UFPS, Facultad de ciencias agrarias y del ambiente, Ingeniera Biotecnolgica, Biologa Molecular, 2013

Informe IV

Extraccin y purificacin del ADN de hongos

Nayeli Alejandra Jaimes Jaimes (1610629), Yeily Adriana Rangel basto (1610620) e Ismael Enrique Garcia Ochoa (1610624).

INTRODUCCION La extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la primara etapa de la mayora de los estudios de biologa molecular y de todas las tcnicas de recombinacin de ADN. En este caso, los mtodos de extraccin permiten obtener cidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para despus realizar anlisis especficos de modificaciones genticas mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). La calidad y la pureza de los cidos nucleicos son dos de los elementos ms importantes en ese tipo de anlisis. Si se desea obtener cidos nucleicos muy purificados, que no contengan contaminantes inhibidores, es preciso aplicar mtodos de extraccin adecuados. Un punto clave en la extraccin de ADN de buena calidad del micelio de hongos fitopatgenos es el crecimiento ptimo del micelio sobre un medio de cultivo. Se utiliza, generalmente, este tipo de tejido del hongo porque tiene un crecimiento ms homogneo que otros tejidos del hongo. Las esporas, por ejemplo, son ms difciles de procesar que el micelio, porque son estructuras muy rgidas que requieren protocolos de extraccin especiales; adems, pertenecen, por su formacin, a la etapa madura o senescente del crecimiento del hongo. Para lograr un buen crecimiento del micelio de un hongo es necesario aplicar las buenas prcticas microbiolgicas (BPM), entre ellas las siguientes: esterilidad, identificacin correcta de las muestras y cultivo del hongo en la fase exponencial de crecimiento. La electroforesis en gel de agarosa es de las ms utilizadas para analizar y caracterizar cidos nuclicos de distintas procedencias. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar molculas cargadas en funcin de su tamao y forma. As, molculas de DNA de diferente tamao van a emigrar de forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa. Y si el dicha electroforesis se aplican marcadores de peso molecular (en ste caso del fago ) se puede conocer el tamao aproximando del ADN de estudio (Padilla et. al., 2005).

OBJETIVOS Conocer los fundamentos de la extraccin y purificacin del ADN genmico a partir de moniliophthora roreri o fusarium sp. como modelo. Describir y explicar cada una de las etapas del protocolo y definir la importancia de cada uno de los reactivos en las diferentes etapas. Conocer los principios bsicos para la extraccin de del material gentico de un microorganismo. Visualizar el material gentico extrado con el uso de herramientas bsicas de biologa molecular.

Informe de laboratorio. Profesora Liliana Yaneth Suarez Contreras.

Jaimes Jaimes, Rangel Basto, Garcia Ochoa.

MATERIALES Y MTODOS Materiales 2 microtubos de 2ml 2 microtubos de 1ml 1 caja de petri estril 1 asa microbiolgica Pistilos Bistur de diseccin Puntas o tips Reactivos Buffer de extraccin Fenol/cloroformo Isopropanol Etanol TE 1X Equipos Incubadora Centrifuga Vortex Rotor Micropipetas

EXTRACCION DE ADN Aadir 0.5 a 2.0 gr de micelio de hongo crecido previamente a 28C por 8 a 12 das en caldo papa dextrosa en un microtubo de 2ml

Adicionar un volumen de 500 l de buffer de extraccin; macerar la muestra con el buffer de extraccin

Agitar en vortex por un minuto y centrifugar a 6000 rpm/10 minutos

Sacar el sobrenadante a un tubo Eppendorf de 1 mililitro e incubar a 70C por 15 minutos

Extraccin y purificacin del ADN de hongos Separacin de ADN por electroforesis horizontal en geles de agarosa

Jaimes Jaimes, Rangel Basto, Garcia Ochoa. PURIFICACION DEL ADN Adicionar un volumen de fenol/cloroformo de (1:1) y llevar a centrifugar a 10000 rpm durante 10 minutos

Transferir la fase acuosa a otro microtubo y agregar un volumen de isopropanol o etanol

