2 Ukuran plasmid tanpa DNA sisipan < ukuran plasmid dengan DNA sisipan Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 30 30 1419 pb 517 pb Isolasi Plasmid Rekombinan 1 2 3 Koloni Putih Koloni Biru Elektrogram hasil isolasi plasmid koloni biru dan putih : 1. Koloni biru 2. Koloni putih 3. Koloni biru Koloni Biru pGEM-T (3000 bp) 881 pb DNA sisipan 1 2 Elektrogram hasil restriksi Nde/BamHI 1. Marka pUC19/HinfI 2. Hasil Pemotongan NdeI/BamHI Analisis Restriksi pGEM-T rekombinan KONFIRMASI KONFIRMASI pGEM pGEM - - T REKOMBINAN T REKOMBINAN Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 31 31 HASIL HASIL PENENTUAN URUTAN NUKLEOTIDA PENENTUAN URUTAN NUKLEOTIDA DNA SISIPAN DNA SISIPAN (DNA Sequencing) (DNA Sequencing) Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 32 32 HASIL SEKUENSING HASIL SEKUENSING Bandingkan urutan hasil sekuensing dg urutan DNA sisipan asal (Analisis homologi/kesamaan program BLAST dari NCBI)