L.

p 1
METODELE DE STERILIZARE n majoritatea cazurilor, o prim condiie pe care trebuie s o ndeplineasc materialele folosite pentru examinarea, cultivarea i pstrarea n laborator a diferitelor microorganisme este sterilitatea. Operaiunea prin care este asigurat aceast condiie se numete sterilizare. Ea const n distrugerea sau ndeprtarea microorganismelor dintr-un spaiu sau de pe o suprafa dat. Sterilizarea se efectueaz cu ajutorul agenilor fizici, mecanici i chimici. STERILIZAREA PRIN AGENI FIZICI I. STERILIZAREA PRIN CLDUR Cldura sub form uscat i umed reprezint unul din cei mai importani ageni de sterilizare. Microorganismele n stare vegetativ sunt omorte n 10 minute la temperaturi de 50-60 0 C cldur umed i 6o-80 0 C cldur uscat, iar sporii bacterieni , dup 20 de minute la temperaturi cuprinse ntre 100-120 0 C cldur umed si 140-180 0 C cldur uscat. 0 C 1. Sterilizarea prin cldur uscat Cldura uscat omoar prin accelerarea reaciilor de oxidoreducere celular, asfixie, coagularea proteinelor sau carbonizare (Boldizar E.i colab.,2002). Microorgaismele n stare vegetativ sunt omorte de cldura uscat n aproximativ 10 minute la 60-800 C. Metodele de sterilizare cu ajutorul cldurii uscate sunt: flambarea, nclzirea la rou, sterilizarea cu aer supranclzit i incinerarea. 1.1 Flambarea - este cea mai simpl metod de sterilizare, ce const n trecerea repetat prin flacra becului de gaz, la intervale scurte (3-4 secunde), a obiectului de sterilizat. Flambarea se folosete n mod curent pentru sterilizarea suprafeei lamelor de sticl, a suprafeei pipetelor Pasteur, a gurii eprubetelor, flacoanelor i altor recipiente din sticl n care urmeaz s se efectueze nsmnri sau din care se recolteaz material microbian. Se mai pot steriliza prin flambare suprafeele faianate sau din inox, grilajul metalic al cutilor pentru animale etc. 1.2 nclzirea la rou - const n inerea unui obiect metalic n flacr, pn la nroirea acestuia. Aceast metod este folosit pentru sterilizarea firului metalic al ansei de nsmnare, i a spatulei de cauterizat suprafaa organelor. 1.3. Sterilizarea cu aer supranclzit n acest scop se folosesc etuvele - cuptoare metalice variate ca modele i denumiri (cuptor Pasteur,etuv, sterilizator Poupinel, cuptor Arnold), nclzite electric.(fig. 1). Prin aceast metod se sterilizeaz sticlria de laborator (plcile Petri, pipetele gradate, eava fuzibil din care se confecioneaz pipetele Pasteur etc.), mojarele i alte obiecte din porelan, aparatele de filtrat, instrumentarul metalic fr suduri n cositor. Obiectele din sticl i porelan destinate sterilizrii se spal, se usuc i se nvelesc n hrtie alb de mpachetat iar instrumentarul se introduce n casolete nchise. n prealabil, eprubetele se inchid cu dop de vat nvelit n tifon sau cu capac metallic, pipetele gradate se oblitereaz cu vat la extremitatea prin care se aspir iar eava fuzibil, la ambele capete. Materialele astfel pregtite se aeaz pe

rafturile etuvei, lsnd spaii ntre ele pentru ca aerul cald s poat circula i s asigure temperatura de