Llevar a 0C por 10 minuto; centrifugar a 10000 rpm durante 10 minutos

Adicionar un volumen de etanol y centrifugar a 10000 rmp durante 10 minutos

Descartar el etanol por inmersin, as mismo secar el precipitado a 37C y resuspender a 50 ml de TE

VISUALIZAR EL ADN Electroforesis en gel de agarosa al 0.7-1.0% de o.5 a 5 voltios por centmetro entre los electrodos por 20 minutos

RESULTADOS PRIMERA ELECTROFORESIS El protocolo usado en la prctica fue de gran precisin, al final de la prueba se obtuvo ADN de hongo sobre la superficie de cada uno de los tubos; cada uno de los reactivos fue punto clave para la extraccin, purificacin del ADN, siendo los reactivos ms relevantes buffer de extraccin, fenol/cloroformo y etanol. Era de vital importancia el trabajo realizado con la micropipeta pues con ayuda de esta sacbamos las fases que eran de nuestro inters. Ya terminado el protocolo pudimos darnos cuenta que el ADN aislado se poda observar en el interior del tubo, para el caso de moniliophthora roreri se obtuvo el ADN de color traslucido adherido a las paredes del microtubo y en fusarium sp. el ADN se precipito al fondo del tubo formando un botn de color purpura. Se realiz el procedimiento debidamente enunciado en la gua de laboratorio siguiendo todas las indicaciones y normas de precaucin, las cuales son importantes ya que ciertas sustancias utilizadas en electroforesis como lo es el bromuro de etidio son mutagnicos y debe evitarse su contacto con la piel y aspirar sus vapores. A continuacin se muestra un esquema general del proceso llevado a cabo.

Extraccin y purificacin del ADN de hongos Separacin de ADN por electroforesis horizontal en geles de agarosa

Jaimes Jaimes, Rangel Basto, Garcia Ochoa.

Una vez realizado el procedimiento, se llev a cabo la visualizacin del ADN donde se observ especficamente ADN del hongo fusarium, ya que no se tuvo xito con la visualizacin de la informacin gentica deMonilia, lo cual se puede observar con ms precisin en la figura a continuacin:

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Jaimes Jaimes, Rangel Basto, Garcia Ochoa. SEGUNDA ELECTROFERESIS A continuacin se presentan los resultados de la segunda electroforesis realizada, en la cual se observa que fue un poco el ADN que se logra visualizar, esto debido a que en el momento de realizar la prctica se cometi un error al olvidar aregar el bromuro de etidio al gel de agarosa, sin embargo despus se dispuso el gel en una solucin que contena dicho compuesto para provocar una absorcin y asi una posterior visualizacin del ADN. Una vez colocado el gel en tras iluminador solo se logra observar ADN en las bandas numero 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, y 12, las cuales corresponden a los microorganismos fusarium sp, y monilia sp, en la siguiente imagen se observa el tipo de organismo correspondiente a cada banda, por otro lado las dos bandas que mayor luminiscencia presenta es la 6 y la 9 correspondiente a fusarium y monilia respectivamente.

DISCUSIONES

CONCLUSIONES

CUESTIONARIO EXTRACCION Y PURIFICION DEL ADN DE HONGOS 1. Cul es la diferencia entre ADN genmico y ADN Cromosmico?
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Jaimes Jaimes, Rangel Basto, Garcia Ochoa. ADN Cromosmico, ADN de los cromosomas de los organismos y el ADN genmico, ADN cromosmico nuclear que ha sido aislado directamente de clulas o tejidos.

2. Qu son las nucleasas? El DNA es el depositario y transmisor de la informacin gentica organizada en genes que codifican productos gnicos (protenas o ARNs). Las nucleasas son enzimas que producen la rotura de los enlaces fosfodiester de la cadena polinucleotdica de los cidos nucleicos. La vida media para el enlace fosfodiester en el DNA a pH 7 y 24 C se ha estimado en 130.000 aos. En las mismas condiciones, la vida media del ARN es de solamente 4 aos. Las nucleasas son enzimas hidrolasa del tipo esterasa que degradan cidos nucleicos. Las fosfodiesterasas o nucleasas son enzimas hidrolasas que catalizan la ruptura de los enlaces fosfodister, como por ejemplo los que se establecen en los cidos nucleicos entre la pentosa de un nucletido y el grupo fosfato de otro. Su accin regula la concentracin dentro de las clulas del AMP cclico y del GMP cclico. Estn descriptas 5 isoenzimas. En la actualidad hay frmacos usados como inhibidores de las fosfodiesterasas (cafena, aminofilina, sildenafilo, etc.). Se clasifican segn el tipo de cido nucleico y el tipo de enlace que hidrolizan.

