Disciplina de Microbiologie UMF Tg.

Mure LP3

Cultivarea bacteriilor
Cultivarea bacteriilor: creterea bacteriilor pe medii de cultur n condi ii in vitro. Medii de cultur: complexe de substane care permit creterea i multiplicarea bacteriilor (conin substane nutritive, au pH corespunztor, umiditate corespunztoare, sunt sterile, trebuie asigurat aero/anaerobioza) nsmnare: punerea n contact a unei culturi bacteriene sau a unui produs patologic cu mediile de cultur. Colonie bacterian: aglomerare de bacterii vizibil cu ochiul liber, format din multiplicarea unei singure bacterii de pe mediul de cultur Izolare: repicarea unei singure colonii pe alte medii de cultur cu scopul de a obine cultur pur

Clasificarea mediilor de cultur

Dup consisten: lichide (repartizate n eprubete) solide (geloza dreapt, nclinat, n plac) semisolide (n eprubete)

Dup coninutul de substane nutritive: Medii naturale: conin substane nutritive n forma lor natural, fr a fi prelucrate n prealabil Medii artificiale

Metode de nsmnare
Pe medii solide nsmnare prin epuizare (se obin colonii izolate) nsmnare n sector (se obin colonii confluente) nsmnare prin nepare

Pe medii lichide omogenizarea unei colonii n mediu lichid

-1-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP3

nsmnarea prin epuizare

Obinerea culturii primare Se ncarc ansa de platin sterilizat cu produs patologic Se descarc ansa pe mediu de cultur: se nsmneaz un prim sector se sterilizeaz ansa din primul sector nsmnat se traseaz cteva striuri paralele n sensul acelor de ceasornic se continu nsmnarea prin striuri paralele, terminndu-se printr-un striu n zig-zag n ultimul sector bacteriile sunt dispersate, astfel nct dup incubare se vor forma colonii izolate

Obinerea culturii pure Se replic o singur colonie din cultura primar pe un mediu de cultur proaspt, fie prin epuizare, fie prin nsmnare n sector

nsmnarea n sector
Pe o plac pot fi nsmnate mai multe specii bacteriene Prin nsmnare n sector nu se obin colonii izolate !

Se ncarc ansa de platin sterilizat cu produs patologic Se descarc ansa pe mediu de cultur sub forma unui sector de cerc

-2-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP3

nsmnarea pe medii n coloan nclinat

Se ncarc ansa de platin sterilizat cu produs Se descarc ansa pe partea nclinat a mediului de cultur sub forma unui striu NU se obin colonii izolate, bacteriile cresc sub diferite modele

nsmnarea prin nepare

Se practic pentru nsmnarea mediilor solide turnate n coloan dreapt Se ncarc acul de inoculare cu produs Se neap mediul n direc ie vertical pe o distan de din nl imea coloanei

nsmnarea n mediu lichid

Se ncarc ansa de platin sterilizat cu produs Se omogenizeaz produsul recoltat n mediul de cultur lichid n funcie de specie, bacteriile cresc difuz n tot volumul mediului / la suprafa / la fundul eprubetei

-3-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP3

Cultivarea virusurilor
Cultivarea virusurilor pe culturi celulare
Virusurile pot fi izolate pe celule vii, receptive. Cultura celular : sistem biologic in vitro alctuit din celule izolate vii, care i pstreaz capacitatea de multiplicare i nu se organizeaz n esuturi. Condiii necesare pentru pstrarea n via a celulelor din cultura celular : condiii aseptice mediu nutritiv (mediu de cultur lichid ce conine substane nutritive, surs de energie, factori de cretere, vitamine, sistem tampon, indicator, antibiotice i antifungice) mediile comercializate Eagle, Hanks, M199 pH adecvat temperatur constant atmosfer cu 10% CO2 culturi de origine animal sau uman culturi de celule embrionare sau adulte culturi de celule normale sau tumorale

n funcie de proveniena celulelor, culturile celulare se clasific n: -

Culturile celulare primare sunt culturi realizate direct din esuturile surs. Liniile celulare stabilizate deriv din culturile primare, se menin n via timp nelimitat prin subcultivri. Realizarea culturilor primare din esuturi solide se prelev esutul surs n condiii aseptice se fragmenteaz esutul n buci de aprox. 1 mm3, se spal cu soluie salin tamponat (SST) pentru ndeprtarea sngelui disocierea enzimatic a celulelor: tripsinizarea fragmentelor tisulare n solu ie de tripsin 0,25% (enzim proteolitic, desface legturile peptidice) pe agitator magnetic desfacerea legturilor intercelulare colectarea celulelor izolate n vas colector se face prin filtrare pentru a obine numai celule izolate repetare tripsinizrii pn la epuizarea esutului, n timpul tripsinizrii vasul colector se pstreaz la temperatura de 4C pentru inactivarea tripsinei