Fig.1 Etuva de sterilizare cu aer supranclzit sterilizare n toat incinta. Sterilizarea prin etuvare se realizeaz de obicei la parametrii de 180 0 C , timp de 30 de minute . Culoarea brun i friabilitatea crescut a hrtiei constituie indicii c sterilizarea a fost bine fcut. 1.4. Incinerarea se efectueaz n cuptoare speciale sau crematorii, avnd drept scop distrugerea cadavrelor, produselor organice contaminate (excreii, secreii), materialelor de unic folosin dup utilizare (seringi, mnui, pansamente etc.). Toate cele patru metode de sterilizare prin cldur uscat asigur o sterilizare complet, n sensul c distrug att microorganismele vegetative ct i cele sub form de spori. 2. Sterilizarea prin cldur umed Cldura umed este mai eficient dect cldura uscat deoarece este mai penetrant. 2.1 Sterilizarea prin fierbere Sterilizarea prin fierbere se realizeaz n sterilizatoare electrice sau nclzite cu bec de gaz, timp de 30 de minute din momentul n care apa atinge 100 0 C i d n clocot. Prin fierbere se sterilizeaz de regul instrumentarul chirurgical, seringile i acelor de inoculare. Pentru protejarea instrumentelor metalice de aciunea nociv a srurilor din apa de robinet se recomand fierberea n ap distilat, la care se poate aduga borax pentru a mpiedica ruginirea. Adugarea boraxului sau a carbonatului de sodiu 2-3% ridic totodat punctul de fierbere al apei la 104 0 C. Fierberea reprezint o metod de sterilizare incomplet , deoarece nu asigur distrugerea tuturor sporilor bacterieni. Pe acest considerent, obiectele sterilizate prin fierbere pot fi utilizate numai n primele 24 ore de la ncheierea operaiunii. Folosirea dup acest interval , presupune repetarea fierberii. 2.2. Sterilizarea cu vapori de ap sub presiune (autoclavarea) este cea mai eficient metod de sterilizare. Aparatul necesar pentru aceast metod, capabil s reziste la o presiune de cel puin 3 atmosfere, se numete autoclav i are urmtoarele pri componente, indiferent de detaliile constructive (fig.2): - cazanul metalic cu perei dubli (peretele extern este gros, iar cel intern mai subire i prevzut cu orificii la partea superioar) ntre care se introduce ap distilat prin plnia de umplere; - un capac metalic masiv cu garnitur de cauciuc, care asigur nchiderea ermetic prin nurubarea unor buloane; - tubul de nivel confecionat din sticl, care funcioneaz pe principiul vaselor comunicante, indicnd nivelul apei din autoclav ; - robinetul de evacuare a aerului la nceputul autoclavrii i a vaporilor, la terminarea ei; - robinet de evacuare a apei din autoclav;

- manometru pentru msurarea presiunii din cazan; - supapa de siguran care se deschide cnd presiunea vaporilor depete limita de siguran; - sursa de cldur (arztor de gaz sau rezistene electrice)

A B C Fig. 2 Autoclav clasic: A (schem) i B; Autoclav modern cu programare digital (C).

Legenda schemei: 1-capac, 2- buloane; 3-plnie de umplere; 4-corpul autoclavului; 5-orificii; 6-tubul de nivel; 7manometru; 8-supapa de siguran; 9-robinet de evacuare vapori;10-robinet de evacuare ap;11-sursa de nclzire;12-suport;13 I 14-materiale de sterilizat.

Autoclavele nu sunt prevzute cu termometru deoarece temperatura aburului din cazan se coreleaz cu presiunea, aa nct n funcie de presiunea stabilit, exist trei programe uzuale de autoclavare (Tabel 1). Tabel 1 Programe de autoclavare Temperatura (0 C) Timpul de sterilizare(min) 115 121 134 90 30 10

Nr. progra m 1 2 3

Presiunea(atm) 0,5 1 2

n mod obinuit, autoclavarea se realizeaz folosind programul numrul 2. Prin autoclavare se sterilizeaz toate materialele care nu sunt afectate de temperatur, presiune sau umiditate. n laboratoarele de microbiologie se autoclaveaz: majoritatea mediilor de cultur, serul fiziologic, aparatele din sticl cu garnituri din cauciuc, infectele din laborator (placile din sticl i eprubetele ce conin culturi microbiene vechi, pipetele Pasteur folosite i alte materiale contaminate nainte de refolosire sau distrugere). Obiectele de sterilizat se introduc n autoclav, aezate n containere cu pereii perforai sau n couri speciale din srm. Dopurile de vat ale recipientelor cu medii de cultur sau alte lichide de sterilizat, trebuie protejate prin acoperire cu hrtie legat cu sfoar pentru a evita ptrunderea vaporilor de ap sub presiune. Etapele autoclavrii: - se verific i, dac este cazul, se completeaz nivelul apei din cazan;