3. Qu son lisozima y mutanolisina? La lisozima es una enzima presente en las lgrimas y la saliva en donde acta como una barrera frente a las infecciones. Tambin es muy abundante en la clara del huevo, de donde se extrae para su uso industrial, en particular para el control de las bacterias lcticas en los vinos. La lisozima fue descubierta por Fleming, el mismo que descubri la penicilina. Adems de encontrarse en la saliva y en las lgrimas, la lisozima est presente en el bazo, los pulmones, los leucocitos, el plasma, la leche y el cartlago. La deficiencia en lisozima, debida a mutaciones en el gen LYZ situado en el cromosoma 12, ha sido asociada a displasias esquelticas y a un aumento de la propensin a las infecciones. Su accin cataltica consiste en la rotura del enlace glicosdico 1-4 caracterstico de los peptidoglicanos bacterianos, cuyo disacrido constitutivo es N-acetil glucosamina-N-acetil murmico. La lisozima es activa sobre todo frente a las bacterias gram-positivas, siendo menor su actividad frenta a las bacterias gram-negativas. La mutanolisina es una enzima especifica gram positiva que hidroliza componentes de la pared celualar.

4. Qu papel juega cada uno de los reactivos utilizados en el proceso de extraccin y purificacin? Buffer de extraccin: El cual tiene la funcin de disolver la bicapa lipdica as como proteger al ADN de la accin de enzimas nucleasas por accin del EDTA contenida en dicha solucin que captura los iones magnesio y no permiten que acten como cofactores de las nucleasas. Las altas concentraciones de NaCl se emplean para prevenir la contaminacin de la muestra con polisacridos que afectan la pureza del ADN, pudiendo inhibir la actividad de algunas enzimas como polimerasas, ligasas y endonucleasas de restriccin; la base para la separacin de los polisacridos de los cidos nucleicos, es su solubilidad diferencial en presencia de las altas concentraciones de NaCl los polisacridos precipitan bajo la accin de fuerzas centrifugas.
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Jaimes Jaimes, Rangel Basto, Garcia Ochoa. Tris, tris (hidroximetil) aminometano (C4H11NO3; Mr = 121,14). Se utiliza como amortiguador porque es una sustancia inocua para la mayor parte de las protenas. Su pka es 8,3 a 20 C, lo que lo convierte en un amortiguador idneo para el intervalo de pH entre 7 y 9. Dodecilsulfato sdico(SDS) (C12H25NaO4S; Mr = 288,38). Es el agente disociador ms habitual para desnaturalizar protenas nativas en sus polipptidos individuales. Cuando se calienta brevemente una mezcla de protenas a 100 C en presencia de SDS, el detergente que cubre el polipptido alrededor de su eje central, mantenindolo desplegado. En este proceso, las cargas intrnsecas del polipptido son despreciables en comparacin por las aportadas por el SDS. De este modo los polipptidos se transforman despus del tratamiento en estructuras con forma de bastn que poseen una densidad de carga uniforme en toda su longitud. La movilidad de estas protenas es una funcin aproximadamente lineal del logaritmo de su masa molecular. NaCl. Con el NaCl conseguimos producir el estallido de los ncleos para que queden libres las fibras de cromatina.

