Facultad de Ingeniera Qumica Qumica de Alimentos

Prctica 1:

Carbohidratos Totales de acuerdo a la Tcnica de Dubois

Profesor: D en C. Santiago Gallegos Tintor Equipo 2:

Benitez Samantha I.Q.I. Castaldi Molina Erika Q.I. Guilln Alejandra I.Q.I. Luis Ferraez Q.I. Obed Navarrete I.Q.I.

Sptimo semestre

Fecha de realizacin: 23 de septiembre de 2013

Fecha de entrega: 30 de septiembre de 2013

Prctica 1

30 de septiembre del 2013

CARBOHIDRATOS TOTALES DE ACUERDO A LA TCNICA DE DUBOIS Benitez, S.; Cataldi, E.; Guilln, A.; Ferraez, L. y Navarrete, O. I. Resumen:

En el presente trabajo se llev a cabo la determinacin de glucosa en miel natural proporcionada por el laboratorio de anlisis sensorial de la Facultad de Ingeniera Qumica, con el propsito de identificar y cuantificar carbohidratos utilizando la tcnica de Dubois. Esta tcnica consiste en realizar a la muestra de carbohidratos una deshidrogenacin seguida de una catlisis cida utilizando como reactivos fenol y cido sulfrico concentrado para formar compuestos heterocclicos coloridos que son derivados del furano, por lo que al presentar color se pueden analizar mediante espectrofotometra UV a una longitud de onda de 492 nm. Para el tratamiento de la muestra se realiz una solucin madre y posteriormente una dilucin debido a que las concentraciones de glucosa podran ser elevadas. Previamente se realiz una curva de calibracin con un stock de glucosa y a partir de la ecuacin de la recta y las absorbancias obtenidas para las muestras, se procedi a la cuantificacin de glucosa presente en la muestra de miel. Los resultados obtenidos mostraron que la miel presenta una concentracin de 10.309 g de glucosa por cada 100 g de muestra lo que se encuentra dentro de los lmites permisibles de la Norma Mexicana para Miel. II. Introduccin:

La miel es un alimento energtico elaborado por las abejas que se conoce desde hace mucho tiempo. Es energtico por su contenido en azcares simples, que son asimilados rpidamente por el organismo, contribuyendo al mantenimiento del esqueleto (calcio) y a la regeneracin de la sangre (hierro). Su valor energtico y su fcil digestin son vitales para la actividad fsica y mental, por su fcil asimilacin (Quintns Riveiro, 2008). Se entiende como miel "la sustancia natural dulce producida por la abeja Apis mellifera a partir del nctar de plantas o de secreciones de partes vivas de plantas o de excreciones de insectos chupadores presentes en las partes vivas de plantas, que las abejas recolectan, transforman, combinndolas con sustancias especficas propias, depositan, deshidratan, almacenan y dejan en colmenas para que maduren, Este proceso alimenticio puede ser fluido, espeso o cristalino" (Quintns Riveiro, 2008). Qu tipo de carbohidratos contiene la miel de abeja? Como se puede percibir de la tabla1, los tipos de carbohidratos contenidos en la miel de abeja, se encuentra compuesta mayormente de azcares (75.1g%). Son estos azcares los que imparten a la miel las caractersticas fsico-qumicas principales como; viscosidad, higroscopicidad, granulacin, valor energtico (White, et al., 1962) .
Carbohidratos
Azcar

Cantidad
75,10 g.

Carbohidratos
Lactosa

Cantidad
0 g.

Qumica de Alimentos

Prctica 1
Fructosa Galactosa Glucosa 38,80 g. 0 g. 33,90 g. Maltosa Oligosacaridos Sacarosa

30 de septiembre del 2013

0 g. 0 g. 2,37 g.

Tabla 1. Contenido promedio de carbohidratos que contiene la miel.