- se introduc containerele cu materialele de sterilizat i se nchide capacul; - se pune n funciune sursa de nclzire lsnd deschis robinetul de evacuare a aerului pn cnd vaporii din autoclav se elimin sub form de jet continuu; - se nchide robinetul i se urmrete acul manometrului, care indic creterea presiunii; - se regleaz intensitatea sursei de nclzire n aa fel nct presiunea i temperatura s se menin la parametrii corespunztori programului de autoclavare ales; - dup epuizarea timpului de sterilizare, se ntrerupe sursa de cldur, iar cnd indicatorul manometrului revine la poziia zero se deschide robinetul de evacuare a vaporilor (deschiderea robinetului nainte ca presiunea s ajung la zero determin reluarea brusc a fierberii lichidelor din recipiente, pe care risc s le sparg); - se deschide capacul iar materialele se scot dup uscare i rcire (mai ales flacoanele cu lichide care, n contact cu aerul rece, pot s explodeze). La autoclavele moderne temperatura i timpul de sterilizare pot fi programate electronic, facilitnd munca personalului din laboratoare. Periodic, se impune controlul eficienei procesului de sterilizare, care se realizeaz prin indicatori chimici la fiecare ciclu de sterilizare i indicatori biologici, pentru verificarea sptmnal. Indicatorii chimici sunt substane cu punctul de topire fix i apropiat de parametrii termici ai sterilizrii prin etuvare i autoclavare (tabelul 2). Tabelul 2 Indicatorii chimici pentru controlul sterilizrii INDICATORI PENTRU ETUV INDICATORI PENTRU AUTOCLAV Substana Punctul de topire Substana Punctul de topire chimic chimic Tiouree 180 0 C Floarea de sulf 115 0 C 0 Sulfametoxipiridazi 180-182 C 1,3,5-Tribromfenol 120 0 C n Acidul benzoic 121-122 0 C Fenacetina 134 0 C Aceste substane se introduc n tuburi de sticl, n amestec cu un colorant i se distribuie n incinta aparatelor, printre materialele de sterilizat. La terminarea operaiunii se verific tuburile, iar dac substana chimic s-a lichefiat nseamn c s-a atins temperatura respectiv. La ora actual, se gsesc n comer etichete de aplicat pe ambalaje, impregnate cu substane chimice care, prin virajul culorii, dau informaii asupra respectrii ambilor parametri: temperatura i timpul ct s-a meninut temperatura de sterilizare. Ca indicator biologic al sterilizrii prin autoclavare se folosete o suspensie de spori de Bacillus stearothermophilus (specia cu cel mai rezistent spor la cldura umed) n fiole cu medii de cultur i o substan de culoare violet. Dup sterilizare, fiolele se incubeaz la 37 C, 24 de ore, mpreun cu o fiol martor, care nu a fost supus sterilizrii. Absena cultivrii i meninerea culorii violet n fiolele sterilizate certific distrugerea sporilor. Virarea culorii n galben, asemntor martorului, denot faptul c operaia nu a fost corect executat. 2.3. Tindalizarea (sterilizarea prin nclzire fracionat) Aceast metod preconizat de Tyndall n 1877, se utilizeaz pentru sterilizarea unor produse biologice termolabile, care se denatureaz la 120: mediile de cultur cu glucide, mediile cu ou i alte substane proteice , serul coagulat etc. Tindalizarea se efectueaz n baia de ap sau n autoclav, dar fr a stnge capacul i lsnd deschis robinetul de evacuare a aburilor. Metoda asigur o sterilizare complet prin nclzirea produsului la temperaturi ntre 60 i 100C, timp de 30 de minute , repetnd aceast operaiune