Fenol cloroformo isoamilico: la mezcla nos sirve para aislar protenas Isopropanol: Disminuye la solubilidad del DNA para que pueda precipitar de la solucin. Puesto que las molculas de la DNA son inicas, debido a los grupos fosfatos, son altamente solubles en agua pero no soluble en solventes orgnicos. El isopropanol es de uso general precipitar cidos nucleicos de soluciones acuosas. Cloroformo. El cloroformo (o ms usualmente fenol) es un desnaturalizador activo de protenas que suprime la solubilidad de las protenas en la preparacin y las precipita. Puesto que el fenol y la solucin salina amortiguadora no se mezclan, solo se requiere centrifugar la suspensin para separar las bases, permaneciendo el DNA (y el RNA) en la solucin dentro de la fase acuosa de arriba y la protena presente como un precipitado concentrado en la interfase. Fenol. Nos ayuda a lisar la membrana celular, vuelve ms fluida la membrana. Solucin de etanol: etanol se utiliza para precipitar la solucin del ADN y para retirar sales Buffer TE: protege al ADN de la degradacin.

5. Describa cual es el objeto de cada una de las siguientes etapas: Macerado del hongo: La maceracin es un proceso de extraccin slido-lquido. El producto slido posee una serie de compuestos solubles en el lquido extractante que son los que se pretende extraer. Adicin de buffer de extraccin: permite la disgregacin de la estructura tisular y celular, para facilitar la salida de los cidos nucleicos. Adicin de fenol/cloroformo: el fenol desnaturaliza las protenas y componentes celulares, y el cloroformo permite la separacin de fases durante la centrifugacin. Precipitacin con alcohol: permite la obtencin de un acido nucleico listo para ser almacenado o diluido en la concentracin deseada para su anlisis.