Qu medidas de seguridad deben tomarse en consideracin para la realizacin de este anlisis de laboratorio? Hay que tomar en cuenta el manejo de la muestra para evitar que esta se infecte, mantener calibrado los instrumentos para obtener medias lo ms precisas posible y tener un equipo adecuado para el manejo del H2SO4 (Nielsen, 2003). III. Antecedentes En alimentos para determinar carbohidratos totales, como azucares, carbohidratos complejos y fibra, usa el mtodo colorimtrico del fenol-sulfrico, que produce un color naranja muy estable cuando reacciona con fenol y en presencia de cido sulfrico concentrado. Este mtodo propuesto por Michel Dubois en 1956 se fundamenta en que los carbohidratos son particularmente sensibles a cidos fuertes y altas temperaturas (Dubois, et al., 1956). Bajo estas condiciones una serie de reacciones complejas toman lugar empezando con una deshidratacin simple, si se contina el calentamiento y la catlisis cida se producen varios derivados del furano que condensan consigo mismos y con otros subproductos para producir compuestos coloridos producto de la condensacin de compuestos fenlicos y con heterociclos con el nitrgeno como heterotomo. La condensacin ms comn es con fenol. Este mtodo es fcil, eficaz y rpido. Todos los azcares como oligosacridos y polisacridos pueden ser determinados, recordando que stos bajo hidrlisis cida producen monosacridos (Fennema, 1993). Es posible evidenciarlo en un fotmetro, donde se utiliza un haz de luz enfocando para penetrar el elemento del procesado. La alteracin de la intensidad de la luz, causada por la absorcin y/o difusin est explicada en la Ley Lambert-Beer. Es un medio matemtico de expresar cmo la materia absorbe la luz. Slo sirve para variaciones monocromticas, y dice que la absorbancia que se produce en un determinado medio es proporcional a la concentracin del mismo. Cuando se quiere calcular la concentracin de una muestra midiendo la absorbancia de la misma se realiza una recta de calibrado a una determinada. Esta relacin puede ser expresada como: A = dc, donde A es la absorbancia, es el coeficiente molar de extincin, d distancia en cm, y c concentracin molar. La intensidad del color en la aplicabilidad de la ley es proporcional a la cantidad de carbohidratos presentes en la muestra. Esta absorbancia puede ser medida a 492 nm y la concentracin total de carbohidratos de la solucin problema puede ser medida con respecto a una curva estndar preparada (curva de calibrado) (Harvey, 2002). Esta curva estndar se obtiene al diluir sucesivamente la muestra de glucosa que se quiere, graficando la concentracin conocida (eje x) contra el valor de la absorbancia medido (eje Qumica de Alimentos

Prctica 1

30 de septiembre del 2013

y), si la curva de calibrado es correcta, el coeficiente de correlacin dar un valor aproximado de 1, debido a que este mide la fortaleza relativa de una relacin lineal entre dos variables (Quesada Mora, 2007) (Berenson, et al., 2006). IV. Objetivo.

AL finalizar la prctica, el alumno cuantificar el contenido total de carbohidratos en una muestra de alimentos. V. Materiales, Equipos y Reactivos.

Reactivos Estndar de Glucosa 0.4mg/ml Fenol 5% Muestra de miel 1mg/ml H2So4 concentrado

Equipo 1 Bao de agua caliente 1 Espectrofotmetro

Materiales 2 Gradilla para tubo de ensaye 4 Matraz de 250ml 1 Micropipeta 20-100 1 Micropipeta 100-1000 1 Pizeta

1 Pipeta 5ml 1 Pipeta 1ml 1 Pipetor 20 Tubos de ensayo 1 Vaso Precipitado 250ml

VI.

Metodologa. Preparacin de la muestra. 1. Realizar la disolucin de la muestra, pesar y agregar 0.250 g de miel de abeja al vaso de precipitado y agitar para homogenizar, luego verter en l matraz volumtrico de 250ml y aforar con agua destilada. 2. Tomar una muestra de 25ml de matraz aforado y agregarlo en otro matraz de 250ml y aforar con agua destilada. Preparacin de la curva de calibracin 1. Preparar la curva de calibracin como se muestra a continuacin.