-4-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP3

centrifugarea suspensiei de celule izolate, ndeprtarea supernatantului (tripsina), splare cu SST, n final suspendarea celulelor n mediu nutritiv

controlul viabilit ii celulelor cu colora ie vital albastru de tripan (se coloreaz celulele moarte) pentru a se realiza cultura, 90% din celule trebuie s fie vii)

numrarea celulelor, ajustarea lor la concentraie de 300000 celule/ml, repartizare volume egale n flacoane de culturi celulare

incubare n poziie culcat urmrirea formrii culturii cu microscopul invers

Culturi provenite din celule: normale: celulele se ataeaz de peretele flaconului, se multiplic pn acoper peretele flaconului, realizeaz o cultur monostrat (fenomenul inhibi iei de contact) tumorale: se multiplic i dup acoperirea suprafeei disponibile, cresc n mai multe straturi i n suspensie Subcultivarea culturilor celulare Dup 5-7 zile de la realizarea culturii se epuizeaz substanele nutritive, sursele de energie, se acidific mediul. Pentru meninerea celulelor n via , acestea trebuie pasate, subcultivate. Se realizeaz prin versenizare: celulele se detaeaz de pe peretele flaconului cu soluie de EDTA (versen) se centrifugheaz se spal cu soluie SST se resuspendeaz n mediu nutritiv se verific viabilitatea celulelor, se numr celulele i se ajusteaz la concentraia optim. Se repartizeaz volume egale n flacoane de cultur celular. Culturile primare realizate din celule normale adulte pot fi subcultivate de cteva ori (4-6) dup care celulele mor (apoptoz) Culturile realizate din esuturi embrionare pot fi subcultivate de mai multe ori (celule nediferen iate), de 60-80x, dup care mor. Liniile celulare pot fi subcultivate nedefinit. Aceste se obin din esuturi tumorale (HeLa, KB, Detroit , etc) sau din culturi celulare efectuate din esuturi normale care au suferit transformare malign spontan (Vero). Liniile celulare sunt bine caracterizate, se manevreaz uor, pot fi folosite pentru izolarea virusurilor.

-5-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP3

Inocularea suspensiilor virale n culturile celulare, identificarea izolatelor virale se ndeprteaz mediul nutritiv i se introduce n flacon suspensia viral pregtit n prealabil. dup o incubare de 1 or (penetrarea virusurilor n celulele receptive) suspensia se decanteaz, se adaug mediu de ntreinere (mai srac n substane nutritive dect mediul nutritiv, dar care permite supravieuirea celulelor) se incubeaz n zilele urmtoare se urmresc modific rile survenite n cultura celular.

Izolarea virusurilor pe oul de gin embrionat

Membrana proprie Camera de aer Membrana corioalantoidean

Embrion Coaja oului Cavitatea amniotic Sacul vitelin Cavitatea alantoidean

Inocularea virusurilor se poate face pe: membrana corioalantoidean cavitatea alantoidean cavitatea amniotic sacul vitelin venele alantoidiene embrion

-6-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP3

Inocularea pe membrana corioalantoidean la ovoscop se noteaz pe coaj poziia camerei de aer i zona unde membrana corioalantoidean este cel mai bogat vascularizat se antiseptizeaz coaja n cele dou locuri notate anterior se perforeaz cu un ac coaja n zona camerei de aer cu o frez se decupeaz un triunghi din coaj la nivelul membranei se perforeaz membrana proprie i se aspir aerul din camera de aer cu ajutorul unei tetine din cauciuc (membrana proprie se dezlipete de membrana corioalantoidean) se ndeprteaz poriunea vizibil din membrana proprie, evideniindu-se direct membrana corioalantoidean se depune pe membran produsul de inoculat cu o pipet dup inoculare se astup orificiile create cu lamel de sticl i parafin

Izolarea virusurilor la animale de laborator

La aceast metod se recurge n momentul n care celelalte metode sunt nesatisfctoare. Este necesar cunoaterea metodelor de contenie a animalelor nainte de inoculare animalele sunt marcate, dac este necesar sunt anesteziate (intervenii dureroase), iar locul inoculrii se epileaz i se antiseptizeaz. Inocularea se face prin diferite c i: intradermic subcutanat intramuscular intravenos intraperitoneal intranazal intracerebral Suspensiile virale sunt inoculate prin injecie, inhalare, ingestie, badijonare, etc

-7-