6. Explique otros mtodos de extraccin

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Jaimes Jaimes, Rangel Basto, Garcia Ochoa. El protocolo de extraccin mediante Fenol-cloroformo se describe a continuacin: 1. La capa de leucocitos obtenida de un volumen de 10 ml de sangre total, es sometida a lisis por adicin de 500 ul Tris-Cl 10 mM- EDTA 5mM pH: 8.0 FRIO. 2. La lisis celular es completada agregando 5 ml de buffer de lisis (LSN). Se mezcla suavemente por inversin. 3. A lo anterior se le adiciona 2.5 ml de Fenol, y se mezcla suavemente por inversin durante 5 min. 4. Agregar 2.5 ml de Cloroformo-Isoamlico 1:24. Mezclar por inversin 5 min. 5. Centrifugar a 3.000 rpm durante 10 min. 6. Obtener el sobrenadante ( DNA ) en un tubo a parte. Adicionar a este sobrenadante 2.5 ml de fenol + 2.5 ml de cloroformo y mezclar por inversin durante 5 min. 7. Centrifugar a 3.000 rpm por 10 min. 8. Repetir los pasos 6 y 7. 9. Hacer una ltima extraccin agregando 2.5 ml de Cloroformo al sobrenadante obtenido. Mezclar suavemente por inversin por 5 min. 10. Centrifugar 10 min a 3.000 rpm. 11. Obtener el sobrenadante y adicionarle 1/10 del volumen en NaCl 5M. 12. Adicionar 2 volumenes de etanol absoluto. EL DNA SE PRECIPITA EN LA INTERFASE. 13. Hilar con pipeta Pasteur estril (de vidrio) hasta asegurarse que se ha obtenido la totalidad del DNA. 14. Pasar por soluciones de etanol a 90%, 80% y 70% con el fin de retirar el exceso de sales. Dejar secar al aire libre. 15. Resuspender en 700 ul de Tris 10 mM- EDTA 1 mM pH: 8.0. 16. Incubar a 56C durante 1 hora, mezclando suavemente cada 10 min. Aqui el DNA se desenrrolla y homogeniza en solucin. El protocolo de extraccin mediante precipitacin por sales se describe a continuacin: Paso 1. Se aade solucin de lisis a la muestra. En este paso es necesario asegurar una lisis celular eficiente, por lo que si la muestra se observa homognea se puede continuar con el paso siguiente del protocolo; por el contrario, si se observa la presencia de cuerpos celulares en la solucin se recomienda una incubacin a 37C o 65C hasta una homogeneizacin completa de la muestra. En cualquier caso, las muestras son estables en solucin de lisis durante al menos 2 aos a temperatura ambiente, de modo que el proceso puede pararse en este paso, manteniendo las muestras en oscuridad, y continuar en das posteriores. Paso 2. Si se pretende obtener una muestra libre de ARN se procede a la adicin de RNAsa con una incubacin a 37C de entre 15- 45 min. Este paso no es necesario en muestras de sangre perifrica en las que la contaminacin por ARN es prcticamente indetectable. S que es aconsejable en otro tipo muestras como clulas, saliva o tejidos. No obstante, la cantidad de RNAsa a aadir es proporcional al tipo y cantidad de muestra de partida, recomendndose seguir las indicaciones del protocolo especfico correspondiente para cada tipo de muestra. Paso 3. Se aade una solucin salina que permite la precipitacin de las protenas citoplasmticas y nucleares de la muestra. Se procede a una agitacin vigorosa de la muestra (con vrtex) durante 20-30 segundos. A continuacin, se lleva a cabo una centrifugacin a la velocidad y tiempo necesarios para asegurar la precipitacin total de las protenas. Las protenas precipitadas se observarn en el fondo del tubo como un botn de color marrn. El sobrenadante debe observarse sin turbidez o presencia de partculas o trazas de color marrn; si no fuese as, debe procederse a una incubacin de la muestra durante 5 minutos en hielo repitiendo de nuevo la centrifugacin.
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Jaimes Jaimes, Rangel Basto, Garcia Ochoa. Paso 4. El sobrenadante que contiene el ADN en solucin se transfiere a un nuevo tubo con isopropanol. La muestra se mezcla con el isopropanol invirtiendo el tubo suavemente aproximadamente 50 veces. En este paso se puede observar la aparicin de la hebra de ADN. No obstante, la observacin de esta hebra va a depender de la cantidad de muestra de ADN procesada. Paso 5. Se procede a la centrifugacin de la muestra para precipitar el ADN en el fondo del tubo. El ADN se observar como un precipitado de color blanquecino. Paso 6. Con mucho cuidado, se elimina el sobrenadante por decantacin y el tubo con el precipitado de ADN se coloca invertido sobre una hoja limpia de papel absorbente para eliminar al mximo el remanente de isopropanol. Paso 7. Se aade Etanol al 70%, se tapa el tubo y se invierte con suavidad varias veces para lavar el precipitado de ADN. Paso. 8. La muestra se centrifuga y el etanol se elimina por decantacin o extraccin mediante punta de pipeta (con mucho cuidado puesto que el ADN puede despegarse del fondo del tubo). Debemos asegurarnos de que el precipitado de ADN sigue observndose en el fondo o en las paredes del tubo. Paso 9. El exceso de etanol se elimina mediante inversin del tubo sobre una hoja limpia de papel absorbente o dejando secar el tubo al aire durante unos minutos hasta que no se observen restos de etanol. No obstante, es importante evitar que el precipitado quede demasiado seco porque de este modo se dificulta su posterior resuspensin. Paso 10. Se procede a la hidratacin del ADN con una solucin tamponada adecuada, o bien con tampn TE (Tris HCl 10 mM, pH 8.0, EDTA 1 mM) o agua estril. Paso 11. Se recomienda realizar una incubacin durante aproximadamente 1 hora a 65C para facilitar la resuspensin del ADN. Tras esta incubacin, el ADN en solucin se deja agitando a temperatura ambiente hasta que se comprueba con punta de pipeta que el ADN se encuentra completamente resuspendido, sin presencia de grumos o restos viscosos en la solucin. Nota: las cantidades de las diferentes soluciones utilizadas en este protocolo pueden variar dependiendo del tipo y cantidad de muestra de partida. Dado que se utilizan diferentes kits basados en el mtodo de precipitacin por sales se recomienda seguir las instrucciones especficas de cada kit respecto a cantidades de reactivos, los tiempos de incubacin as como los tiempos y velocidades de centrifugacin indicados de forma especfica para cada tipo de muestra.