de nc dou ori la intervale de 24 de ore. n intervalul dintre expuneri, produsele respective sunt meninute la 37 C sau la temperatura camerei La prima nclzire se distrug doar formele vegetative; sporii eventual prezeni, rezist. Umiditatea i condiiile termice optime permit germinarea sporilor pe parcursul celor 24 de ore, formele vegetative care rezult fiind distruse la al doua nclzire. nclzirea din a treia zi se face pentru a asigura sterilizarea, distrugnd forme vegetative rezultate din sporii care au supravieuit dup cel de-al doilea tratament termic. 2.4. Pasteurizarea este un procedeu conceput de Pasteur pentru distrugerea microbilor responsabili de degradarea vinurilor. Pasteurizarea const n nclzirea lichidelor la temperaturi ntre 55-95C, o singur dat, perioada de expunere termic fiind invers proporional cu temperatura. n funcie de parametrii utilizai, exist urmtoarele variante: 1. pasteurizarea joas: 60-65 C 30 minute; 2. pasteurizarea medie: 70-75 C 10-20 minute; 3. pasteurizarea nalt: 80-85 C cteva secunde. Metoda este larg folosit n industria laptelui , n vinificaie, n industria berii i a buturilor rcoritoare, viznd distrugerea microorganismelor patogene ce pot fi vehiculate prin aceste produse i prelungirea perioadei de conservare. Deoarece pasteurizarea este o metod de sterilizare incomplet, refrigerarea imediat la 4C este necesar pentru inhibarea multiplicrii bacteriilor care au rezistat expunerii termice i pentru evitarea germinrii sporilor. n comparaie cu autoclavarea, metoda prezint avantajul c nu modific calitile organoleptice ale alimentelor i nu depreciaz vitaminele i enzimele. Ultrapasteurizarea (uperizarea) const n nclzirea instantanee la 150 C a lichidului de sterilizat prin injectarea vaporilor de ap supranclzii. Este o meod de sterilizare complet care se aplic n principal laptelui, berii i sucurilor din fructe. Produsele sterilizate prin acest procedeu poart pe ambalaj inscripia UHT (Ultra High Temperature) i au o perioad de valabilitate nelimitat II. STERILIZAREA PRIN RADIAII 1. Sterilizarea prin radiaii ultraviolete Razele ultraviolete (U.V.) cu lungimi de und cuprinse ntre 2540-2800 A au un puternic efect microbicid datorat aciunii lor asupra acizilor nucleici. Sursele de radiaii UV sunt lumina solar i lmpile de UV, care genereaz radiaii cu lungimea de und de 2357 A n urma descrcrilor electrice ntre doi electrozi plasai n atmosfer de vapori de mercur. Un dezavantaj major al acestor radiaii este slaba lor penetrabilitate, motiv pentru care, lmpile cu vapori de mercur se folosesc doar pentru sterilizarea aerului i a suprafeelor (mese, obiecte, console) din slile de operaie, boxele de nsmnare, laboratoare. 2. Sterilizarea prin radiaii ionizante Radiaiile a cror lungime de und este situat sub 2.000 A au un efect bactericid foarte puternic, datorat puterii mari de penetrare.. Ele acioneaz prin ionizarea apei cu formare de radicali toxici hidroxil (OH -), care acioneaz asupra componentelor celulare, n special ADN, provocnd dereglarea funciile vitale ale microorganismelor i moarte. Principalele categorii de iradiaii ionizate sunt: radiaiile gamma; radiaiile alfa; beta, razele X, razele cosmice. La ora actual radiaiile ionizante, cum sunt cele emise de colaltul radioactiv (Co60)), sunt utilizate la scar industrial pentru sterilizarea obiectelor din material plastic de unic utilizare (serigi, sisteme de perfuzie, mnuI chirurgicale, plci Petri, pansamente etc.) i a unor medicamente degradabile prin cldur.

STERILIZAREA PRIN AGENI MECANICI FILTRAREA reprezint trecerea unui lichid sau gaz printr-un material poros. Este metoda de sterilizare a unor lichide degradabile prin cldur (medii de cultur, ser sanguin, soluii de antibiotice etc.) i de decontaminare a aerului. Filtrelor cu pori de 0,22 m rein majoritatea bacteriilor (cu excepia unor bacterii flexibile ca spirochtele sau micoplasmele) iar filtrele cu pori de 0,01 m sunt capabile s rein inclusiv virusurile mici, realiznd o sterilizare perfect. nafar de folosirea ei ca metod de sterilizare, filtrarea mai are i alte utilizri cum ar fi separarea toxinelor, enzimelor i a vitaminelor de microorganismele productoare, sau separarea virusurilor de substraturile celulare care le-au multiplicat. n funcie de materialul din care sunt confecionate i de diametrul porilor, filtrele au o anumit denumire comercial i un indicativ. Filtrele bacteriologice clasice (fig. 3) - bujii filtrante din porelan (filtre Chamberland), pmnt de infuzorii (filtre Berckefeld), plci filtrante din azbest impregnate cu caolin (filtre Seitz) sau sticl poroas (filtre Schot), - sunt nlocuite n prezent cu membrane din acetat de celuloz (filtre Millipore) (fig. 4).,sau mase plastice (filtre Sartorius) montate n dispozitive care asigur filtrarea prin aspirare sau prin presiune pozitiv.