Qumica de Alimentos

Prctica 1

30 de septiembre del 2013

N Dilucin Stock de glucosa (l) Agua Destilada (l) Concentracin de glucosa (l/ml)

1 (blanco) 0 1000 0

2 25 975 10

3 50 950 20

4 75 925 30

5 100 900 40

6 125 875 50

7 150 850 60

8 175 825 70

9 200 800 80

Tabla 2. Cantidades necesarias para preparar los estndares a las concentraciones indicadas.

2. Realizar la curva de calibracin por duplicado. 3. A dos tubos de ensayo aadir 1 ml de la muestra. 4. En otros tubos de ensayo aadir la cantidad de stock de glucosa y agua destilada mostradas en la Tabla 2. 5. A cada tubo de ensayo aadirle 0.5ml de fenol 5% y de forma rpida y con precaucin 2.5ml de cido sulfrico concentrado, mezclar y dejar reposar durante 15minutos a temperatura ambiente. 6. Colocar los tubos de ensayo a bao Mara a 30C por 15min. 7. Determinar las absorbancias a una longitud de onda de 492nm. 8. Determinar la concentracin de glucosa en la muestra (eje x) empleando la ecuacin de la recta y =a+bx obtenida a partir de la curva de estndar. VII. Resultados y Discusiones.

La muestra de miel fue proporcionada por el laboratorio de sensorial de la Facultad de Ingeniera Qumica. En la tabla 3 se presentan las absorbancias correspondientes que se obtuvieron para cada uno de los estndares de ambas curvas, y el valor promedio de cada una de las absorbancias de los estndares. Posteriormente se muestra la curva de calibracin corregida, que se obtuvo evaluando nicamente los primeros cuatro puntos de la curva debido a que a partir del estndar 5 las concentraciones son muy elevadas y afectan la correlacin de la curva de calibracin.
Estndar 1 2 3 4 5 6 Concentracin (g/mL) 0 10 20 30 40 50 Curva 1 Absorbancia (nm) 0 1.366 2.276 3.064 3.08 3.181 Curva 2 Absorbancia (nm) 0 1.529 2.644 3.133 3.103 3.218 Absorbancias promedio 0 1.4475 2.46 3.0985 3.0915 3.1995

Qumica de Alimentos

Prctica 1
7 8 9 60 70 80 3.153 3.486 3.312 3.266 3.262 3.262

30 de septiembre del 2013

3.2095 3.374 3.287

Tabla 3 Concentraciones, absorbancias y absorbancias promedio para cada estndar.

Curva de Calibracin de Glucosa Corregida

Absorbancias (nm) 4 3 2 1 0 0 10 20 30 40 Concentracin de glucosa en ppm
Tabla 4 Curva de Calibracin para los primeros cuatro estndares.

y = 0.1031x + 0.2053 R = 0.9701 4 primeros estndares Linear (4 primeros estndares)

Muestra M1 M2 Promedio

Absorbancia (nm) 1.332 1.485 1.4085

Concentracin 10.928 12.4122 11.6701

Tabla 5. Absorbancias y concentraciones de cada muestra

En la Tabla 5 se encuentran registradas las absorbancias que se obtuvieron para cada muestra. Por mtodo de mnimos cuadrados se determin la ecuacin de la recta de regresin como: y=0.1031x + 0.2053 Con y=Absorbancia y x=Concentracin. Muestra 1 Despejando X, para interpolar la concentracin de la muestra se obtiene el valor de:

Qumica de Alimentos

Prctica 1

30 de septiembre del 2013

Muestra 2 Despejando X, para interpolar la concentracin de la muestra se obtiene el valor de:

Promedio de la muestra 1 y 2: ( )

La concentracin promedio de glucosa que se obtuvo para las muestras fue de 11.6701