El protocolo de extraccin mediante chelex se describe a continuacin: 1. Coger de la nevera tubos de 1,5 mL con 300 L de 10% Chelex(5). Se coge 1 tubo por muestra. 2. Aadir 50 L de cultivo (o un poco de cultivo en agar) al tubo correspondiente. 3. Agitar en el vrtex durante 10-15 seg. 4. Incubar los tubos a 95C durante 30 min (con agitacin) 5. Agitar en el vrtex durante 10-15 seg (cuidado porque las tapas de los tubos de 1,5 mL se pueden abrir). 6. Centrifugar 5 min a alta velocidad (>10.000 rpm). 7. El ADN est en el sobrenadante. Pasar el sobrenadante para otro tubo de 1,5 mL (no coger el Chelex porque es inhibidor de la PCR).
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Jaimes Jaimes, Rangel Basto, Garcia Ochoa. 8. Purificar el sobrenadante. Nuestra experiencia con el Real Clean Spin kit (REAL, Durviz S.L.U., Valencia, Spain) ha dado resultados satisfactorios aunque puede servir otro mtodo o kit de purificacin. 9. Congelar a -20C. 10. Coger 1-2 L para la PCR SEPARACION DE ADN POR ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA 1. Qu funcin cumple el buffer de carga y que otros colorantes se utilizan como buffers de carga? Es un buffer contiene sucrosa o glicerol, lo cual da peso a la muestra para que el DNA se precipite al fondo de los pozos de siembra y los frentes de migracin o colorantes azul de bromofenol y cylenxyanol, permiten identificar el frente de corrido. Se usan marcadores de peso molecular para tener una referencia del tamao de los fragmentos por separar e identificar. Otros colorantes: naranja de acridina Verde de bromocresol azul brillante de coomassie (Para protenas) Fat red 7b Ponceaus

2. Que otras macromolculas se pueden separar por electroforesis en gel? Y que polmero se utiliza para cada una. Muchas macromolculas biolgicas importantes como los aminocidos, los pptidos, las protenas, los nucletidos, ya que poseen grupos ionizables y, a un pH determinado, existen en solucin como especies cargadas elctricamente, sean cationes (+) o aniones (-). Segn la naturaleza de la carga neta, las partculas cargadas migrarn hacia el ctodo o hacia el nodo. Proteinas: acrilamida Fluidos biolgicos: acetato de celulosa Aminocidos: geles de agarosa o almidn

3. Consulte los tipos de electroforesis que existen y sus aplicaciones

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Jaimes Jaimes, Rangel Basto, Garcia Ochoa. Electroforesis de frente mvil o libre Electroforesis de zona: Electroforesis en papel Electroforesis en gel

Existe una gran variedad de tipos de electroforesis en gel, que se pueden agrupar en dos categoras: a) Electroforesis en gel en una dimensin (continuo o discontinuo) Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) PAGE en condiciones desnaturalizante PAGE en condiciones no desnaturalizantes SDS PAGE Isoelectroenfoque Electroforesis en campos pulsantes b) Electroforesis en gel en dos dimensiones (bidimensional) Electroforesis capilar Electroforesis capilar de zona (CZE) Electroforesis capilar en gel (CGE) Isotacoforesis capilar (CITP) Isoelectroenfoque capilar (CIEF) Cromatografa electrocintica capilar micelar (MEKC) Ahora centraremos en las ms importantes: Electroforesis de frente mvil o libre Las sustancias a separar se introducen en un tubo en forma de U, disueltas en un tampn de pH y fuerza inica adecuados. Se colocan dos electrodos en sendos brazos del dispositivo, entre los que se crea un campo elctrico, provocando que las molculas de protena cargadas emigren hacia los electrodos de polaridad opuesta. Las diferentes protenas se desplazan a velocidades diferentes de acuerdo con sus cargas y coeficientes de friccin respectivos, formndose nubes (o frentes) que se desplazan en la disolucin tampn. Electroforesis de zona En esta tcnica, la muestra est obligada a desplazarse sobre un soporte slido de papel, celulosa o gel. La pequea cantidad necesaria de muestra permite que las molculas migren en discretas zonas o bandas. La electroforesis zonal de biomolculas cargadas, generalmente se lleva a cabo en una disolucin estabilizada con un medio que sirve de soporte. Electroforesis en papel La muestra se aplica sobre una tira de papel de filtro humedecido con una 2 disolucin tampn, bien en el centro o en cualquiera de los extremos del papel, dependiendo de las sustancias a separar y del pH del tampn. Los extremos de la tira se sumergen en dos recipientes separados que contienen la disolucin tampn y en los que se hallan colocados los electrodos.
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Jaimes Jaimes, Rangel Basto, Garcia Ochoa. Electroforesis en gel Un gel es un estado intermedio entre el slido y el lquido. Este tipo de electroforesis se halla entre los mtodos ms resolutivos y convenientes empleados en la separacin de macromolculas. Los geles de uso ms generalizado son: poliacrilamida y agarosa. stos poseen poros de diferentes dimensiones moleculares que delimitan la velocidad de traslado y molculas trasladadas durante el proceso electrofortico. De esta forma, la separacin no se produce slo por las diferentes cargas de las molculas, sino tambin por las diferencias de tamao. Los geles estn formados por un reticulado de polmeros (constituyendo una red enmaraada) y el lquido intersticial en el que se encuentrainmerso esta red. Existe una gran variedad de tipos de electroforesis en gel, que se pueden agrupar en dos categoras: Electroforesis en gel en una dimensin (continuo o discontinuo)