Fig. 3 Filtre bacteriologice clasice 1. Filtre Seitz: a-placa filtrant din azbest; b- armtur metalic constituit dintr-o pies superioar i una inferioar; 2. Bujie filtrant (Berkefeld sau Chamberland)

Fig. 4 Sterilizare prin membran filtrant (Millipore) STERILIZAREA PRIN AGENI CHIMICI

Pentru sterilizarea prin ageni chimici este folosit n general termenul de dezinfecie.n acest scop sunt utilizate substane chimice cu efect microbicid (omoar microbii) sau microbiostatic (mpiedic multiplicarea microbilor fr a-i distruige) n funcie de concentraie, cunoscute sub denumirea de dezinfectante i antiseptice. Acestea au o toxicitate neselectiv (pentru microorganisme, dar i pentru celula animal) acionnd prin lezarea membranelor celulare, alterarea acizilor nucleici, denaturarea proteinelor structurale sau blocarea gruprilor funcionale ale enzimelor. Diferena dintre cele dou categorii ine de utilizarea lor. Dezinfectantele sunt puternic microbicide dar prezint toxicitate crescut pentru esuturile organismelor superioare, fiind utilizate numai n distrugerea microbilor de pe substraturi inerte (obiecte, pardoseli, mijloace de transport, surse de ap etc.) Antisepticele au efect bacteriostatic i prezint o toxicitate relativ redus pentru organismele vii, fapt care permite aplicarea lor pe tegumente i mucoase n scopul prevenirii sau extinderii infeciilor. Este posibil ca aceeai substan chimic s fie utilizat att ca antiseptic ct i ca dezinfectant, n raport de concentraie. Substanele chimice dezinfectante mai frecvent utilizate n laboratoarele de microbiologie sunt menionate n tabelul 3: 1Tabelul 1 Ageni sterilizani chimici de uz curent Nr. Crt. 1. 2. Denumirea substanei Soluia de clorur mercuric (sublimat coroziv) 1 Amestecul sulfo-cromic (100g bicromat de K +2000ml ap distilat +1000g acid sulfuric ethnic) Alcool medicinal Alcool etilic de 70(alcool dublu rafinat de 96 +400 ml ap distiolat) Formol soluie comercial 40% Utilizare - dezinfecia meselor, suprafeelor din sticl, faiant , material plastic. - dezinfecia minilor. - dezinfecia pipetelor i a lamelor ntrebuinate. (la schimbarea culorii din rou-portocaliu n verde, soluia se nlocuiete) - dezinfecia curent a minilor. - dezinfecia curent a minilor.

3. 4.

5.

6. 7. 8. 9. 10.

- dezinfecia suprafeelor din sticl, faian, metal din laborator (n con. de 5%). sub form de aerosoli: dezinfecia ncperilor(15ml formol/m3 aer) i a boxelor de nsmnare (25ml formol/ m3 aer). - inactivarea culturilor microbiene n vederea preparrii unor vaccinuri (conc. 0,1-2%). Fenol (acid fenic) - dezinfecia diferitelor obiecte din sticl, porelan, metal (sol. 5%). Tinctur de iod - dezinfecia locurilor de puncie Ap oxigenat 3% - dezinfecia mucoaselor Soluia pemanganat de - dezinfecia minilor 1 potasiu - dezinfecia mucoasei bucale 1/5000 - splturi oculare 1/10000 Acid acetic 1% - dezinfecia pipetelor i a lamelor n laboratorul care se ocup cu studiul germenilor din genul

11. 12. 13. 14.

Leptospira. Hidroxid de sodiu (sod - dezinfecia adposturilor de animale i a caustic) 2-4% cutilor. Cloramina B - dezinfecia minilor (sol. 1%). - dezinfecia meselor de laborator, cutilor de animale (conc. 5%). Clorura de var - dezinfecia curent a grajdurilor. Diferii detergeni - dezinfecia minilor (sol. 1%). (anionici, cationici, - splarea sticlriei. iodofori)

n prezent se comercializeaz o gam foarte variat de noi dezinfectante i antiseptice, unii reprezentnd un amestec de compui chimici, cu efect antimicrobian sporit, a cror utilizare necesit respectarea indicaiilor productorului.