tomando en cuenta que la muestra se encontraba diluida se realizarn los clculos necesarios para saber la concentracin de glucosa en la muestra original. Primero se determina la concentracin de glucosa que hay en la solucin de 250 ml a partir de 1 ml de muestra que se analiz. 11.6701 g en 1 ml de muestra tomada de la muestra diluida a 250 ml. 1ml se solucin 11.6701 g de glucosa 250 ml de solucin x x = 2917.525 g glucosa en los 250 ml de la disolucin. Ahora determinamos la cantidad de glucosa en la muestra aforada a 250 ml. Como se tomaron 25 ml de la solucin madre de miel y se diluyeron a 250, se considera que la cantidad de glucosa que hay en los 250 ml de disolucin es igual a la cantidad que hay en los 25 ml tomados de la solucin madre, por lo tanto: 25 ml de solucin madre 2917.525 g de Glucosa 250 ml de solucin madre x x= 29175.25 g de glucosa en la muestra de miel. Por lo tanto la solucin madre preparada contena 29175.25 g de glucosa. Para poder comparar con la norma se realizaron las conversiones pertinentes para obtener la concentracin de glucosa en gramos. Qumica de Alimentos

Prctica 1 1000 g 1 mg 29175.25 g x X= 29.17525 mg de glucosa

30 de septiembre del 2013

0.283 g de muestra hay 27.17525 mg de glucosa 100 g de muestra x x= 10309.25795 mg de glucosa x= 10.309 g de glucosa por cada 100 gramos de muestra. As se obtiene finalmente que la concentracin de glucosa en la muestra de miel es de 10.309g de glucosa por cada 100 gramos de miel. . De acuerdo a los valores de la Tabla 3, para la recta de regresin se obtuvo una correlacin de 0.9701, lo cual nos indica que los estndares no estn lo suficientemente relacionados entre s y no poseen un ajuste a la tendencia lineal aceptable. Concentracin promedio de glucosa en la muestra de miel (g/100 g) 10.309 Mximo establecido (g/ 100 g)

38

Tabla 6. Comparacin de la concentracin obtenida para la muestra con la cantidad mxima establecida en la NMX-F-036-981.

El anlisis demostr que la cantidad de glucosa que posee la muestra de miel analizada fue de 10.309 g/100 g, es decir un 10.309 %, lo cual al compararlo con la norma mexicana (NMX-F-036-981) la cual establece que la cantidad mxima permitida de glucosa en una miel natural es de 38 g/100 g, se determina que la miel analizada cumple con dicho parmetro. VIII. Observaciones La muestra era desconocida por lo que no se sabe si es una muestra representativa o si se contamino y/o degrado durante su almacenamiento. La diferencia de concentraciones obtenidas entre las muestras se pudo deber a que los materiales se encontraban sucios y a pesar de ser lavados no se logr deshacerse de la suciedad. Debido a que los estndares presentaban concentraciones muy altas, se debi de proceder a realizar diluciones en la curva, pero debido a la falta de tiempo no se llev a cabo.

Qumica de Alimentos

Prctica 1 IX. Conclusiones.

30 de septiembre del 2013

Al trmino de la prctica se determin que la concentracin de glucosa (expresado como g/ 100 g) de la Miel proporcionada por el Laboratorio de Anlisis Sensorial. Comparando los resultados obtenidos con el valor establecido como mximo permisible de glucosa en las Norma Mexicana NMX-F-036-981 se concluye que la miel cumple con lo establecido en dicha norma para el consumo humano.

X. Cuestionario. 1. Cul es el principio del mtodo para la determinacin del contenido de carbohidratos totales en un alimento? Este mtodo propuesto por Dubois et al en 1956 se fundamenta en que los carbohidratos son particularmente sensible a cidos fuertes y altas temperaturas. Bajo estas condiciones una serie de reacciones complejas toman lugar empezando con una deshidratacin simple, si se contina el calentamiento y la catlisis cida se producen varios derivados del furano que condensan consigo mismos y con otros subproductos para producir compuestos coloridos producto de la condensacin de compuestos fenlicos y con heterociclos con el nitrgeno como heterotomo. La condensacin ms comn es con fenol. Este mtodo es fcil, eficaz y rpido. Todos los azcares como oligosacridos y polisacridos pueden ser determinados, recordando que stos bajo hidrlisis cida producen monosacridos. La forma en que procede la reaccin no es estequiomtrica y depende de la estructura del azcar, por lo tanto se realiza una curva patrn (White, et al., 1962). 2. Segn con el resultado obtenido en el laboratorio para la muestra analizada, ste difiere con respecto a la literatura? Si es as Por qu? Debido a que no se conoce el lugar de origen de la muestra no se puede realizar una comparacin verdadera con la literatura, sin embargo, basndose en la Norma Mexicana para la Miel de determina que la miel se encuentra dentro de los lmites permitidos para el consumo humano (NMX-F-036-981, 2007).