o PAGE-nativa o SDS-PAGE o Isoelectro enfoque Electroforesis en gel en dos dimesiones (bidimensional)

Segn las aplicaciones u objetivos que se pretendan conseguir en una prctica o experimento, se utilizar un tipo u otro de electroforesis en gel. Los geles discontinuos mejoran la resolucin de la electroforesis pues se consigue agudizar las bandas en gran medida por el uso de esta tcnica conocida como electroforesis a pH discontinuo que precisa de dos geles y dos tampones diferentes. La PAGE-nativa se utiliza para separar protenas en condiciones no desnaturalizantes, por tanto, en funcin de la carga intrnseca de las mismas. La SDS-PAGE es muy til para calcular el peso molecular de una protena concreta ya que separa las protenas segn su tamao. El isoelectroenfoque es un tipo de PAGE en una dimensin que se basa en la separacin de molculas de acuerdo a sus diferentes puntos isoelctricos. La electroforesis en gel en dos dimensiones combina el isoelectro enfoque (primera dimensin) con la SDS-PAGE (segunda dimensin). Es una tcnica muy resolutiva, y el mejor mtodo analtico para separar protenas que existe hoy en da. Electroforesis capilar Aunque la electroforesis en gel en sus diversas formas resulta un mtodo comn y efectivo para la separacin de molculas, el proceso de separacin puede durar varias horas, siendo difcil de cuantificar y automatizar. La tcnica aqu presentada se lleva a cabo en el interior de tubos capilares (110 m de dimetro). Estos capilares disipan el calor rpidamente permitiendo la aplicacin de campos elctricos elevados, reduciendo as los tiempos de separacin.

4. Qu tipo de marcadores moleculares existen y son de inters? Basados en protenas

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Jaimes Jaimes, Rangel Basto, Garcia Ochoa.

isoenzimas protenas de reserva

Basados en el ADN

RFLP (o Polimorfismo en la longitud de fragmentos de restriccin) AFLP (o Amplified fragment length polymorphism) RAPD (o Random amplification of polymorphic DNA) VNTR (o Nmero variable de repeticiones en tndem) Microsatlites, SSR o STR SNP (o Single nucleotide polymorphism) SFP (o Single feature polymorphism) TRAPs (o Polimorfismos para la amplificacin de regiones blanco)

5. El voltaje sugerido para la electroforesis en gel de agarosa es de 1 a 5 V/cm. Explique a que se refiere esa relacin. Voltaje aplicado. Con voltajes bajos, la velocidad de migracin de los fragmentos de ADN es proporcional al voltaje aplicado. Sin embargo, el intervalo efectivo de separacin disminuye al incrementarse el voltaje, por lo que no debe de aplicarse ms de 5 u 8 V/cm.

WEBGRAFA http://ciat.cgiar.org/wp-content/uploads/2013/04/guia_practica9.pdf http://farmupibi.blogspot.com/2011/12/obtencion-de-dna-genomico-de-hongos.html http://www.iqb.es/cbasicas/farma/farma04/l039.htm http://www.javeriana.edu.co/Genetica/PDFDOC/030315.pdf http://www.redbiobancos.es/pages/docs/Protocolos__extracci%C3%B3n_ADN.pdf http://bangen-pct.org/descargables/procedimientos_protocolos_geneticos.pdf

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