3. Qu medidas de seguridad deben tomarse en consideracin para la realizacin de este anlisis de laboratorio? Hay que tomar en cuenta el manejo de la muestra para evitar que esta se infecte, mantener calibrado los instrumentos para obtener medias lo ms precisas posible y tener un equipo adecuado para el manejo del H2SO4 (Nielsen, 2003). 4. Qu tipo de carbohidratos contiene la miel de abeja? Como se puede percibir de la tabla1, los tipos de carbohidratos contenidos en la

Qumica de Alimentos

Prctica 1

30 de septiembre del 2013

miel de abeja, se encuentra compuesta mayormente de azcares (75.1g%). Son estos azcares los que imparten a la miel las caractersticas fsico-qumicas principales como; viscosidad, higroscopicidad, granulacin, valor energtico (Dubois, et al., 1956)

Carbohidratos Azcar Fructosa Galactosa Glucosa

Cantidad 75,10 g. 38,80 g. 0 g. 33,90 g.

Carbohidratos Lactosa Maltosa Oligosacaridos Sacarosa

Cantidad 0 g. 0 g. 0 g. 2,37 g.

5. A qu se refiere el coeficiente de correlacin y determinacin de la curva estndar de glucosa? El coeficiente de correlacin se utiliza para expresar la extensin o grado en el cual pares de variables o conjuntos de variables varan de modo concomitante. El coeficiente de correlacin indica la fuerza (magnitud) y la direccin de la relacin entre las variables. Generalmente, el valor del coeficiente de correlacin vara en el rango de -1 hasta +1, pasando por 0. El valor r= -1 indica una perfecta relacin inversa entre las variables; el valor r=+1 indica una perfecta relacin directa entre las variables; y finalmente, r=0, indica que no existe una relacin discernible entre las variables (Moncada Jimnez, 2005). Por lo tanto al obtener un coeficiente de correlacin de 0.9701 se determina que la linearidad de los estndares no es apta para realizar un anlisis certero, es decir que los estndares no se encuentran lo suficientemente relacionados entre s como para poder utilizar la ecuacin de la recta y determinar la concentracin de la muestra problema. XI. Referencias Berenson, M. L., Levine, D. M. & Krehbiel, T. C., 2006. Estadstica para administracin. Miami: Pearson Education. Dubois, M. y otros, 1956. Colorimetroc Method for Determination of Sugars and Related Substances. University of Minnesota, 28(3), pp. 350-356. Fennema, O., 1993. Quimica de Alimentos. Segunda ed. Espaa: Acribia. Harvey, D., 2002. Qumica Analtica Moderna. Madrid, Espaa.: McGraw Hill. Moncada Jimnez, J., 2005. Estadstica para ciencias del movimiento humano.

Qumica de Alimentos

10

Prctica 1

30 de septiembre del 2013

Primera ed. Costa Rica: Editorial de la Universidad de Costa Rica. Nielsen, S., 2003. Food Analysis Laboratory Manual. Nueva York: Kluwer Academic/Plenum Publishers. NMX-F-036-981, 2007. MIEL DE ABEJA. ESPECIFICACIONES. NORMA MEXICANA. DIRECCION GENERAL DE NORMAS.. [En lnea] Available at: http://www.economia-nmx.gob.mx/normasmx/consulta.nmx [ltimo acceso: 29 septiembre 2013]. Quesada Mora, S., 2007. Manual de Experimentos de Laboratorio para Bioqumica. Primera ed. Costa Rica: Universidad Estatal a Distancia. Quintns Riveiro, L. C., 2008. REOLOGA DE PRODUCTOS ALIMENTARIOS. Primera ed. Galicia, Espaa: Universidad de Santiago de Compostela. White, Riethof, Subers & Kushnir, 1962. Composicin de la Miel de Abeja. s.l.:s.n.

Qumica de Alimentos

11